Name: Investigação da Biologia e Metabolismo da Gordura Bege Utilizando o Sistema de Ativação CRISPR SunTag-p65-HSF1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda a ativar genes endógenos em adipócitos usando o sistema SPH CRISPR com vetor adeno-associado. Este método alternativo permite estudar a biologia da gordura bege e programas termogênicos em tecido adiposo de Mus musculus.

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Os autores agradecem o apoio recebido do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, para a geração de camundongos AdipoSPH, do Laboratório de Inmmunometabolismo e Sinalização Celular e do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada à Biologia Celular (INFABIC) por todo o suporte experimental. Agradecemos o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório da Universidade Estadual de Campinas (protocolo CEUA #5810-1/2021).
1. Clonagem molecular
<ol><li>Planejamento de RNAs guia único (sgRNAs)<ol><li>Projete sgRNAs para ativação CRISPR usando CHOPCHOP, disponível em https://chopchop.cbu.uib.no/, ou qualquer outra ferramenta adequada. Use os seguintes parâmetros para projetar o sgRNA visando o gene Prdm16: Alvo: Prdm16; In: Mus musculus; Utilizando: Crispr/Cas9; Para: Ativação. NOTA: Projetar sgRNAs para cada região de interesse espalhada por uma região de 200 pb de início de transcrição (TSS) upstream. Por exemplo, o sgRNA direcionado a Prdm16 usado neste estudo liga 154 pb a montante de TSS.</li>
		<li>Adicione saliências ao sgRNA para corresponder ao local de restrição SacI no backbone vetorial pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (consulte Tabela de Materiais). Incluem: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nucleotídeos). Por exemplo, a sequência que tem como alvo o gene Prdm16 é 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', e com saliências é 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.</li>
		<li>Obter a sequência de complemento reverso de 3' sgRNA usando a ferramenta disponível em https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. Por exemplo, a sequência 3' sgRNA visando o gene Prdm16 é 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.</li>
	</ol></li>
	<li>Recozimento de oligonucleotídeos complementares de fita simples<ol><li>Adicionar 1 μL de cada oligonucleotídeo de fita simples de 5' e 3' (concentração de estoque: 100 μM), 1 μL de tampão ligase T4, 0,5 μL de polinucleotídeo quinase T4 (PNK) (1 × 104 unidades/mL) e 6,5 μL de H2O a um volume final de reação de 10 μL. Recozer os oligonucleotídeos complementares de fita simples usando um termociclador nas seguintes condições: 37 °C por 30 min e 95 °C por 5 min, seguidos por uma taxa de rampa de 5 °C/min. NOTA: A enzima PNK é fornecida com tampão PNK e não contém ATP suficiente necessário para a reação de fosforilação (ver Tabela de Materiais). Para simplificar a reação, use o buffer de ligase T4 (em vez do buffer PNK). O tampão ligase T4 fornece a quantidade apropriada (1 mM ATP) de fosfato para a reação de fosforilação. A enzima PNK fornece fosforilação final de 5' de oligonucleotídeos para a reação de ligadura subsequente.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligadura de oligonucleotídeos de sgRNA recozidos<ol><li>Adicionar 25 ng de plasmídeo pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry a 2 μL de oligonucleotídeos de sgRNA recozidos, 1 μL de enzima SacI, 2 μL de tampão 10x T4 DNA ligase, 1 μL de T4 DNA ligase (1-3 u/μL) (ver Tabela de Materiais) e H2O a um volume final de reação de 10 μL.</li>
		<li>Efectuar a ligadura incubando a mistura reacional utilizando um termociclador nas seguintes condições: 15 ciclos de 37 °C durante 5 min e 25 °C durante 5 min, seguidos de fixação a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Transformação seguida de reação em cadeia da polimerase de colônia (PCR)<ol><li>Transformar as células competentes de E. coli DH10B (ver Tabela de Materiais) com 4 μL do produto da ligadura usando choque térmico (42 °C por 45 s) e espalhar em uma placa de ágar contendo 100 μg/mL de ampicilina. </li>
		<li>Confirme colônias transformadas por PCR de colônia usando a mistura mestre de PCR (consulte Tabela de Materiais). Escolher a colônia e misturar com 5 μL de mistura mestre, 0,1 μL de primer universal (concentração estoque: 100 μM), 0,1 μL de primer reverso sgRNA (concentração estoque: 100 μM) (Tabela 1) e 5 μL de H 2 O. Execute a PCR usando um termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial (94 °C por2min), seguido por 35 ciclos de desnaturação (94 °C por 20 s), recozimento (60 °C por 30 s), extensão (72 °C por 30 s) e uma etapa final de alongamento (72 °C por 5 min). Resolver o DNA usando eletroforese em gel de agarose (1,5%) em tampão TAE 0,5x a 90 V por 30 min. NOTA: Clones positivos dão uma banda de ~280 pb.</li>
		<li>Enviar amostras positivas para o sequenciamento de Sanger usando primer universal (Tabela 1, Arquivo Suplementar 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação de plasmídeos<ol><li>Purificar o plasmídeo de um clone positivo usando um kit de purificação de plasmídios (ver Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante. NOTA: Purificar o plasmídeo usando resina de troca iônica ou outro kit adequado para uso em transfecção celular.</li>
		<li>Incubar o clone positivo (12 h a 37 °C com agitação a 200 rpm) utilizando um meio de crescimento bacteriano padrão contendo 100 μg/mL de ampicilina.</li>
		<li>Centrifugar as células bacterianas a 6.000 × g por 10 min a 4 °C. Siga os próximos passos de acordo com as instruções do kit do fabricante.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Embalagem AAV
