Detecção de Alterações Dinâmicas em Proteínas Eritrocitárias Baseadas em Imunomarcação
17 de março de 2023
A captação de mudanças dinâmicas na ativação proteica de hemácias enucleadas apresenta desafios metodológicos, como a preservação de alterações dinâmicas em estímulos agudos para posterior avaliação. O protocolo apresentado descreve técnicas de preparo e coloração de amostras que permitem a preservação e análise de alterações proteicas relevantes e posterior detecção.
Nosso método possibilita investigações subcelulares mecanísticas no campo da mecanobiologia em rápida evolução, fixando modificações proteicas temporárias no local e detectando-as com anticorpos específicos. Este método é tecnicamente fácil de aplicar. Os resultados são altamente válidos e reprodutíveis.
Além disso, em comparação com outras técnicas, nosso método poderia realmente ser usado efetivamente no campo emergente da sinalização pós-traducional de hemácias, que é dependente de modificações proteicas temporárias, especialmente mecanosinalização de hemácias. Para realizar a fixação da proteína eritrocitária, diluir o sangue total na proporção de um para dois em solução de paraformaldeído a 4% por 20 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a solução de sangue a 132 g durante três minutos à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante.
Ressuspender o pellet de hemácias em dois volumes de PBS 0,1 molar e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Novamente, centrifugar a amostra e remover o sobrenadante antes de ressuspender o pellet de hemácias em um volume de PBS 0,1 molar. Rotular uma lâmina de microscópio com o ID da amostra e o anticorpo aplicado usando uma caneta resistente ao álcool.
Adicione 10 microlitros da solução preparada de RBC. Coloque uma segunda lâmina sobre a amostra em um ângulo de 45 graus e disperse a amostra uniformemente ao longo da lâmina. Fixe a lâmina passando a amostra sobre o queimador de Bunsen com um movimento constante por cinco a sete segundos.
Para a coloração imunoistoquímica, marcar a área 2/3 da lâmina como teste e 1/3 como controle com lápis graxa. Em seguida, lave as áreas de amostra duas vezes aplicando TBS por 30 segundos. Após a segunda lavagem, adicione 0,1% de tripsina e cubra a lâmina usando uma câmara de incubação construída especificamente com uma tampa.
Incubar a amostra durante 30 minutos a 37 graus Celsius. Encha um copo com água da torneira e pare a reação enzimática adicionando a água da torneira do copo na lâmina. Despeje a solução e lave ambas as áreas três vezes com TBS.
Após a lavagem final, adicionar solução bloqueadora de peroxidase e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, despeje a solução e lave ambas as áreas três vezes com TBS. Em seguida, adicione 3% de solução de leite desnatado e incube por 30 minutos.
Após a incubação, despeje a solução e adicione a solução de anticorpos primários à área de teste. Adicione a solução de controle de anticorpos à área de controle. Incubar as amostras a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, despeje a solução de anticorpos e lave ambas as áreas três vezes com TBS. Em seguida, adicione solução de soro de cabra normal a 3% para evitar ligação inespecífica e incube por 30 minutos. Após a incubação, adicione uma solução de anticorpos secundários e incube por 30 minutos.
Despeje a solução de anticorpos e lave as áreas três vezes com TBS antes de prosseguir para o desenvolvimento da coloração. Em seguida, para realizar uma reação de peroxidase de rábano acoplada à avidina, adicione solução diluída de peroxidase de avidina e incube por 30 minutos. Coloque a lâmina sob um microscópio com aumento de 200 vezes e adicione a solução DAB recém-preparada em ambas as áreas.
Monitore a coloração das hemácias continuamente e pare a coloração removendo a solução DAB com uma pipeta descartável antes que o fundo comece a colorir. Para realizar a desidratação da amostra, coloque a lâmina em uma grade de vidro e mergulhe por cinco segundos cada em concentrações crescentes de etanol e, finalmente, em xilol. Após a desidratação, coloque a lâmina sobre papel higiênico com as hemácias na parte superior para absorver o excesso de líquido.
