Name: Método de Cultura 3D de Esferoides de Linhagens Celulares de Zebrafish Embrionárias e Hepáticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a gerar esferoides 3D de linhagens celulares de zebrafish ZEM2S e ZFL para testes de toxicidade. Este método simples e rápido facilita estudos de segurança ambiental sem uso de animais.

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Em memória do Dr. Márcio Lorencini, coautor deste trabalho, excelente pesquisador na área de cosméticos e dedicado a promover a pesquisa cosmética no Brasil. Os autores agradecem ao Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia (UFPR) pela disponibilidade dos equipamentos e pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) (Código Financeiro 001) e do Grupo Boticário.

Os principais passos para gerar esferoides 3D de linhas celulares ZFL e ZEM2S em uma placa de fundo redondo de 96 poços são apresentados na Figura 1.
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais usados neste protocolo e a Tabela 1 para soluções e meios de cultura usados neste protocolo.
1. Meio de cultura celular e culturas de monocamada
<ol><li>Cultivar ambas as linhagens celulares (ZFL, ZEM2S) como monocamadas em uma incubadora a 28 °C sem CO2, e subcultá-las em uma proporção de subcultivo de 1:3 quando atingirem ~80% de confluência.<ol><li>Comece com um frasco T75 de células de peixe-zebra a ~80% de confluência, cultivado como descrito acima.</li>
		<li>Retirar o meio completo e lavar as células adicionando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) (0,01 M) ao frasco de cultura com o auxílio de uma pipeta.</li>
		<li>Com o auxílio de uma pipeta, adicionar 3 mL de EDTA 1x tripsina-0,5 mM (0,05% [v/v]) aos frascos de cultura e incubar a 28 °C por 3 min para o desprendimento das células do frasco.</li>
		<li>Tocar suavemente no balão para libertar as células e, em seguida, interromper a digestão de tripsina adicionando 3 ml de meio de cultura completo ao balão.</li>
		<li>Com uma pipeta, transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL e centrifugar a 100 × g por 5 min.</li>
		<li>Após a formação do pellet, remova cuidadosamente o sobrenadante, adicione 1 mL do meio completo para a respectiva linhagem celular em uso (ZFL ou ZEM2S) e ressuspenda usando uma micropipeta. Pegue uma alíquota para contagem de células.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Contagem celular com teste de exclusão do corante azul de tripano
<ol><li>Adicionar 10 μL da suspensão celular e 10 μL do corante azul de tripano a um microtubo para contar as células e avaliar sua viabilidade. Misture a suspensão celular e o corante usando uma pipeta.</li>
	<li>Em seguida, transferir 10 μL dessa mistura (suspensão celular + azul de tripano) para uma câmara de Neubauer e contar as células nos quatro grandes quadrados (quadrantes: Q) colocados nos cantos da câmara, considerando viáveis as células que não absorvem o azul de tripano. Calcule o número de células viáveis usando a equação (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq01.jpg" style="margin: auto;">(1º)</li>
	<li>Para calcular o número final de células na suspensão celular, multiplique o número de células determinado pela equação (1) por 2 (o fator de diluição devido ao uso do azul de tripano). NOTA: Alternativamente, um sistema automatizado de contagem de células pode ser usado.</li>
</ol>3. Revestimento celular em placas ULA
<ol><li>Depois de calcular o número de células, ajuste a suspensão celular para a placa de 200 μL dessa suspensão por poço de uma placa ULA de fundo redondo de 96 poços com o número de células necessárias para cada linha celular, conforme indicado abaixo:<ol><li>Placa 7.000 células ZFL viáveis/poço; assim, para toda a placa ULA, utilizar 700.000 células em 20 mL de meio completo.</li>
		<li>Placa 3.500 células ZEM2S viáveis/poço; assim, para toda a placa ULA, utilizar 350.000 células em 20 mL de meio completo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare a suspensão celular com a concentração ajustada de células em um reservatório médio e misture-a usando uma micropipeta multicanal, tomando cuidado para não formar espuma ou bolhas. Usando a micropipeta multicanal, adicionar 200 μL da suspensão celular ajustada a cada poço da placa ULA. NOTA: A placa deve ser selada com parafilme ou folha de vedação adesiva para evitar a evaporação do meio de cultura da placa de 96 poços.</li>
</ol>4. Formação esferoide
<ol><li>Incubar a placa ULA em um agitador orbital a 70 rpm por 5 dias em uma incubadora de 28 °C. Permitir que os esferoides se formem ao longo de 5 dias de agitação orbital (Figura 2), atingindo um tamanho médio de ~225 μm de diâmetro (esferoides ZFL) e ~226 μm de diâmetro (esferoides ZEM2S)12. NOTA: Após 5 dias de incubação (circularidade máxima), os esferoides estão prontos para uso.</li>
	<li>Para manter os esferoides em cultura por mais de 5 dias, remova 100 μL do meio gasto a cada 5 dias e adicione 100 μL de meio de cultura completo fresco usando uma micropipeta multicanal. NOTA: Tome cuidado para não aspirar os esferoides durante este processo.</li>
</ol>5. Medição do tamanho (diâmetro) e forma (índice de circularidade) dos esferoides
<ol><li>Adquira as imagens.<ol><li>Sob um microscópio de luz invertida com um sistema de captura de imagens, obtenha-se uma imagem de uma escala definida. NOTA: Use uma lâmina de calibração de estágio de microscópio ou uma lâmina de Neubauer (na qual os tamanhos dos quadrantes são conhecidos) para obter a escala.</li>
		<li>Sob o microscópio e usando a mesma lente objetiva usada para obter a imagem da escala, obtenha imagens dos esferoides totalmente formados (ou seja, esferoides de 5 dias de idade). NOTA: Todas as imagens devem ser tiradas usando o mesmo sistema de captura de imagem, pois a resolução da imagem é importante para determinar o tamanho e a forma dos esferoides, e pode diferir entre os tipos de sistemas.</li>
	</ol></li>
	<li>Defina a escala.<ol><li>Usando o software ImageJ, abra a imagem da escala definida (clique em Arquivo | abrir).</li>
		<li>Selecione o seletor de linha reta na barra de ferramentas e, usando o mouse, arraste uma linha pela extensão da escala definida na imagem.</li>
		<li>Defina a escala selecionando Analisar | Defina a escala e aguarde até que a janela Definir escala seja aberta.</li>
		<li>Na janela Definir escala, preencha o espaço em branco de Distância conhecida com a distância conhecida (μm) correspondente à reta; preencha a unidade de comprimento com um para μm. Clique em OK. NOTA: A escala em pixels/μm é exibida na parte inferior da janela.</li>
	</ol></li>
	<li>Defina os parâmetros de medição.<ol><li>No software ImageJ, selecione Analisar | Defina as medidas para abrir a janela Definir medidas .</li>
		<li>Na janela Definir medidas, selecione as caixas para as medidas desejadas (ou seja, descritores de área e forma). Clique em OK.</li>
	</ol></li>
	<li>Obter o diâmetro e circularidade dos esferoides.<ol><li>Abrir a imagem de um esferoide (Arquivo | Aberto).</li>
