Name: Modelo de silicose em camundongos estabelecido por inalação repetida de pó de sílica cristalina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de silicose em camundongos usando inalação repetida de pó de sílica cristalina via gotas nasais. Este método prático simula eficientemente a progressão da doença humana sem causar lesões mecânicas.

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Este estudo foi apoiado pelo Programa de Inovação de Sinergia Universitária da Província de Anhui (GXXT-2021-077) e pelo Fundo de Inovação de Pós-Graduação da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui (2021CX2120).

Todos os procedimentos seguiram as diretrizes do National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publication No. 8023, revisado em 1978) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui.
1. Manejo e alimentação de camundongos
<ol><li>Atribuir 20 camundongos machos C57BL/6 saudáveis aos grupos experimental ou veículo em uma proporção de 1:1. Aclimatar os ratos ao novo ambiente por 1 semana.</li>
	<li>Forneça um tempo de luz constante de 12 h por dia. Use um interruptor de controle de tempo para um tempo preciso.</li>
</ol>2. Preparação da suspensão da CDT
<ol><li>Pelo menos 1 dia antes de gotejar nasalmente, triture a sílica em uma argamassa de ágata por 0,5 h.</li>
	<li>Observe o tamanho e a forma das partículas de cristal. Tire fotografias representativas usando microscopia eletrônica de varredura (MEV).<ol><li>Use uma fita condutora para prender as partículas para preparar a amostra para MEV. Use um secador de cabelo para soprar suavemente as partículas de silício que não estão firmemente ligadas.</li>
		<li>Evacue a câmara de amostra, ligue a alta pressão e capture a imagem. NOTA: A distância de trabalho (WD) entre a lente e a amostra é de 5,9 mm, a tensão de aceleração é de 2,0 kV e a ampliação (Mag) é de 100.000x, usando o detector SignalA. As partículas são dispersas com cristalização irregular, e aproximadamente 80% têm um diâmetro de 1-5 μm (Figura 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Fazer uma suspensão de DSC estéril de 20 mg/mL. Diluir o refrigerante com soro fisiológico estéril e misturá-lo com um agitador ultrassônico (40 kHz, 80 W) à temperatura ambiente (TR) por 30 min.</li>
	<li>Mexa e misture bem a suspensão de refrigerante num misturador de vórtices durante 10 s antes de administrar os gotejamentos nasais.</li>
</ol>3. Administração de gotejamentos nasais em camundongos
<ol><li>Anestesiar rapidamente um camundongo com isoflurano a 2% na dose de 3,6 mL/h em um aparelho de anestesia (Figura 1B, painel esquerdo). OBS: A anestesia deve ser realizada em exaustor para evitar a inalação do anestésico pelo técnico. Certifique-se da profundidade adequada da anestesia, observando a mudança de respiração rápida e irregular para um estado lento e estável nos camundongos.</li>
	<li>Gotejamento de 50 μL do DSC por via nasal dentro de 4-8 s (Figura 1B, direita).<ol><li>Para o gotejamento nasal, coloque a cabeça do camundongo na articulação metacarpofalangeana do pesquisador com a ponta do dedo indicador.</li>
		<li>Mantenha o mouse em decúbito ventral, com quatro dedos levemente flexionados e a ponta do polegar tocando levemente o lábio inferior do mouse para endireitar as vias aéreas. Evite tocar a faringe para provocar o reflexo de vômito.</li>
		<li>Aspirar 50 μl de líquido utilizando uma pipeta de 200 μl. Solte o líquido na cavidade nasal do rato em três a quatro doses divididas, dependendo da frequência respiratória do rato. Cada instilação deve consistir de 15 a 20 μl de líquido. Administrar os gotejamentos uma vez a cada 3 dias, 5x dentro de 12 dias. Trate o rato de controlo com uma quantidade igual de soro fisiológico.</li>
	</ol></li>
	<li>Massageie suavemente a área cardíaca do mouse 5x-10x por 5 s.<ol><li>Segure o corpo do mouse com a palma da mão, aperte a pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o indicador e fixe os membros posteriores do mouse com os outros dedos. Em seguida, pressione suavemente a área de batimento cardíaco do mouse com o dedo indicador da outra mão 5-10 vezes em um período de 5 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando a respiração do rato tiver estabilizado, coloque-o numa gaiola de recuperação com uma almofada de aquecimento e observe até que se recupere da anestesia e, em seguida, devolva o rato à sua gaiola de casa. Sacrifique o rato aos 31 dias.</li>
</ol>4. Coleta dos tecidos pulmonares e preparação de um corte de parafina
<ol><li>Injetar 0,18 mL de hidrato de cloral a 10% por via intraperitoneal, garantindo que os camundongos não respondam à estimulação dos dedos dos pés ou da cauda (realizada com a pinça dentada). Em seguida, prossiga para a próxima etapa.</li>
	<li>Fixe os membros do rato em uma placa de teste de espuma e borrife com álcool 75% para umedecer o pelo. Remova a maioria das costelas torácicas na linha média da clavícula e abra a cavidade torácica dos ratos para expor o coração e os pulmões.</li>