Adicione duas ou três gotas de meio de montagem em uma folha de tampa e cubra a corrediça usando a folha de tampa. Para visualização e obtenção de imagens, coloque a lâmina em um microscópio de luz transmitida acoplado a uma câmera. Ligue a fonte de luz e a câmera e inicie o software.
No Modo Campo Brilhante, concentre as hemácias girando os botões de ajuste de foco grosso e fino. Da mesma forma, concentre as hemácias no Modo Fluorescente. Para analisar o valor de cinza RBC, marque a borda de cada RBC usando a Oval Selection Tool dentro do software ImageJ.
Usando o comando Measure, meça os valores de cinza de 50 RBCs do teste e 10 RBCs do controle. Para a coloração por imunofluorescência das proteínas eritrocitárias, incubar a amostra com um anticorpo secundário fluorescentemente conjugado por 30 minutos à temperatura ambiente, protegendo-a da luz. Após a incubação, despeje a solução de anticorpos e lave a lâmina três vezes com TBS.
Deixe o TBS na amostra após a lavagem final. Desidratar a amostra e preparar a lâmina com uma lamínula para avaliação microscópica conforme demonstrado. Ligue o microscópio e a fonte de luz fluorescente e concentre as hemácias em um modo de campo brilhante.
Capture imagens fluorescentes e de campo claro em pelo menos três áreas distintas da área de teste da lâmina selecionada aleatoriamente. Defina o tempo de exposição para um segundo para imagens fluorescentes e capture uma imagem. Em seguida, alterne para o Modo de Campo Brilhante, defina o tempo de exposição como Automático e capture a imagem de campo brilhante correspondente.
Salve as imagens no formato TIFF. Capture imagens fluorescentes e de campo brilhante em pelo menos duas áreas distintas selecionadas aleatoriamente da área de controle da lâmina. Salve as imagens no formato TIFF para preservar os valores de cinza originais dos pixels, impedir a compactação e transportar metadados da aquisição.
Para medir os valores de cinza das hemácias capturadas, abra o ImageJ. Marque cada célula com a Ferramenta de Seleção Oval e analise usando o comando Medir. Realce entre três e cinco áreas livres de hemácias e determine os valores de cinza para medir o sinal de fundo.
Para executar a análise de dados alternativos de imagens capturadas, crie um comando de macro por meio da versão Fiji do ImageJ para seleção automatizada, correção de plano de fundo e análise de valor de cinza de uma determinada imagem. Abra a imagem em formato TIFF para análise em Fiji. Em seguida, abra a fluorescência RBC.
ijm macro e clique em Executar. O sinal de anticorpos direcionados contra a eritrocitária óxido nítrico sintase, ou NOS, fosforilado no resíduo de serina 1177 em repouso e em resposta à exposição à força mecânica foi avaliado por imunohistoquímica e imunofluorescência. Um aumento de três vezes no sinal de anticorpos direcionados contra eritrócitos-NOS fosforilados no resíduo de serina 1177 foi detectado em resposta à exposição à força mecânica das hemácias em comparação com as respectivas células não cisalhadas, quando avaliadas pelo método imunohistoquímico ou imunofluorescência.
O usuário precisa se certificar de que o anticorpo é aplicado apenas na área de teste. Caso contrário, a amostra não poderá ser analisada, devido à falta de um controle. Dada a disponibilidade de uma ampla variedade de anticorpos, o direcionamento de muitas proteínas diferentes e processos de sinalização é possível usando este método.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para capturar alterações dinâmicas na ativação de proteínas em eritrócitos anucleados, abordando os desafios de preservar essas alterações para análise. O protocolo permite investigações mecanicistas na mecanossinalização de eritrócitos por meio de fixação eficaz e detecção de modificações temporárias em proteínas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Mecanobiologia
- Sinalização em hemácias
- Modificações de proteínas
Contexto
- Investigar a ativação de proteínas em glóbulos vermelhos é fundamental para compreender a mecanossinalização.
- Modificações temporárias de proteínas desempenham um papel importante nas respostas celulares.
- Os métodos existentes enfrentam desafios na preservação de alterações dinâmicas durante a análise.
- Este estudo apresenta um protocolo confiável para fixação e detecção de proteínas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para fixar modificações temporárias de proteínas em hemácias.