OBS: O acondicionamento do AAV foi realizado de acordo com publicações anteriores15,16 com pequenas modificações.
<ol><li>Células de placa 293T (ver Tabela de Materiais) em um frasco de175 cm 2 (semeadura de 5 × 106 células por frasco) usando 25 mL de meio de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Incubar a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade até que as células atinjam 50%-70% de confluência.</li>
	<li>Misturar 14 μL de polietilenimina (1 μg/μL) com 1 mL de NaCl 150 mM. Misturar os três plasmídeos necessários para a produção de AAV em uma razão molar de 1:1:1 (ou seja, 17,7 μg de pAdDeltaF6, 7,9 μg de AAV2/8 (ver Tabela de Materiais) e 5,9 μg de sgRNA clonado da etapa 1 em 1 mL de NaCl 150 mM. Transferir a mistura de polietilenimina:NaCl gota a gota para o tubo contendo o DNA (mistura de plasmídeos) e incubar por 20 min a 25 °C. NOTA: pAdDeltaF6 é um plasmídeo auxiliar e pCapsid pAAV2/8 é um plasmídeo de empacotamento que expressa os genes Replicação (Rep) e Capsídeo (cap). Ambos os plasmídeos são necessários para produzir AAV.</li>
	<li>Antes da transfecção, substituir o meio de crescimento celular por 18 mL de DMEM contendo FBS a 1% e L-alanil-L-glutamina (0,5 g/L). Adicionar 2 mL da mistura polietilenimina:DNA a cada frasco de cultura e incubar as células em uma incubadora de CO 2 (37 °C, 5% CO2, 95% de umidade).</li>
	<li>Após 5 h, adicionar 5 mL de DMEM suplementado com FBS a 10% e L-alanil-L-glutamina (0,5g/L).</li>
	<li>Após 3 dias de incubação, retirar as células do frasco de cultura com raspador celular. Recolher as células 293T de 10 (175 cm2) frascos de cultura celular em tubos cónicos de 50 ml e adicionar DMEM (ver Tabela de Materiais) até 30 ml.</li>
	<li>Adicionar 3 mL de clorofórmio a cada tubo cônico de 50 mL contendo as células 293T e misturar com um misturador de vórtices em alta velocidade por 5 min. Ressuspender as células adicionando 7,6 mL de NaCl 5 M e vórtice brevemente. Centrifugar a 3.000 × g e 4 °C por 5 min.</li>
	<li>Transferir a fase aquosa para um novo tubo cônico e adicionar 9,4 mL de polietilenoglicol (PEG) 8000 a 50% (v/v). Misture com um misturador de vórtice em alta velocidade por 10 s e coloque as amostras no gelo por 1 h.</li>
	<li>Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C por 30 min. Retire o sobrenadante e deixe o pellet secar por 10 min.</li>
	<li>Adicionar 1,4 mL de HEPES (50 mM, pH 8) e misturar por 5 min usando um misturador vortex em alta velocidade. Adicionar 3,5 μL de 1 M MgCl2, 14 μL de DNase I (20 unidades/μL) e 1,4 μL de RNase A (10 μg/μL). Incubar em banho-maria a 37 °C durante 20 minutos e, em seguida, transferir as amostras para novos tubos de 1,5 ml (700 μL em cada tubo).</li>
	<li>Adicionar 700 μL de clorofórmio a cada tubo de 1,5 ml e misturar com um misturador de vórtices a alta velocidade durante 10 s. Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C por 5 min e transferir a fase aquosa para um novo tubo. Repita esta etapa 3x.</li>
	<li>Evaporar o clorofórmio por 30 min em um gabinete de biossegurança. Em seguida, transfira 300 μL da fase aquosa para um tubo de ultracentrifugação de 0,5 mL (ver Tabela de Materiais). Gire o filtro a 14.000 × g a 25 °C por 5 min. Remova o fluxo e gire o filtro novamente até que todo o volume tenha passado pelo filtro.</li>
	<li>Lave o filtro adicionando 300 μL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco e misture as soluções por pipetagem. Centrifugar o filtro durante 5 min a 14.000 × g a 25 °C. Repita este passo de lavagem 4x.</li>
	<li>Centrifugar o filtro durante 8 min a 14.000 × g a 25 °C. Coloque o filtro de cabeça para baixo em um tubo novo e gire por 2 min a 1.000 × g a 25 °C.</li>
</ol>3. Titulação do AAV por qPCR
<ol><li>Elaborar uma curva padrão para titulação de AAV e determinar o título de AAV de acordo com o estudo original de Fripont et al.15.</li>
</ol>4. Injeção in vivo de AAV no tecido adiposo branco inguinal (TABi)
<ol><li>Separe as ferramentas cirúrgicas e os insumos necessários para a cirurgia e esterilize-os conforme recomendado para cada material específico.</li>
	<li>Anestesiar o camundongo com 100 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina por injeção intraperitoneal. Confirme a anestesia aplicando pressão vigorosa na pata e na cauda e verificando se há reflexo. Aplique pomada nos olhos do rato para evitar o ressecamento ocular durante a cirurgia.</li>
	<li>Coloque o rato anestesiado na posição supina e raspe uma pequena área nos flancos, proximal às articulações do quadril para injeções de iWAT, com um barbeador. Aplique o creme depilatório por 5 min. Retire o creme residual com água para evitar queimaduras na pele.</li>
	<li>Desinfetar a pele usando três rodadas alternadas de aplicação de solução antisséptica (iodopovidona) sobre a pele com uma gaze limpa e álcool a 70%. Descarte a gaze após cada uso.</li>
	<li>Realizar uma aplicação final de uma solução antisséptica sobre a pele. Em seguida, faça uma incisão de 1 a 2 cm com tesoura esterilizada na área proximal das articulações e mantenha a pele aberta usando pinças para expor o depósito de gordura. O WAT pode ser encontrado aderido à pele em ambos os lados, estendendo-se desde o início nas costas e para baixo em direção ao testículo. OBS: Utilizar campos para evitar contaminação durante cirurgias ou procedimentos de sutura.</li>
	<li>Usando pinças, através da incisão, puxe suavemente o depósito de gordura para cima para garantir que a injeção esteja no local e profundidade corretos. NOTA: Tenha cuidado para não remover o tecido de seu local original.</li>