		<li>Selecione a ferramenta de seleção à mão livre na barra de ferramentas e, usando o mouse, selecione o lado externo do esferoide, conforme demonstrado na Figura 3A. Observação : para ampliar ou reduzir a imagem, pressione a tecla Ctrl e use o mouse para rolar para baixo ou para cima, ou pressione a tecla Ctrl e use as teclas de seta para cima ou para baixo no teclado.</li>
		<li>Selecione Analisar | Medir para abrir a janela Resultados , na qual os valores medidos são exibidos.</li>
		<li>Usando o valor de área , calcule o tamanho (diâmetro) dos esferoides usando a equação (2): <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq02.jpg" style="margin: auto;">(2º)</li>
		<li>O índice de circularidade é dado na janela Resultados como "Circ.", e é calculado automaticamente pelo software usando a equação (3): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq03.jpg" style="margin: auto;">(3º) NOTA: O índice de circularidade de 1,0 representa uma forma esferoidal perfeita, enquanto um valor próximo de 0,0 indica uma forma alongada13.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research.+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+representative+in+vitro+method+for+fish+ecotoxicology%3A+morphological+and+biochemical+characterisation+of+three-dimensional+spheroidal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes.</a> Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).</li>
<li>Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+hepatocyte+spheroids+-+A+powerful+%28though+underexplored%29+alternative+in+vitro+model+to+study+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470(2022).</li>
<li>Baron, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutical+metabolism+in+fish%3A+using+a+3-D+hepatic+in+vitro+model+to+assess+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance.</a> PloS One. 12 (1), 0168837(2017).</li>
<li>Langan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+size+does+not+impact+metabolism+of+the+%CE%B2-blocker+propranolol+in+3D+intestinal+fish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 947(2018).</li>
<li>Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+three-dimensional+%283D%29+spheroid+cultures+of+the+continuous+rainbow+trout+liver+cell+line+RTL-W1%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).</li>
<li>Jeong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+CBZ-induced+catalysis+and+cytochrome+gene+expression+in+three+dimensional+zebrafish+liver+cellculture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+and+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture.</a> Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161(2016).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720(2011).</li>
<li>Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hollow+sphere+soft+lithography+approach+for+long-term+hanging+drop+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>de Souza, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+cultures+of+zebrafish+liver+and+embryo+cell+lines%3A+a+comparison+of+different+spheroid+formation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods.</a> Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ%2FFiji%22%5BJournal%5D)">ImageJ user guide.</a> ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).</li>
<li>Guidony, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+proteins+activity+and+cytotoxicity+in+zebrafish+hepatocytes+exposed+to+triclosan%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan.</a> Environmental Pollution. 271, 116368(2021).</li>
<li>da Silva, N. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+goethite+in+the+effects+of+glyphosate+and+Roundup%C2%AE+on+ZFL+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line.</a> Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+is+a+key+factor+influencing+the+invasion+and+proliferation+of+Toxoplasma+gondii+in+fish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells.</a> Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).</li>
<li>Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+induced+by+glyphosate+and+glyphosate-based+herbicides+in+the+zebrafish+hepatocyte+cell+line+%28ZF-L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L).</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).</li>
<li>Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+water+soluble+fraction+of+gasoline+on+ZFL+cell+line%3A+Cytotoxicity%2C+genotoxicity+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress.</a> Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).</li>
<li>Morozesk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+multiwalled+carbon+nanotubes+co-exposure+with+cadmium+on+zebrafish+cell+line%3A+Metal+uptake+and+accumulation%2C+oxidative+stress%2C+genotoxicity+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).</li>
<li>Dognani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofibrous+membranes+for+low-concentration+Cr+VI+adsorption%3A+kinetic%2C+thermodynamic+and+the+influence+on+ZFL+cells+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability.</a> Materials Research. , 24(2021).</li>
<li>ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/crl-2147">https://www.atcc.org/products/crl-2147</a> (2022).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Gajski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+potential+of+selected+cytostatic+drugs+in+human+and+zebrafish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research+International%22%5BJournal%5D)">Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells.</a> Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).</li>
<li>Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+octocrylene+on+zebrafish+larvae+and+liver+cell+line+%28ZFL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL).</a> Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+determination+of+oxygen+consumption+rates+and+diffusion+coefficients+in+multicellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids.</a> Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).</li>
<li>Ho, R. K., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+of+cell+fate+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo.</a> Science. 261 (5117), 109-111 (1993).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-19+and+N-cadherin+interact+to+control+cell+movements+during+anterior+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).</li>
<li>Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptome+characterization+of+model+zebrafish+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines.</a> Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Este é um método simples, fácil e rápido para gerar esferoides de linhagens celulares de fígado e embrião de peixe-zebra. Este método foi desenvolvido por este grupo com base em modificações de métodos esferoides 3D existentes para superar problemas relatados em estudos científicos relacionados à formação de esferoides, bem como incertezas na precisão dos dados de ensaios esferoides 3D. Por exemplo, os problemas relatados residem nas dificuldades de manuseio, na demora na geração de esferoides, na necessidade de selecion...

