Name: Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprenda o método Z-REX para analisar sinalização de pequenas moléculas reativas em larvas de peixe-zebra. Esta técnica permite mapear interações ligante-alvo com precisão espaciotemporal, revelando mecanismos relevantes para o desenvolvimento de terapias direcionadas contra câncer.

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Financiamento: Novartis FreeNovation, NCCR e EPFL.

<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
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<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

Inibidores de pequenas moléculas quinases específicos para isoformas, cuja descoberta foi possibilitada pelas tecnologias REX, foram depositados para pedido de patente

Z-REX descrito neste protocolo demonstra uma estratégia robusta para investigação de pares eletrófilos-alvo e deconvolução de vias de sinalização em peixes vivos. A entrega direcionada à proximidade permite a dosagem e o controle espacial do tratamento com compostos eletrofílicos. Ao contrário dos métodos convencionais de dosagem em bolus, nos quais as concentrações suprafisiológicas de eletrófilos implantados muitas vezes levam a problemas fora do alvo, a quantidade relativamente pequena de eletrófilo liberada para o sistema torna o Z-REX amplamente não invasivo. Utilizamos 0,1-6 μM de Ht-PreHNE (alquino) em embriões de zebrafish, e os resultados mostraram que o tratamento não é prejudicial ao desenvolvimento embrionário11.
O procedimento Z-REX é geralmente mais longo do que o T-REX, uma técnica para triagem/estudo de proteínas sensíveis a eletrófilos em células cultivadas. Suponha que o propósito do experimento seja rastrear interações eletrophile-target; sugerimos primeiramente realizar uma triagem extensiva por T-REX em células cultivadas e usar Z-REX para validação in vivo e análise fenotípica/via. Em comparação com a cultura celular, os requisitos para a realização do Z-REX são técnicas básicas de criação de peixes, além das habilidades experimentais bioquímicas exigidas pelo T-REX. Um período de tempo típico para Z-REX (do cruzamento de peixes à entrega de eletrófilos induzíveis por luz) é de 2-3 dias, que não é mais do que 1 dia a mais do que o tempo típico para um experimento de T-REX em células vivas transfectadas. Imagens ao vivo para análise fenotípica podem ser realizadas 2-10 h após a iluminação da luz; o acoplamento de clique com biotina-azida para ensaio pull-down leva 3 dias; qRT-PCR para dosagem de resposta transcricional leva 3 dias; A coloração IF leva 5 dias. Essas etapas são aproximadamente semelhantes aos seus equivalentes de cultura celular, embora a interpretação dos dados exija uma compreensão da fisiologia dos peixes e das cepas repórteres.
Como procedimento de múltiplas variáveis12, vários grupos de controle são necessários para que o Z-REX exclua incertezas nos resultados (Figura 1D). Os grupos de controle comuns são: (1) DMSO/tratamento do veículo apenas; (2) tratamento com sonda, mas sem iluminação luminosa; (3) iluminação luminosa, mas sem tratamento com sonda; (4) construção P2A-split, na qual Halo e o POI são expressos separadamente, de modo que a entrega de proximidade é ablida; e (5) mutantes hipomórficos, cujos resíduos sensíveis a eletrófilos são/são mutados, como Akt3 (C119S)6 e Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, que já utilizamos em estudos anteriores.
Se os ensaios a jusante envolverem análise de western blot, a desidratação deve ser realizada antes da colheita. As proteínas da gema reduzem a fidelidade das avaliações da concentração de lisado e podem ligar-se não especificamente aos anticorpos. Ao realizar imagens de peixes vivos ou coloração de FI de montagem inteira, também observamos sinais fluorescentes inespecíficos no saco vitelino, provavelmente resultantes de proteínas autofluorescentes no saco vitelino, ou ligação inespecífica dos próprios anticorpos. Se o sinal de autofluorescência interferir com o sinal, sugerimos excluir o saco vitelínico da quantificação, ou quantificar diferentes regiões separadamente. A descorinação é necessária para imagens de peixes vivos e ensaio de coloração de FI de montagem inteira. O córion pode interferir na imagem e, posteriormente, na quantificação/contagem celular. No entanto, a descorinação só é aplicável a embriões com mais de 1 dpf; embriões mais jovens nos estágios de blastulação/gastrulação/segmentação são frágeis demais para serem descorionados.