	<li>Preencher a seringa de microlitros (calibre: 33; estilo do ponto: 4; ângulo: 12; comprimento: 10) (ver Tabela de Materiais) com 2,5 μL (5,6 × 1010 genomas virais [VG]/μL) do AAV (contendo o sgRNA direcionado ao gene endógeno Prdm16). Introduza cuidadosamente a agulha num ângulo de 30°-45° no iWAT. Repita a injeção 5x em diferentes locais do tecido para infectar homogeneamente todo o coxim gorduroso iWAT. Um volume total de 15 μL é recomendado para infectar o iWAT. NOTA: A profundidade de inserção da seringa depende da espessura do depósito da almofada de gordura. Use a técnica sem toque para elaborar a injeção.</li>
	<li>Fechar a incisão da pele raspada com pontos monofilamentares 4/0. Coloque o mouse em uma almofada térmica até que a consciência seja recuperada. Monitore o animal a cada 10-15 min até que ele se recupere totalmente. Após o animal recuperar a consciência, observe o perfil locomotor, que deve ser linear e não apresentar sinais de angústia ou dor.</li>
	<li>Realizar o controle da dor pós-operatória em até 48 h após a cirurgia, administrando cloridrato de tramadol (5 mg/kg) por via intraperitoneal por 3 dias (2x/dia). OBS: Fique atento aos sinais de angústia e desconforto e monitore a ingestão de água e alimentos. Administrar uma dose eficaz de analgésico de forma preventiva, de preferência antes ou no início da cirurgia.</li>
	<li>Mantenha o rato numa gaiola com livre acesso a comida e água durante o período de cicatrização. Após o período de cicatrização, proceda à eutanásia do rato. Neste estudo, a eutanásia foi realizada por uma superdose de anestésicos injetáveis (intraperitoneal) a partir de 3x a dose indutora (300-360 mg/kg cloridrato de ketamina + 30-40 mg/kg cloridrato de xilazina) seguida de decapitação. NOTA: É altamente recomendável manter os animais alojados em gaiolas individuais até que estejam totalmente recuperados da anestesia.</li>
</ol>5. Diferenciação in vitro de células vasculares estromais (SVFs) em adipócitos beges
<ol><li>Realizar isolamento e plaqueamento de SVFs primárias do iWAT de camundongos AdipoSPH de acordo com Aune et al.17. SVFs de sementes derivadas de camundongos AdipoSPH iWAT em uma placa de 6 poços contendo meio completo (DMEM contendo 3,1 g/L de glicose, 0,5 g/L de L-alanil-L-glutamina, 10% de SFB e 2,5% de P/S) por 1-2 h. Observação : A fração SVF contém uma mistura de diferentes tipos de células. Nesta etapa, não é possível definir o número de células progenitoras semeadas que dão origem aos adipócitos.</li>
	<li>Aspirar o meio, lavar o poço 2x com solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) e substituir por meio fresco completo. Incubar as células a 37 °C, 5% CO2, 95% de umidade até que as células atinjam 70%-80% de confluência.</li>
	<li>Induzir a diferenciação (dia 0) tratando as células com o meio de indução (Tabela 2). OBS: O coquetel de fármacos do meio de indução é necessário para aumentar a diferenciação dos adipócitos beges e para a expressão do programa de genes termogênicos17.</li>
	<li>Após 2 dias (dia 2), substituir o meio de indução pelo meio de manutenção (Tabela 2).</li>
	<li>Após 2 dias (dia 4), substituir o meio de manutenção por meio de manutenção fresco (Tabela 2) por 2 a 3 dias.</li>
	<li>Troque o meio de manutenção a cada 48 h até que os pré-adipócitos estejam completamente diferenciados em adipócitos (tipicamente 6 dias após a adição do meio de indução). Adpócitos maduros podem ser observados usando microscopia de luz, pois as células diferenciadas parecem estar carregadas de gotículas lipídicas.</li>
</ol>6. Infecção in vitro por AAV de SVFs
NOTA: SVFs derivadas de camundongos AdipoSPH iWAT foram infectadas com sgRNA-Prdm16 portadores de AAV, conforme descrito anteriormente por Wang et al.18 com algumas modificações.
<ol><li>Cultivar as células em uma placa de cultura de 6 poços com meio completo até que as células atinjam 70%-80% de confluência, conforme descrito anteriormente nas etapas 5.1-5.3.</li>
	<li>Misturar 5,6 × 1010 VG/μL de sgRNA-Prdm16 carreador de AAV com 2 ml de meio completo e brometo de hexadimetrina (8 μg/ml) (ver Tabela de Materiais). Transduzir as células substituindo o meio completo e adicionando o meio completo contendo AAV. Incubar as células transduzidas por 12 h a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.</li>
	<li>Dividir e semear as células conforme descrito na etapa 5 para proliferação e diferenciação celular em adipócitos bege. NOTA: Para o ensaio de consumo de oxigênio, sementes 4,0 × 104 células (a partir da etapa 6.2) por poço com meio de indução em placa de cultura celular de 24 poços. As etapas subsequentes de proliferação e diferenciação celular são realizadas conforme descrito na etapa 5. O ensaio do consumo de oxigênio é realizado quando as células atingem 80%-100% de confluência e estão totalmente diferenciadas, como relatado anteriormente19.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brown+and+beige+fat+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
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<li>Cohen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+PRDM16+and+beige+adipose+causes+metabolic+dysfunction+and+a+subcutaneous+to+visceral+fat+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch.</a> Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).</li>
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<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Uma das aplicações mais úteis de não-edição da tecnologia CRISPR é a interrogação da função gênica através da ativação de genes endógenos utilizando sistemas CRISPRa6. A HPS é uma poderosa CRISPRa que foi originalmente descrita para induzir a conversão de astrócitos em neurônios ativos, tendo como alvo vários genes neurogênicos14. Neste estudo, o AdipoSPH demonstrou ser uma ferramenta adequada para investigar a biologia da gordura bege ativando a expressão de Prdm16 endógen...