- Permitir a análise reprodutível da ativação de proteínas em resposta a estímulos.
- Avançar a pesquisa em modificações pós-traducionais e sinalização mecanotransdutiva.
Métodos Utilizados
- Diluição de sangue total em paraformaldeído a 4% para fixação.
- Centrifugação para separar os componentes celulares.
- Técnicas de coloração para detecção específica de proteínas.
- Aplicação de anticorpos específicos para análise.
Resultados Principais
- O método é fácil de aplicar e produz resultados válidos e reprodutíveis.
- Eficiente na captura de modificações proteicas temporárias em eritrócitos.
- Facilita investigações no campo emergente da mecanossinalização em eritrócitos.
- Demonstra vantagens em relação às técnicas existentes na preservação de alterações dinâmicas.
Conclusões
- O protocolo apresentado aprimora significativamente o estudo da dinâmica proteica em hemácias.
- Abre novas perspectivas para pesquisas em mecanobiologia e sinalização celular.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para obter insights mais profundos sobre a função das hemácias.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção baseada em imunomarcação de alterações dinâmicas em proteínas de hemácias (RBC) permite a investigação mecanicista de modificações proteicas transitórias essenciais para pesquisas em mecanobiologia e sinalização pós-traducional. Essa capacidade apóia a validação precoce de alvos e a redução de riscos em fluxos de descoberta, nos quais estados agudos de ativação proteica orientam hipóteses terapêuticas. A reprodutibilidade do método e suas saídas semi-quantitativas facilitam a triagem robusta de portfólios e a comparabilidade entre programas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a detecção de estados agudos de ativação proteica relevantes para mecanotransdução e vias de sinalização.
- Apóia a validação funcional de alvos ao capturar modificações pós-traducionais transitórias em hemácias.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao distinguir respostas proteicas específicas a estímulos experimentais.
- Fornece dados semi-quantitativos para decisões orientadas por hipóteses no avanço de portfólios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara amostras validadas de hemácias para triagem subsequente de ativação ou inibição de proteínas.
- Padroniza fluxos de trabalho baseados em anticorpos para resultados reprodutíveis e comparáveis.
- Permite leituras quantitativas baseadas em imagens, adequadas para o desenvolvimento e otimização de ensaios.
- Permite escalabilidade por meio da adaptabilidade do protocolo a diferentes alvos de anticorpos e modalidades de detecção.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a estudos mecanicistas relevantes para doenças ao permitir a detecção de alterações proteicas em resposta a estímulos fisiológicos ou patológicos.
- Oferece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, apoiando a identificação de biomarcadores em hemácias.
- Reduz o risco de translação ao garantir que as modificações proteicas observadas sejam robustas e reprodutíveis em diferentes condições.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de imunomarcação integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir estudos mecanicistas precoces, desenvolvimento de ensaios e exploração translacional de biomarcadores em sistemas de hemácias.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao detectar eventos específicos de ativação proteica.
- Triagem: Fornece resultados reprodutíveis e semi-quantitativos para avaliação de compostos ou condições.
- Análises: Oferece medições baseadas em valores de cinza de imagens e correção de fundo para comparação estatística robusta.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores ao capturar modificações proteicas relevantes para doenças ou tratamentos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma flexível adaptável a diversos alvos de anticorpos e questões mecanicistas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de validação de alvos e mecanismos ao preservar estados proteicos transitórios.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras e a detecção para garantir reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir ao fornecer dados robustos e semi-quantitativos sobre a ativação de proteínas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao esclarecer mecanismos biológicos e reduzir incertezas em estágios avançados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na seleção de anticorpos, preparação de amostras e obtenção de imagens baseada em microscopia.
- Necessita de acesso a microscopia óptica e de fluorescência, bem como a softwares de análise de imagens, como ImageJ ou Fiji.
- Exige colorações de controle rigorosas para levar em conta a ligação não específica de anticorpos e sinais de fundo.
- Adaptável a diversos alvos proteicos em hemácias e vias de sinalização, mediante validação adequada dos anticorpos.
- Limitado à análise semi-quantitativa; a quantificação absoluta pode exigir métodos complementares.
