AMEBaS: Extração Automática da Linha Média e Subtração de Fundo de Time-Lapses de Fluorescência Ratiométrica de Células Individuais Polarizadas

Este método quantifica a dinâmica espaço-temporal de células polarizadas ao longo de sua linha média expressando fluorescente ou corante para entidades específicas de interesse, como actina, íons ou dinâmica de vesículas. A versão de automação elimina vieses e permite escalabilidade, especialmente para tarefas que são feitas digitalmente manualmente e podem se tornar demoradas e subjetivas. Para começar, abra o Jupyter Notebook e leia os arquivos de lapso de tempo, acessando a página inicial do bloco de anotações interativo do Google CoLab ou baixando e abrindo o AMEBaS_local IP YNB do GitHub.

Para preparar a configuração do diretório para os dados de entrada e saída usando a versão local, coloque o time-lapse de fluorescência como um arquivo TIF ou DV dentro de uma pasta chamada dados localizada na pasta raiz do programa. Crie uma pasta de saída para receber os dados gerados e, em seguida, execute o bloco de código de instalação. Se estiver usando o bloco de anotações no Google CoLab, execute o bloco de código de configuração para gerar automaticamente dados e pastas de saída e, em seguida, execute o bloco de código de entrada de arquivo para ler os dados de lapso de tempo clicando no botão de reprodução.

Se estiver utilizando o Google CoLab, faça o upload do arquivo de lapso de tempo para a pasta de dados clicando no botão Escolher arquivo. Em seguida, escolha gerar saídas adicionais para cada etapa, definindo o parâmetro detalhado como true ou false. Para detectar a célula principal e o segmento do plano de fundo, execute o bloco de código de segmentação de célula única clicando no botão de reprodução para separar automaticamente a célula de interesse do plano de fundo.

Ajuste o valor sigma na variável sigma para ajustar a suavidade da máscara de segmentação. O valor padrão é 2.0. Agora defina a estimativa da variável como false para armazenar o limite estimado diretamente dos dados ISO ou true para suavizá-lo em quadros vizinhos usando regressão polinomial local.

Ajuste a variável n_points para ajustar a função com o valor padrão sendo 40. Para traçar a linha média ao longo da extensão da célula, execute o bloco de código de rastreamento da linha média da célula clicando no botão de reprodução para esqueletizar a célula usando o método de Lee e estender a ponta do último esqueleto por meio de extrapolação linear. Em seguida, selecione a opção de rastreamento para a linha média ajustando o argumento complete_skeletonization para rastrear no último quadro ou uma vez por quadro.

Ajuste a variável interpolation_fraction para definir a fração de pontos no esqueleto para interpolação durante a extrapolação. O valor padrão aqui é 0,25. Em seguida, modifique a variável extrapolation_length para determinar o comprimento da extrapolação da linha média.

O valor padrão é menos um, que estende o esqueleto até a borda mais próxima. Agora execute o primeiro bloco de código de visualização de dados clicando no botão play para gerar quimografias automaticamente para ambos os canais. Escolha o tamanho do kernel gaussiano para suavização ajustando a variável kymograph_kernel.

Para exibir as intensidades dos esqueletos não estendidos corretamente, um mapa colorido personalizado é necessário para seus quimógrafos limitados. Ajuste a variável shift_fraction para escolher a porcentagem de fração de intensidades que será designada como a cor de fundo, preto. Em seguida, execute o segundo bloco de código de visualização de dados clicando no botão de reprodução para gerar um quimógrafo métrico de proporção e lapso de tempo automaticamente.

Ajuste a variável switch_ratio para alterar a ordem dos canais usados como numerador e denominador durante os cálculos de razão com o padrão sendo false. Verifique se o lapso de tempo de proporção requer suavização adicional com uma passagem de filtro mediana ajustando a variável smooth_ratio. Por padrão, isso é definido como false.

Em seguida, opte por remover ou manter outliers resultantes de sinal baixo no canal denominador ajustando a variável reject_outliers. Os valores atípicos são marcados como valores 1,5 vezes o intervalo interquartil acima do terceiro quartil. Finalmente, escolha se o plano de fundo e a saída métrica de razão precisam ser exportados ajustando a variável background_ratio.

O padrão é false para substituir o plano de fundo por zeros. AMEBaS testado em conjuntos de dados como tubos de pólen expressando o cameleon repórter de cálcio, tubos de pólen expressando o florim indicador de pH, pelos de raiz expressando o repórter de cálcio NESYC 3.6 funcionou com sucesso, apesar das diferenças na direção de crescimento, técnicas de imagem, repórteres fluorescentes e tipos de células. Lembre-se de executar o conjunto de blocos para que você possa instalar os pacotes necessários.

Além disso, é crucial ajustar os valores sigma especificamente para suas imagens para que você possa obter resultados mais precisos. Os quimógrafos resultantes podem então ser usados para analisar a dinâmica espaço-temporal do interesse de resolução. Além disso, você pode calculá-lo encontrando método, crescimento e séries temporais para analisar a solução certa.