Os adipócitos beges (ou britos) são adipócitos que expressam a proteína 1 desacopladora (UCP1) e ricos em mitocôndrias que residem dentro dos depósitos de tecido adiposo branco (TAB). A gordura bege emerge de um subgrupo de progenitores de adipócitos ou adipócitos brancos maduros em resposta à exposição ao frio e a outros estímulos 1,2. Os adipócitos beges podem converter energia em calor de forma dependente ou independente de UCP13. Independentemente de sua função termogênica, a gordura bege também pode melhorar a saúde metabólica por outros meios, como a secreção de adipocinas e atividades anti-inflamatórias e antifibróticas. Estudos em camundongos e humanos têm demonstrado que a indução de gordura bege melhora a glicemia corporal total e a homeostase lipídica3. No entanto, embora nosso conhecimento da biologia da gordura bege tenha evoluído rapidamente nos últimos anos, a maioria de seus benefícios metabólicos e mecanismos relacionados ainda não são totalmente compreendidos.
Repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) foram descritas pela primeira vez em células eucarióticas como uma ferramenta capaz de gerar uma quebra de fita dupla (DSB) em um local específico do genoma através da atividade nuclease da proteína Cas9 4,5. Cas9 é guiado por um RNA guia único sintético (sgRNA) para atingir uma região genômica específica, levando a um DSB de DNA. Além de usar a nuclease Cas9 para fins de edição, a tecnologia CRISPR-Cas9 evoluiu para ser usada como uma ferramenta de regulação gênica específica de sequência6. O desenvolvimento de uma proteína Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) e a associação de módulos transcricionais capazes de aumentar a expressão gênica deram origem a ferramentas de ativação de CRISPR (CRISPRa). Vários sistemas CRISPRa têm surgido, como VP647,8, mediador de ativação sinérgica (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 e SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, que combina os componentes dos ativadores SAM e SunTag. Recentemente, foi demonstrado que a expressão induzida de genes neurogênicos em neuroblastos N2a e astrócitos primários é maior usando HPS em comparação com outros sistemas CRISPRa14, demonstrando a HPS como uma ferramenta CRISPRa promissora.
Aqui, aproveitamos um camundongo SPH14 previamente desenvolvido para gerar um modelo condicional de camundongo expressando HPS especificamente em adipócitos usando a linhagem de adiponectina Cre (AdipoSPH). Usando um vírus adenoassociado (AAV) carregando o gRNA visando o gene endógeno Prdm16, o escurecimento (conversão branca para bege) do WAT inguinal (iWAT) foi induzido para aumentar a expressão do programa de genes termogênicos. Além disso, a superexpressão in vitro de Prdm16 aumentou o consumo de oxigênio. Portanto, este protocolo fornece um modelo versátil de camundongos com HPS para explorar os mecanismos de desenvolvimento de gordura bege no tecido adiposo.