Esferoides são pequenas esferas de células formadas quando as células são cultivadas em contato próximo célula a célula em cultura 3D. A capacidade dos esferoides de mimetizar o ambiente tecidual in vivo já foi estudada em uma variedade de linhagens celulares e célulasprimárias1,2. No entanto, embora os esferoides estejam bem desenvolvidos para estudos de toxicidade em mamíferos, o desenvolvimento de esferoides para estudos de toxicidade com vertebrados não mamíferos (por exemplo, peixes) ainda está em andamento3. Para linhagens celulares de peixes, esferoides têm sido desenvolvidos por uma variedade de métodos diferentes, como o orbital shaking (OS) usando diferentes tipos de placas de poço3,4,5,6,7, e o método de levitação magnética usando nanopartículas magnéticas8. No entanto, alguns desses métodos de cultivo para esferoides podem ter mais desvantagens do que outros.
Por exemplo, métodos giratórios em microplacas grandes (placas de 24 poços) podem gerar um alto número de esferoides diferindo em tamanho e forma; De fato, a formação de estruturas multiesferóides tem sido demonstrada7. Isso requer esforços intensos para escolher esferoides com tamanho e forma semelhantes para um experimento. O método de cultura 3D em gota suspensa é comumente utilizado para geração de esferoides de linhagens celulares de mamíferos 1,2,9,10,11, onde esferoides únicos por gota podem ser gerados, evitando os problemas descritos acima. No entanto, embora um método de queda suspensa modificado (queda suspensa + agitação orbital) seja capaz de gerar esferoides ZFL usando um método barato, ele tem suas desvantagens12. Os agregados celulares formados não podem ser mantidos por longos períodos nas gotas; assim, eles precisam ser transferidos para placas de poço. Esse processo requer manuseio intenso e longos períodos de trabalho em capela de fluxo laminar, pois é realizado em gota a gota com o uso de uma micropipeta12. Além disso, esse método requer 10 dias para formar completamente os esferoides ZFL (5 dias em gota suspensa + 5 dias em EO)12. Essas desvantagens podem limitar a aplicação de esferoides de peixes 3D para testes de toxicidade, especialmente considerando potenciais aplicações para priorização química e sustentabilidade do produto.
Assim, este artigo descreve um protocolo de cultura 3D capaz de gerar esferoides únicos de linhagens celulares ZFL (D. rerio hepatócito normal) e ZEM2S (embrião fase blastula de D. rerio) baseado no uso combinado de placas de fixação ultrabaixas de 96 poços (placas ULA) e um agitador orbital (22 mm de diâmetro rotacional). O método aplicado é simples e reprodutível, podendo gerar um grande número de esferoides de tamanho e forma semelhantes em um curto período (5 dias). As vantagens deste método podem apoiar a aplicação de modelos 3D de peixes para estudos de toxicidade aquática na indústria e no meio acadêmico, bem como o progresso da implementação de métodos alternativos para testes de ecotoxicidade.