O protocolo Z-REX descrito aqui é baseado na expressão de POI ectópica impulsionada por mRNA. O procedimento é rápido em comparação com o uso/geração de linhas de peixes transgênicos. A expressão impulsionada por mRNA é ubíqua e transitória, e dura pelo menos 2 dias para mRNAs usados neste protocolo. No entanto, é provável que a duração da expressão varie em outros casos. Assim, essa abordagem fornece uma janela investigativa rápida e mais global sobre os efeitos de um evento específico de marcação de eletrófilos, compatível com vários ensaios de alto rendimento/alto conteúdo. Linhagens transgênicas com expressão estável de Halo-POI em tecidos específicos também são compatíveis com Z-REX11. Tais linhas são melhor usadas quando uma pergunta mais precisa precisa ser feita, por exemplo, quando um fenótipo em um órgão específico é previsto a partir de dados de cultura celular, ou quando a triagem de experimentos de injeção de RNAm prevê que um órgão específico é sensível a um evento de marcação de letrófilos. Uma indução de resposta antioxidante cardíaca específica através de Z-REX foi demonstrada usando peixes Tg(gstp1:GFP;DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1) em nossa publicação anterior11. Também pode ser possível realizar Z-REX em peixes transgênicos com mais de 2 dpf.

Uma miríade de eventos de sinalização celular envolve reações entre pequenas moléculas reativas (produzidas endogenamente na célula ou xenobióticos/xenometabolitas, como drogas) e seu alvo proteico. Em muitos casos, um nível subestequiométrico desses eventos de ligação covalente pode desencadear respostas celulares, levando a alterações no desenvolvimento, metabolismo, apoptose e/ou resposta imune, por exemplo1. No entanto, a desconstrução do modo de ação (MOA) ligando eventos de ligação específicos às suas consequências fenotípicas tem se mostrado desafiadora. Métodos tradicionais de dosagem em bolus que envolvem a introdução de altas concentrações das espécies reativas frequentemente resultam em uma infinidade de proteínas sendo modificadas, bem como toxicidade excessiva para o organismo modelo2. Tais condições estão longe de ser as ideais. Um método foi desenvolvido para resolver esses problemas em cultura celular usando liberação de eletrófilos localizados de precisão em um contexto celular nativo, denominado T-REX (targetable reactive electrophiles and oxidants)3. Nos anos seguintes, o foco voltou-se para experimentos em organismos inteiros, que permitem a oportunidade de estudar proteínas em contextos celulares específicos em células não transformadas. Assim, ampliamos a técnica para ser compatível com vários modelos, incluindo modelos embrionários de Danio rerio . Neste trabalho, apresentamos o Z-REX (zebrafish visando eletrófilos reativos e oxidantes) (Figura 1).
Para entender o Z-REX, este artigo primeiro apresenta as tecnologias REX e seus conceitos subjacentes. Em sua essência, essas técnicas modelam a sinalização de espécies eletrofílicas reativas fisiológicas endógenas (RES) mimetizando como os eletrófilos naturais são produzidos localmente in vivo com precisão espaço-temporal. A proteína de interesse (POI) é expressa como um construto de fusão para Halo; este último ancora a sonda inerte e permeável ao tecido com o ER fotoengaiolado em uma estequiometria 1:1. Um desses RES endógenos é o 4-hidroxinonenal (HNE doravante), que é fotocageado na sonda Ht-PreHNE. Em muitos casos, usamos uma versão funcionalizada com alquina do HNE [i.e., HNE(alquino)], que tem propriedades biológicas essencialmente idênticas à HNE, mas pode ser rotulada pela química do clique. A sonda, que também é funcionalizada com um cloroalcano para reatividade com Halo, é referida como Ht-PreHNE (alquino). O complexo da fusão Halo-POI e a sonda assim formada permite a entrega proximal de RES ao POI fundido após irradiação com luz UV. Se o POI reage rapidamente com o RES, a marcação covalente resultante do POI com o ER permite identificar cisteínas cineticamente privilegiadas.