<table><tbody><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-tironina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2877</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>AAVpro 293T Linha Celular</td><td>Takarabio</td><td>632273</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Filtro Centrífugo</td><td>Merckmillipore</td><td>UFC510008</td><td>100 KDa</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX&trade; suplemento</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td>altas concentrações de glicose, aminoácidos e vitaminas</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered salina (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Excelta Auto-Abertura Micro Tesoura</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-496</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Raspadores de Células Fisherbrand (100 pk)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>Pinça/Pinça de Ponta Ultra Fina de Alta Precisão Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação de Ponta Afiada Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de hexadimetrina (Polybrene)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast Rapid Sistema de Ligação DNA</td><td>Promega</td><td>M8225</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação Maxiprep&nbsp;</td>Seringa de microlitro <td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamilton</td><td>80308</td><td>Modelo 701</td></tr><tr><td>NEB 10-beta/Estável&nbsp;</td>Células competentes New <td>England Biolabs</td><td>C3019H</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>pAAV2/8&nbsp;</td><td>Adicionar&nbsp;</td><td></td><td></td>112864</tr><tr><td>pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>91947</td><td></td></tr><tr><td>pAdDeltaF6&nbsp;</td><td>Adicionar&nbsp;</td><td></td><td></td>112867</tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polietileninina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23966</td><td>Linear, MW 25000</td></tr><tr><td>Povidona-iodo</td><td>Rioqu&iacute; mica</td><td>510101303</td><td>Anti-séptico</td></tr><tr><td>Rosiglitazona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Enzima SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156</td><td></td></tr><tr><td>Desenho Cirúrgico Premier Adson Fórceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-741</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Hamilton</td><td>475-40417</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega</td><td>M180B</td><td></td></tr><tr><td>Tampão T4 DNA ligase&nbsp;</td><td>Kit de enzimas New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr> T4 PNK <tr><td>Cloridrato de tramadol</td><td>SEM</td><td>43930</td> Vidisic Gel New England Biolabs M0201S Tramadol SEM 43930<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>;<td></td></tr><tr><td></td><td>Bausch + Lomb&nbsp;</td><td>Rolamento 99620</td><td></td></tr></tbody></table>