<table><tbody><tr><td>Microplaca de fixação ultrabaixa de fundo redondo transparente de 96 poços, embalada individualmente, com tampa, estéril</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, pó, glicose alta, piruvato</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix, pó</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Processamento e análise de imagens em Java ( ImageJ) Software 1.52p</td><td>&nbsp; National Institutes of Health, EUA</td><td></td><td>Disponível em: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, pó</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 mm de diâmetro de rotação</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10x) com cálcio e magnésio</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Soro Fetal Bovino, qualificado, regiões aprovadas pelo</td><td>USDA Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio, pó,&nbsp; biorreagente para biologia molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S linha celular</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>Esta linha celular foi gentilmente doada pelo Professor Dr. Michael J. Carvan (Universidade de Wisconsin, Milwaukee, EUA)</td></tr><tr><td>Linha celular ZFL</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

método de cultura 3d de esferoides de linhagens celulares de zebrafish embrionárias e hepáticas

A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines

Linhagens celulares de peixes são modelos in vitro promissores para avaliação de ecotoxicidade; no entanto, os sistemas convencionais de cultura monocamada (cultura 2D) têm limitações bem conhecidas (por exemplo, longevidade da cultura e manutenção de algumas funções celulares in vivo ). Assim, culturas 3D, como os esferoides, têm sido propostas, uma vez que esses modelos podem reproduzir estruturas semelhantes a tecidos, recapturando melhor as condições in vivo . Este artigo descreve um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides com duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal). O protocolo consiste em plaquear as células em uma placa de fundo redondo, ultrabaixa e de 96 poços. Após 5 dias sob agitação orbital (70 rpm), um único esferoide por poço é formado. Os esferoides formados apresentam tamanho e forma estáveis, e este método evita a formação de múltiplos esferoides em um poço; assim, não é necessário escolher esferoides de tamanhos semelhantes. A facilidade, velocidade e reprodutibilidade deste método esferoide o tornam útil para testes in vitro de alto rendimento.

Esferoides únicos por poço com tamanho e forma estáveis são formados por este método. A Figura 2 ilustra o processo de formação de esferoides simples de células ZFL e ZEM2S em um poço de uma placa ULA sob agitação orbital (70 rpm). As linhagens celulares ZFL e ZEM2S apresentam comportamentos diferentes em cultura 3D. A linhagem celular ZEM2S apresenta características que conferem a capacidade de formar prontamente uma forma esferoidal desde o primeiro dia de agitação orbital (Figura <strong ...

Aqui, apresentamos um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides de duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal).