Z-REX pega as vantagens acima mencionadas das tecnologias REX e as aplica amplamente para estudar vias de sinalização específicas em peixes vivos. Este protocolo foi otimizado para zebrafish (D. rerio), uma vez que são organismos vertebrados geneticamente tratáveis que são transparentes durante o desenvolvimento e, portanto, ideais para técnicas optoquímicas/genéticas como as tecnologias REX. No entanto, uma estratégia semelhante também provavelmente funcionará bem em outras espécies de peixes geneticamente tratáveis, uma vez que a ampla aplicabilidade do método é devida ao mecanismo pseudo-intramolecular de liberação de eletrófilos derivados de lipídios (LDE). De fato, o procedimento é altamente biocompatível, uma vez que os peixes podem ser tratados com o Z-REX fotocaged-electrophile [por exemplo, Ht-PreHNE(alkyne)] por pelo menos 48 h sem impactos perceptíveis no desenvolvimento. Protocolo semelhante funciona em C. elegans 4,5.
O protocolo descreve primeiramente o uso de injeção de RNAm para produzir uma expressão transitória de uma construção de fusão Halo-POI não nativa em modelos embrionários de zebrafish, 1-1,5 dias pós-fertilização (dpf). Isto resulta na expressão da proteína ectópica na maioria das células do peixe (doravante designada por «ubíqua»), e não em tecidos ou locais específicos; no entanto, os dados mostram que efeitos específicos de células podem ser observados em certos casos. Após a injeção, os embriões são incubados com uma baixa concentração [0,3-5 μM Ht-PreHNE(alquina)] da sonda por até 30,5 h pós-fertilização (hpf). Então, em um tempo prescrito pelo usuário, a entrega do RES ao POI dentro dos peixes é alcançada por fotouncaging por 2-5 min. Após a fotouncaging do RES, uma variedade de ensaios fenotípicos a jusante pode ser realizada nas próximas 2-10 h: 1) imagens ao vivo das linhas do repórter (Figura 2A); 2) avaliação da marcação de alvos por análise de western blot (Figura 3); 3) análise transcriptômica (Figura 4); ou 4) imunofluorescência total (Figura 5).
Como um exemplo de imagem ao vivo de linhas de repórteres, Z-REX é demonstrado em conjunto com imagens ao vivo de linhagens de peixes, Tg(lyz:TagRFP) e Tg(mpeg1:eGFP), para medir como a modificação de RES de um sensor eletrófilo específico POI (ou seja, Keap1) diminui os níveis de neutrófilos e macrófagos, respectivamente, sem efeitos observáveis em outras células nos peixes. No entanto, mostramos anteriormente que a marcação de POI e a consequente sinalização da via de estudos de T-REX podem ser reproduzidas usando Z-REX para várias proteínas: Akt3 6, Keap17 e Ube2v26. Em geral, com o Z-REX, os cientistas podem estudar a(s) consequência(s) da modificação covalente de POIs por RES no contexto de várias vias redox complexas. Esta técnica é preparada para identificar alvos e seus resíduos funcionais para o planejamento covalente de fármacos e novos mecanismos de fármacos em um modelo animal inteiro mais contextualmente relevante.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 10 cm</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acrilamida e bisacrilamida a 30%</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>All Blue Préined Protein Standards</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-dPEG11-azida</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Dye</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, Inibidor de Protease sem EDTA Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-rato-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Burro anti-rato-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Substrato ECL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Substrato ECL-Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de ponta a ponta</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>E / 0650DF / 15</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Extrator</td> <td>de micropipeta flamejante / marromSutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio de fluorescência</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps (romba)</td> <td>auto-feito</td><td></td><td>por pinça afiada embotada (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)</td></tr><tr><td>Fórceps (sharp)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5, 11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de carregamento de gel</td><td>Fisher</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Gel/blot imager</td><td>Vilber</td><td>Fusion FX imager</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>Micrômetro de palco de vidro</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr> Banho <tr><td>ultrassônico aquecido</td><td>FBS</td> Sigma F2442 <td></td> inativado por calor VWR 89375-470 <td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina agarose de alta capacidade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Ht-PreHNE sonda de alcino auto-fabricada-<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Parvez, S. et al. Direcionamento redox sob demanda T-REX em células vivas. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Placa de imagem (10% de tampão HBSS, para embriões vivos)</td><td></td><td></td><td>Feita com placa de Petri e 2% de agarose em 10% de tampão HBSS</td></tr><tr><td>Placa de imagem (PBS, para embriões fixados em formaldeído)</td><td></td><td></td><td>Feita com placa de Petri e 2% de agarose em</td></tr><tr><td>PBS Placa</td><td></td><td></td> de injeção <td>Feita com molde de microinjeção, placa de Petri e 2% de agarose em 10% de tampão HBSS</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo</td><td>APOBI3331</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>Molde de microinjeção</td><td>Ferramentas de ciência adaptável</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Dicas de microcarregador</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio para microinjeção</td><td>Microscópio</td><td>Olympus SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Kit de transcrição</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti- &beta;-actina-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr><tr><td>Mouse anti-HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr><tr><td>Leitor multimodo</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese em gel de agarose de ácido nucleico</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Systems</td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT) 20</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>personalizadas: (dT) 20</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2 + 8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&nbsp;</td><td>auto-clonado-Disponível</td><td></td> <td>do grupo do Prof. Yimon AYE na EPFL</td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA</td><td>auto-clonado-Disponível</td><td></td> <td>do grupo do Prof. Yimon AYE na EPFL</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento e suprimentos de eletroforese de proteínas</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electroforese</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-ativo Caspase-3</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Inibidor de</td><td></td></tr> <tr><td>ribonuclease recombinante</td><td></td> Eppendorf 5417R <td></td> RNAseOUT ThermoFisher Scientific 10777019 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> RnaseZap Solução de descontaminação de RNA <td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Shaker</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td><td>S9974</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III transcriptase reversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>t-Butanol</td><td>Sigma</td><td>471712</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>TeV protease (S219V)</td> <td>auto-made-Parvez</td><td></td><td>, S. et al. Direcionamento redox sob demanda T-REX em células vivas. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Tg(lyz:TagRFP)</td><td>Centro Internacional de Recursos de Peixe-Zebra (ZIRC)</td><td>uwm11Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1:eGFP)</td><td>Centro Internacional de Recursos de Peixe-Zebra (ZIRC)</td><td>gl22Tg (ZFIN)</td><td>-</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Analytik Jana</td><td>846-x-070-280</td><td></td></tr><tr><td>TMEDA</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Fisher</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Apollo</td><td>APOBI2888</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina de Glycine max (soja)</td> <td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada UV com luz de 365 nm</td><td>Spectroline</td><td>ENF 240C</td><td></td></tr><tr><td>Medidor UV&nbsp;</td><td>Spectroline</td><td>XS-365</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Indústrias Científicas, Inc.