investigação da biologia e metabolismo da gordura bege utilizando o sistema de ativação crispr suntag-p65-hsf1

Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System

A tecnologia de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) provocou uma revolução na biologia, e ferramentas recentes foram aplicadas muito além da edição genética originalmente descrita. O sistema de ativação CRISPR (CRISPRa) combina a proteína Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) com módulos de transcrição distintos para induzir a expressão gênica endógena. SunTag-p65-HSF1 (SPH) é uma tecnologia CRISPRa recentemente desenvolvida que combina componentes de mediadores de ativação sinérgica (SAMs) com os ativadores SunTag. Este sistema permite a superexpressão de genes únicos ou múltiplos através do desenho de um RNA guia único personalizado (sgRNA). Neste estudo, um camundongo com HPS previamente desenvolvido foi usado para gerar um camundongo condicional expressando HPS em adipócitos (linhagem Cre de adiponectina), denominado AdipoSPH. Para induzir um fenótipo de gordura branca a bege (escurecimento), um vírus adenoassociado (AAV) carregando sgRNA visando o gene endógeno Prdm16 (um fator de transcrição bem estabelecido relacionado ao desenvolvimento de gordura marrom e bege) foi injetado no tecido adiposo branco inguinal (iWAT). Este modelo de camundongo induziu a expressão de Prdm16 endógeno e ativou o programa de genes termogênicos. Além disso, a superexpressão in vitro de Prdm16 induzida por SPH aumentou o consumo de oxigênio dos adipócitos bege, fenocopiando os resultados de um modelo anterior de camundongos transgênicos Prdm16. Assim, este protocolo descreve um modelo versátil, custo-efetivo e tempo-efetivo em camundongos para investigar a biologia do tecido adiposo.

Camundongos AdipoSPH foram desenvolvidos a partir da criação de linhagens de camundongos SPH e Adipoq-Cre. Ambas as linhagens de camundongos estavam em um fundo híbrido C57BL6J-DBA/2J (de acordo com o fornecedor comercial; ver Tabela de Materiais). A linhagem de camundongos SPH foi originalmente descrita por Zhou et al.14.
Desenvolvimento de adipócitos bege in vivo através da superexpressão de Prdm16 mediada por AdipoSP...