Método de Cultura 3D de Esferoides de Linhagens Celulares de Zebrafish Embrionárias e Hepáticas

Fish cell lines are promising in vitro models for ecotoxicity assessment; however, conventional monolayer culture systems (2D culture) have well-known ...

Este protocolo pode facilmente gerar esferoides de zebrafish, um modelo 3D in vitro com diferentes potenciais aplicações em testes de toxicidade em peixes. Este é um método simples e rápido para gerar esferoides únicos de linhagens celulares de peixe-zebra muito semelhantes em tamanho e forma. Se você seguir todas as etapas descritas corretamente, não se deve encontrar problemas.Os esferoides do peixe-zebra podem beneficiar muito o mecanismo, a exploração dos efeitos dos produtos químicos nos peixes, o que ajuda a melhorar a avaliação da segurança ambiental de produtos como cosméticos. Quem vai demonstrar o procedimento será Irisdoris Rodrigues de Souza, doutora em genética pelo meu laboratório. Para começar, pegue um frasco T75 de células de peixe-zebra em torno de 80% de confluência.Retirar o meio completo e lavar as células adicionando PBS 0,01 molar ao frasco de cultura com uma pipeta. Lavar o balão de cultura com PBS agitando suavemente o balão e, em seguida, retirar o PBS. Adicionar três mililitros de EDTA 0,5 milimolar de tripsina ao balão de cultura e incubar a 28 graus Celsius durante três minutos.Para o descolamento das células do frasco, toque suavemente no balão para libertar as células. E, em seguida, parar a digestão de tripsina adicionando três mililitros de meio de cultura completo ao frasco. Usando uma pipeta, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros e centrífuga a 100 G por cinco minutos.Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicione um mililitro do meio completo para a respectiva linha celular em uso e ressuspenda o pellet usando uma micropipeta. Adicione 10 microlitros da suspensão celular e 10 microlitros de corante azul de Trypan a um microtubo para contar as células e avaliar sua viabilidade.Misture a suspensão celular e o corante usando uma pipeta e transfira 10 microlitros dessa mistura para uma câmara de Neubauer. Conte as células nos quatro grandes quadrados ou quadrantes colocados nos cantos da câmara, considerando viáveis as células que não utilizam o azul de Trypan. Em seguida, calcule o número de células viáveis usando a equação mostrada na tela.Multiplique esse número de célula por dois para calcular o número final de célula na suspensão de célula. Depois de calcular o número de células, ajuste a suspensão celular para a placa de 200 microlitros dessa suspensão por poço de uma placa ULA de fundo redondo de 96 poços com o número de células necessárias para cada linha celular. Prepare a suspensão com a concentração ajustada de células em um reservatório médio e misture-a usando uma micropipeta multicanal sem formar espuma ou bolhas.Adicione 200 microlitros da suspensão celular ajustada a cada poço da placa ULA de fundo redondo. usando uma pipeta multicanal. A placa deve ser selada com Parafilm ou folha de vedação adesiva para evitar a evaporação do meio de cultura da placa de 96 poços.Incubar a placa em um agitador orbital a 70 RPM por cinco dias em uma incubadora de 28 graus Celsius sem dióxido de carbono. Após cinco dias, observar os esferoides em microscópio de luz invertida para avaliar os esferoides gerados. Para medir sua forma e tamanho, obtenha fotos dos esferoides e use um software para processar e analisar as imagens.Depois de configurar o software para medir uma área selecionada com base em uma escala conhecida, selecione o lado externo do esferoide para determinar sua área e circularidade. A área do esferoide é usada para determinar seu tamanho calculando o diâmetro, d, e o software fornece a circularidade do esferoide por uma fórmula que usa a área e o perímetro selecionados. Um agregado celular ZFL é formado no primeiro dia de agitação orbital.O agregado celular aumenta sua circularidade no terceiro dia, e atinge uma forma esferoidal adequada no quinto dia. Um esferoide ZFL de 16 dias na placa ULA é mostrado aqui. A linhagem celular ZEM2S forma esferoides a partir do primeiro dia de agitação orbital.O esferoide mantém sua forma e aumenta de tamanho no terceiro dia, e sua circularidade máxima é atingida no quinto dia. Um esferoide ZEM2S de 10 dias em uma placa ULA é mostrado aqui. O tamanho medido dos esferoides das linhagens celulares ZFL e ZEM2S e o índice de circularidade medido dos esferoides ZFL e ZEM2S são mostrados nesta figura.Esta imagem gráfica representa o padrão de crescimento dos esferoides ZFL e ZEM2S. Um esferoide ZFL e um esferoide ZEM2S formados após cinco dias de agitação orbital a 100 RPM são mostrados aqui. O padrão de crescimento e o índice de circularidade dos esferoides formados nas velocidades de rotação de 70 e 100 RPM são apresentados nesta figura.70 RPM é a velocidade mais adequada para formar esferoides ZFL e ZEM2S por este método. A coloração das membranas celulares pela lectina Alexa Fluor 594 e núcleos pela DAPI demonstra a integridade celular no núcleo dos esferoides. A fluorescência da resorufina formada por uma redução de AlamarBlue demonstra células viáveis no núcleo de ambos os esferoides.O ensaio de viabilidade do MTT em cultura 3D e cultura 2D da linhagem celular ZEM2S e ZFL é mostrado aqui, demonstrando que não há diferenças significativas. Ao tentar este procedimento, certifique-se de selar as placas para evitar a alteração do pH do meio de cultura e a evaporação nos poços. Os esferoides podem ser aplicados em uma variedade de ensaios in vitro para avaliar efeitos tóxicos no fígado de peixes ou estudos de desenvolvimento usando a linhagem celular embrionária ZEM2S.Este protocolo pode ajudar a impulsionar o desenvolvimento de testes in vitro em peixes, contribuindo para o progresso de estudos de ecotoxicidade não baseados em animais.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Nós descrevemos um método simples e rápida de gerar tecido 3D-como esferóides e sua potencial aplicação para quantificar as diferenças de interações célula-célula.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Os esferoides são um tipo de modelo de cultura de células 3D usado para representar com mais precisão o ambiente de uma célula em comparação com os modelos de monocamada de cultura de células 2D. No protocolo de exemplo, veremos os cientistas gerarem esferóides a partir de uma linha de células de câncer colorretal e aplicarem imagens de células vivas para rastrear o crescimento dos esferoides.