</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Western Blotting Equipamento e suprimentos de transferência</td><td>Biorad</td><td>Mini Trans-Blot ou Criterion Blotter&nbsp;</td><td></td></tr><tr>Equipamento <td></td><td></td> de <td>criação e criação de peixes-zebra</td><td>em</td></tr><tr><td>grânulos de zircônia</td><td>BioSpec</td><td>11079107zx</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - z-rex desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Metabólitos reativos e drogas eletrofílicas relacionadas estão entre as pequenas moléculas mais desafiadoras para estudar. Abordagens convencionais para desconstruir o modo de ação (MOA) de tais moléculas alavancam o tratamento em massa de espécimes experimentais com um excesso de uma espécie reativa específica. Nessa abordagem, a alta reatividade dos eletrófilos torna a marcação não discriminada do proteoma de maneira dependente do tempo e do contexto; Proteínas e processos sensíveis à redox também podem ser afetados indiretamente e muitas vezes de forma irreversível. Em um cenário de inúmeros alvos potenciais e efeitos secundários indiretos, vincular o fenótipo ao engajamento de alvos específicos continua sendo uma tarefa complexa. Zebrafish visando eletrófilos reativos e oxidantes (Z-REX) - uma plataforma de entrega de eletrófilos reativos sob demanda adaptada para uso em larvas de peixes-zebra - é projetado para fornecer eletrófilos a uma proteína específica de interesse (POI) em embriões de peixes vivos não perturbados. As principais características desta técnica incluem um baixo nível de invasividade, juntamente com a dosagem - quimiotipo - e liberação eletrofílica de precisão controlada espaço-temporalmente. Assim, em conjunto com um conjunto único de controles, essa técnica evita efeitos fora do alvo e toxicidade sistêmica, observados após exposição descontrolada em massa de animais a eletrófilos reativos e drogas eletrofílicas pleiotrópicas. Aproveitando o Z-REX, os pesquisadores podem estabelecer um ponto de apoio na compreensão de como as respostas individuais ao estresse e as saídas de sinalização são alteradas como resultado do envolvimento específico do ligante reativo com um POI específico, sob condições quase fisiológicas em animais vivos intactos.

Imagem ao vivo de peixes repórteres transgênicos de neutrófilos/macrófagos tratados com Z-REX, Tg(lyz:TagRFP) e Tg(mpeg1:EGFP). Indução de apoptose de neutrófilos/macrófagos através da HNEylation Keap1. (Veja também a Figura 2). O efeito da marcação eletrofílica de Keap1 sobre os níveis de neutrófilos e macrófagos foi avaliado injetando-se embriões transgênicos heterozigotos derivados de Tg(lyz:TagRFP) ou Tg(mpeg1:EGFP) com RNAm codificando Halo-Keap1 e, em seguida, tratando com Ht-PreHNE(alquino). Após os procedimentos para o ensaio passo 6.1-downstream, a opção 1-HNE (alquino) foi liberada e Keap1 foi rotulado. Os níveis de neutrófilos e macrófagos foram avaliados por imagens ao vivo das linhas repórteres, Tg(lyz:TagRFP) e Tg(mpeg1:eGFP), respectivamente. O nível de ambos os tipos celulares diminuiu em 30%-40% após o tratamento com Z-REX, no qual HNE foi entregue a Keap1. Ao contrário, nenhuma perda de neutrófilos ou macrófagos foi observada nos grupos controle técnico Z-REX [sem luz e Ht-PreHNE(alquino), luz isoladamente, ou Ht-PreHNE(alquino) isoladamente] (Figura 1D e Figura 2A-D).
A indução de apoptose de neutrófilos/macrófagos indicou sucesso na liberação de HNE para Keap1 através do Z-REX. Detalhes para a análise da via e mecanismo de apoptose foram publicados5. Para explicar os efeitos fora do alvo de HNE (alquino), vários controles foram usados. (1) Sob as mesmas condições experimentais, em vez de halo-TeV-Keap1 mRNA, embriões foram injetados com halo-P2A-Keap1 mRNA. O ligante P2A permitiu que as proteínas Halo e Keap1 fossem expressas de forma independente. Nesse cenário, HNE(alquino) liberado do Halo não poderia rotular Keap1, pois não era mais proximal ao Halo (Figura 1D); portanto, a via de sinalização da apoptose não foi desencadeada. Não foram observadas alterações nos níveis de macrófagos e neutrófilos neste grupo (Figura 2A,B). (2) As mesmas condições experimentais foram realizadas utilizando RNAm que codifica Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E), um mutante de Keap1 que não responde ao HNE(alquino) (Figura 1D). Não foram observadas alterações nos níveis de macrófagos ou neutrófilos (Figura 2G,H).