Este protocolo apresenta o uso do CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) em adipócitos (AdipoSPH) como uma estratégia alternativa ao vírus adenoassociado (AAV) para investigar a biologia da gordura bege. A injeção in vivo de sgRNA carreador de AAV visando o gene endógeno Prdm16 é suficiente para induzir o desenvolvimento de gordura bege e melhorar o programa do gene termogênico.

Investigação da Biologia e Metabolismo da Gordura Bege Utilizando o Sistema de Ativação CRISPR SunTag-p65-HSF1

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technology has prompted a revolution in biology, and recent tools have been applied far ...

Este protocolo apresenta o Sistema de Ativação CRISPR do SPH como uma estratégia alternativa aos vetores virais convencionais para realizar ensaios de ganho de função em adipócitos. Ele permite a superexpressão de genes endógenos de adipócitos únicos ou múltiplos dentro do ambiente celular complexo do tecido adiposo, entregando um RNA guia único personalizado usando um vírus adeno associado. As etapas desafiadoras deste protocolo estão relacionadas à clonagem do RNA-guia único e à produção e injeção de vírus adenoassociados no tecido adiposo.Para começar, projete RNA guia único ou sgRNA para ativação CRISPR usando chopchop ou qualquer outra ferramenta adequada. Projetar o sgRNA visando o gene PRDM16 usando os seguintes parâmetros:Alvo como PRDM16 em um músculo Mus usando um CRISPR/Cas9 e para como ativação. Adicione saliências ao sgRNA para corresponder ao local de restrição Sac1 na espinha dorsal vetorial PAAVU6GRNACBHM cereja.Incluir 5'AGCT 3'onde n corresponde a nucleotídeos. Obter sequência de complemento reverso de 3'sgRNA usando a ferramenta indicada. Em seguida, para o recozimento de oligonucleotídeos de fita simples, adicionar um microlitro de cada oligonucleotídeo de fita

investigation-beige-fat-biology-metabolism-using-crispr-suntag-p65

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de "escurecimento" da gordura branca.

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

Neste relatório em vídeo, mostramos a aplicação da Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) para tecido adiposo marrom interescapular em camundongos sob condições ativadas e deprimidas.

Cerenkov luminescência imagem de Interscapular Brown tecido adiposo

Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.

Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Imagem funcional e quantitação de depósitos de adiposos termogênicos em camundongos usando uma abordagem baseada em imagens micro-PET/MR.

Visualização e Quantificação de Tecidos Adiposos Marrons e Bege em Camundongos usando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar o significado fisiológico do impacto da atividade do tecido adiposo marrom (BAT) no metabolismo humano. Isto é conseguido combinando carga de carboidratos e calorimetria indireta com medidas de mudanças supraclaviculares de temperatura. Esta nova abordagem pode ajudar a desenvolver um alvo farmacológico para a termogênese BAT em humanos.

Usando uma combinação de calorimetria indireta, termografia infravermelha e níveis de glicose no sangue para medir a termogênese do tecido adiposo marrom em humanos

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade do tecido adiposo marrom após uma refeição em humanos e animais de laboratório.

Termografia infravermelha para detecção de alterações na atividade do tecido adiposo marrom

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado delineando o uso de fragmentos microvasculares isolados de tecido adiposo humano ou de roedores como uma abordagem direta para a engenharia de tecido adiposo bege vascularizado funcional.

Cultura Tridimensional de Tecido Adiposo Termogênico Vascularizado a partir de Fragmentos Microvasculares

Neste protocolo, descrevemos os procedimentos técnicos para gerar camundongos knockout específicos para tecido adiposo marrom (BAT) utilizando um sistema combinado de RNA guia único (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado (AAV). As etapas descritas incluem o planejamento dos sgRNAs, a preparação das partículas de AAV-sgRNA e a microinjeção de AAV nos lóbulos BAT.

Geração de camundongos knockout específicos para gordura marrom usando um sistema combinado de RNA guia único Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Aprenda a ativar genes endógenos em adipócitos usando o sistema SPH CRISPR com vetor adeno-associado. Este método alternativo permite estudar a biologia da gordura bege e programas termogênicos em tecido adiposo de Mus musculus.

Investigação da Biologia e Metabolismo da Gordura Bege Utilizando o Sistema de Ativação CRISPR SunTag-p65-HSF1

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