Geração de esferóides a partir de linhagens celulares: um método de cultura celular tridimensional (3D)

Somitogenesis é um processo de desenvolvimento rítmico que espacialmente padrões do eixo do corpo de embriões vertebrados. Anteriormente, desenvolvemos linhas de zebrafish transgênicos que usam repórteres fluorescentes para observar os genes cíclicos que impulsionam esse processo. Aqui, a cultura dispersas células destas linhas e imagem suas oscilações ao longo do tempo in vitro.

Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais

Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Aqui é proporcionado um método reprodutível para estudar a neurogénese adulto utilizando um ensaio neuroesfera derivado de todo o cérebro ou a partir de qualquer telencefálicos tectal ou regiões do cerebelo do cérebro adulto peixe-zebra. Além disso, descreve-se o procedimento para manipular a expressão de genes em neuroesferas de peixe-zebra.

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

Este protocolo descreve um método para isolar células únicas de embriões de peixe-zebra, enriquecendo para células de interesse, capturando células de peixe-zebra em sistemas multiplex de célula única baseados em microfluídica e avaliando a expressão gênica de células únicas.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Aqui, apresentamos o protocolo para a cultura tecidual 3D do eixo corporal posterior do zebrafish, possibilitando o estudo ao vivo da segmentação de vertebrados. Este modelo de explant fornece controle sobre o alongamento do eixo, alteração de fontes de morfógeno e imagem viva de nível de tecido de resolução subcelular.

Uma cultura de explanta de cauda 3D para estudar segmentação de vertebrados em zebrafish

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Apresentamos um protocolo para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade e sua caracterização fenotípica usando captura de imagens e proteômica.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

Os organoides revolucionam a modelagem personalizada de tecidos para desenvolvimento de órgãos, descoberta de medicamentos e pesquisa de doenças. A engenharia organoide avança na criação de tecidos sintéticos intrincados. O objetivo é integrar morfogênese, tecnologia de assembloides e biomatrizes para avançar na engenharia de tecidos. Este protocolo auxilia na modelagem da organogênese hepática e no estabelecimento de diretrizes para a construção de tecidos sintéticos.

Técnicas de cultivo in vitro para modelar a organogênese hepática, construir assembleides,

Aprenda a gerar esferoides 3D de linhagens celulares de zebrafish ZEM2S e ZFL para testes de toxicidade. Este método simples e rápido facilita estudos de segurança ambiental sem uso de animais.

Método de Cultura 3D de Esferoides de Linhagens Celulares de Zebrafish Embrionárias e Hepáticas

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