Acoplamento azida-clique de biotina e ensaio pull-down de biotina. Avaliação de rotulagem de alvos. (Veja também a Figura 3). A avaliação da marcação de alvos foi realizada usando embriões WT, injetados com RNAm codificando Halo-TeV-Keap1-2xHA (construção de fusão Halo-POI) ou Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (construção P2A-split, na qual Halo e Keap1 não são fundidos; Figura 1D). A proteína Keap1 marcada só foi puxada para baixo no grupo que expressa a proteína de fusão e tratada com Z-REX (segunda faixa no blot anti-HA superior), mas não em outros grupos de controle (sem injeção de mRNA, construção de fusão sem Z-REX ou construção de divisão P2A). Os resultados indicam que o HNE (alquino) foi entregue com sucesso a Keap1, e o Keap1 modificado foi subsequentemente conjugado com biotina através da reação de clique, e o Keap1 marcado com biotina foi puxado para baixo pela resina estreptavidina.
Análise transcricional. RNA-seq e qRT-PCR. (Veja também a Figura 4). A alteração transcricional após o tratamento com Z-REX foi avaliada por RNA-seq e qRT-PCR. No RNA-seq, vários genes relacionados à imunidade foram regulados negativamente após o Z-REX. Em contraste, muitos genes relacionados à resposta antioxidante (AR) foram upregulated após Z-REX, o que resultou da indução da via Keap1-Nrf2-AR na HNEylation em Keap110 (Figura 4A). Na análise por qRT-PCR, resultados semelhantes foram encontrados ao analisar três genes relacionados à imunidade (lyz, mpeg1.1 e coro1a) (Figura 4B). A up- e down-regulation dos respectivos genes mostrou o sucesso da indução de vias mediadas por Keap1 HNEylation.
Ensaio de coloração de (co)imunofluorescência de montagem total e análise de colocalização. (Veja também a Figura 5). A expressão exógena de Halo-TeV-Keap1-2xHA e Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA foi avaliada pela coloração de imunofluorescência total (IF) (Figura 5A,B). O P2A-split-construct apresentou duas vezes o número de tags HA do que o TeV-fusion-construct, o que corresponde a um sinal anti-HA duas vezes maior no grupo P2A-split-construct-mRNA-injectado do que o outro, indicando que o nível de expressão dos dois construtos foi semelhante (Figura 5C). Os níveis de expressão do Halo-TeV-Keap1 (wt) e Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E) também foram encontrados semelhantes quando sondados com anti-Halo (Figura 5D,E). A colocalização de neutrófilos e caspase 3 ativa em Tg (lyz:TagRFP) tratada com Z-REX foi observada por co-imunomarcação com anti-RFP e anti-Caspase 3 ativa (Figura 5F). A Caspase Ativa 3 é um indicador de eventos de apoptose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho do Z-REX. (A,B) Um embrião de peixe-zebra em estágio celular 1-4 é injetado com (morfolino e) RNAm que codifica Halo-POI (por exemplo, Halo-Keap1). Os embriões injetados são então tratados com uma sonda composta por um ligante HaloTag e um eletrófilo fotocagelado anexado com um grupo funcional alquino, como Ht-PreHNE (alquino) em B. Depois de remover a quantidade excessiva de sonda, o embrião é exposto à luz para liberar o eletrófilo de interesse [por exemplo, HNE ou seu análogo, HNE (alquino)]. A análise a jusante é realizada em um determinado momento/definido pelo usuário. (C) Projeto e mecanismo da sonda Ht-PreLDE, que é aplicável a diferentes eletrófilos derivados de lipídios (LDE). (D) Grupos de controle negativo/técnico para Z-REX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg"> Figura 2: Imagem ao vivo de peixes repórteres neutrófilos/macrófagos transgênicos submetidos ao Z-REX. Keap1 HNEylation mediada por Z-REX-induz apoptose de neutrófilos/macrófagos. (A) Imagens representativas de peixes Tg(lyz:TagRFP ) expressando Halo-TeV-Keap1 (construção de fusão) ou Halo-P2A-Keap1 (construção dividida), e submetidos a condições de controle negativo [sem tratamento, luz isoladamente, ou Ht-PreHNE(alquino) sozinho ou Z-REX]. Idade do embrião: 36 hpf. (B) Quantificação dos níveis de neutrófilos em A. (C) Imagens representativas de peixes Tg(mpeg1:eGFP) expressando Halo-TeV-Keap1 com ou sem tratamento Z-REX. Idade do embrião: 34 hpf. (D) Quantificação dos níveis de macrófagos em C. (E,F) Medição ao longo do tempo dos níveis de (E) neutrófilos e (F) macrófagos após o tratamento com Z-REX. (G) Experimento semelhante ao de A em peixes que expressam Halo-TeV-Keap1 (WT) ou Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), um mutante que não tem capacidade de detecção de HNE. (H) Quantificação dos níveis de neutrófilos em G. Barras de escala: 500 μm. Todos os gráficos são apresentados com média ± EPM. Os valores de p foram calculados com ANOVA one-way (azul) e teste t de Student bicaudal (preto). Esse valor foi modificado a partir de Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg"> Figura 3: Ensaio pull-down de biotina. Embriões WT expressando Halo-TeV-Keap1-2XHA ou Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA foram tratados com Z-REX ou respectivas condições de controle negativo (nenhum tratamento com sonda neste caso). Após a colheita, os embriões foram lisados e tratados com protease TeV antes do ensaio de puxamento da biotina. Os resultados foram analisados por western blotting. Este valor foi modificado de Huang et al. Z-REX: conduzindo eletrófilos reativos a proteínas específicas expressas de forma específica ou ubíqua do tecido, e registrando as respostas redox induzidas por eletrófilos funcionais resultantes em larvas de peixes. Este valor foi modificado de Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg"> Figura 4: Análise transcricional. (A) Resultados RNA-seq de embriões tratados com Z-REX versus não tratados. Genes diferencialmente expressos estatisticamente significativos (SDE) são destacados. Os genes SDE relacionados à imunidade são coloridos de vermelho. Os genes relacionados à resposta antioxidante (RA) são coloridos de verde. Outros genes SDE são coloridos de azul. Todos os valores de p foram calculados com CuffDiff. (B-D) Três genes SDE relacionados à imunidade de A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 e (D) coro1a foram analisados com qRT-PCR, e apenas os embriões tratados com Z-REX mostraram a supressão desses transcritos. Todos os gráficos são apresentados com média ± EPM. Os valores de p foram calculados com ANOVA one-way (azul) e teste t de Student bicaudal (preto). Esse valor foi modificado a partir de Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg"> Figura 5: Ensaio de imunofluorescência total . (A,B) Imagens representativas de embriões expressando (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA ou (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA imunomarcados com anti-HA e anticorpo secundário conjugado com AlexaFluor568. Peixes injetados com mRNA foram comparados com peixes não injetados pareados por idade. (C) Quantificação do sinal anti-AH em (A,B). (D) Imagens representativas de embriões expressando Halo-TeV-Keap1 (WT) ou Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) imunomarcados com anti-Halo e anticorpo secundário conjugado com AlexaFluor647. Peixes injetados com mRNA foram comparados com peixes não injetados pareados por idade. (E) Quantificação do sinal anti-Halo em D. Os valores de p foram calculados com o teste t de Student bicaudal. (F) Embriões Tg(lyz:TagRFP) submetidos a Z-REX foram co-imunomarcados com anti-RFP e anti-Caspase 3 anti-ativa, e respectivos anticorpos secundários conjugados a fluoróforos. A caixa branca marca a área ampliada. As setas brancas indicam colocalizações de neutrófilos e caspase ativa 3. Barras de escala: 500 μm. Todos os gráficos são apresentados com média ± EPM. Esse valor foi modificado a partir de Poganik et al.7. e Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela Suplementar 1: Lista dos buffers utilizados neste estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Zebrafish visando eletrófilos reativos e oxidantes (Z-REX) é um método baseado em biologia química para a investigação da sinalização de pequenas moléculas reativas. Esta técnica pode ser aplicada a peixes vivos de diferentes estágios de desenvolvimento. Aqui, acoplamos ensaios padrão em zebrafish com Z-REX para análise de vias de sinalização.

Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

E assim alavancando Z-REX, os pesquisadores podem interrogar como as respostas individuais da sinalização são alteradas em resposta a um ligante reactivo específico que se envolve com uma proteína específica do interesse em condições fisiológicas próximas em larvas de peixe-zebra. Métodos convencionais como pequenas moléculas reativas de dose em massa causam alvos e toxicidade e não dão controle sobre a especificidade do alvo do ligante. O Z-REX pode ligar um ligante específico com um fenótipo específico com alta precisão espaço-temporal.Recentemente, mostramos como um metabólito reativo HNE, um alvo associado e uma via descoberta pelo Z-REX, permite o desenvolvimento de inibidores de quinase específicos de isoformas de precisão contra cânceres de mama triplo-negativos. Comece alinhando os embriões nos sulcos de uma placa de injeção preenchida com solução salina balanceada de Hank a 10% ou HBSS. Submergir a ponta da agulha no meio e, se necessário, aplicar pulsos de injeção para remover bolhas de ar na ponta Para injetar o embrião, penetre no córion e no saco vitelínico em um único movimento e aplique um pulso de injeção.Depois de injetar os outros embriões, lave-os em uma nova placa de Petri contendo meios HBSS frescos usando um frasco de esguicho. Junte os embriões não injetados em outra placa. Para realizar a análise do tratamento Z-REX, comece distribuindo os embriões injetados em placas de 10 centímetros.Em sala escura com luz vermelha, substituir o meio por 30 mililitros de HBSS 10% com ou sem um micromolar da sonda ROX. Incubar os embriões a 28,5 graus Celsius no escuro. Às 30 horas após a fecundação, substitua o meio no escuro.Depois de repetir a incubação e a substituição do meio duas vezes, exponha os embriões à luz de uma lâmpada UV pré-aquecida girando a cada 30 segundos. Para realizar um ensaio fenotípico, remova os embriões não fertilizados ou mortos da placa que contém os embriões anestesiados. Usando pinças afiadas, remova o córion dos embriões.Montar os embriões em placa de agarose a 2% preparada com meio HBSS a 10% e observar em estereomicroscópio. Use o ImageJ para contar o número de neutrófilos e macrófagos de cada peixe. Selecione a Seleção à mão livre e circule o peixe inteiro e, em seguida, escolha a opção Encontrar Maxima para contar as células fluorescentes No presente estudo, embriões tratados com Z-REX demonstraram perda de neutrófilos e macrófagos.Esse efeito foi ausente nos grupos não tratados. A via de sinalização da apoptose não foi desencadeada no grupo Halo-P2A-Keap1, resultando em níveis inalterados de macrófagos e neutrófilos. Resultados semelhantes também foram observados no mutante Halo-TEV-Keap1 que não respondeu ao HNE.Análises de PCR quantitativas transcricionais e em tempo real mostraram downregulation de genes relacionados à imunidade e upregulation de genes antioxidantes após Z-REX. A coloração por imunofluorescência mostrou que o constructo P2A-split-construct tinha duas vezes mais tags HA do que o TeV-fusion-construct, indicativo de níveis de expressão semelhantes. Os níveis de expressão do tipo selvagem e mutante Halo-TeV-Keap1 também foram semelhantes.Na linhagem repórter de neutrófilos transgênicos tratados com Z-REX, também foi observada colocalização de neutrófilos e caspase 3 ativa. O mais importante é ter seus documentos configurados corretamente. Limitar vai realmente melhorar seus resultados.Adotamos o Z-REX, uma ideia para uma plataforma de triagem de medicamentos conhecida como Localis-REX. Nenhuma outra técnica até o momento foi capaz de alcançar um mapeamento de ligante ou alvo local específico e reativo. Ele nos ajudou a desenvolver candidatos a drogas eletrofílicas para o tratamento do câncer de mama.Dada a crescente importância da sinalização localizada em muitos campos, câncer, imunologia, envelhecimento, etc., o Z-Rex, a única ferramenta capaz de mapear os eventos direcionados ao ligante reativo localizado, promete ajudar vários campos.

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Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

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