	<li>Cortar imediatamente o átrio direito com tesoura cirúrgica oftálmica e injetar lentamente 20 mL de tampão fosfato (PBS) da ponta do coração no batimento atrial esquerdo com a maior amplitude para permitir que todo o sangue flua. Em seguida, remova o lobo inferior do pulmão direito e armazene-o a -80 °C para análise de western blotting.</li>
	<li>Manter a perfusão de 10 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% no mesmo local após a injeção de PBS. Coletar o pulmão remanescente e preservar a amostra em 30 mL de PFA a 4% para análise anatomopatológica.</li>
	<li>Após 72 h de fixação, embutir os espécimes em parafina.<ol><li>Desidratar os tecidos através de uma série graduada de diluições de etanol (EtOH) em água deionizada (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) por 1 h cada em TR. Limpar a amostra em duas lavagens de xileno por 1 h cada.</li>
		<li>Infiltrar-se nas amostras com a cera de parafina fundida aquecendo a 50 °C durante 2 h. Repita esse processo em outro cilindro. Resfriar os moldes de cera com lenços por 1 h para endurecer.</li>
		<li>Depois que a cera endurecer e o tecido tiver sido incorporado, use uma máquina de corte de parafina para cortar o tecido a 5 μm. Os passos precisos de seccionamento e montagem das lâminas foram descritospreviamente11. NOTA: A perfusão tecidual suficiente é indicada pelo desenvolvimento de contração muscular e torção da cauda em forma de "S" ou flexão após receber 10 mL de PFA a 4%.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Realização da coloração de hematoxilina e eosina (HE)
<ol><li>Aqueça os tecidos embebidos em parafina em uma placa quente (60 °C) por mais de 4 h para permitir a adesão às lâminas e melhorar a desparafinação.</li>
	<li>Descerpar e hidratar seções de parafina. Mergulhe as lâminas com amostras em xileno 2x por 30 min de cada vez. Em seguida, mergulhe-os em etanol anidro, depois álcool 95%, 85%, 75% e água deionizada por 5 min, respectivamente.</li>
	<li>Realizar coloração de hematoxilina e eosina. Manchar os tecidos em um balde de coloração de hematoxilina por 10 min. Enxágue com água corrente suave por 5 min. Em seguida, mergulhe as lâminas no balde de coloração de eosina por 10 s.</li>
	<li>Desidratar as amostras em etanol anidro 75%, 85%, 95% e anidro por 5 min cada. Limpe os cortes de tecido mergulhando-os em xileno por 5 min. Sele a seção com aproximadamente 60 μL de gotas de resina neutra. Coloque a tampa deslize sobre a seção e abaixe-a cuidadosamente para evitar bolhas de ar.</li>
</ol>6. Realização da coloração de Masson
<ol><li>Desencenar e hidratar as amostras de parafina, conforme mencionado na etapa 5.2. Em seguida, corar os núcleos celulares com hematoxilina de Weigert a 50% por 10 min. Mergulhe o tecido em liquefação ácida de etanol por 10 s e lave suavemente as lâminas de tecido com água corrente para o rubor dos núcleos. NOTA: Preparar a solução corante de hematoxilina de Weigert imediatamente antes do uso.</li>
	<li>Manchar as amostras com gotas de solução corante vermelha de Lichun (40 μL para cada lâmina de tecido) por 7 min e lavá-las com uma solução de trabalho de ácido fraco (ácido clorídrico a 30%) por 1 min para remover o corante vermelho Lichun não ligado.</li>
	<li>Mergulhá-los em álcool 95% por 20 s e desidratá-los 2x com etanol anidro por 1-3 s cada. Em seguida, limpar os tecidos com xileno e selá-los com 60 μL de gotas de resina neutra, conforme mencionado no passo 5.4.</li>
</ol>7. Realização da coloração vermelha do Sirius
<ol><li>Descerpar e hidratar as secções de parafina, tal como referido no passo 5.2.</li>
	<li>Infiltrar-se nos cortes por 1 h com solução corante Sirius red.</li>
	<li>Manchar os núcleos celulares das amostras por 8-10 min com solução de coloração de hematoxilina Mayer. Enxágue suavemente com água corrente por 10 min. Em seguida, desidrate e limpe as lâminas de tecido. Selá-los conforme mencionado no passo 5.4.</li>
</ol>8. Realização de imunohistoquímica
<ol><li>Descerpar e hidratar as amostras de parafina, tal como descrito no passo 5.2.</li>
	<li>Infiltrar-se nos espécimes com uma solução de recuperação de antígeno EDTA de 3 mg/mL de cerca de 30 mL. Ferva por 20-30 min. Lave os tecidos com água deionizada e, em seguida, incube-os em solução tamponada com fosfato contendo Tween-20 a 0,5% (PBST) por 5 min.</li>
	<li>Deixar as amostras de molho por 15 min com solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% para inativar a peroxidase endógena nos espécimes. Lave-os 3x com PBST por 5 min de cada vez. NOTA: A solução de peróxido de hidrogénio a 0,3% deve ser fresca num ambiente à prova de luz.</li>
	<li>Permeabilizar a membrana dos espécimes por 15 min com solução de Triton-100 a 0,3%. Em seguida, bloquear com 30-40 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 5% por 1 h.</li>
	<li>Remova a solução de bloqueio. Adicionar anticorpos primários diluídos NF-κB (diluição 1:200) e CD68 (diluição 1:1.000) e incubar os espécimes durante a noite a 2-8 °C em uma caixa úmida IHC de lâmina de microscópio para evitar evaporação e luz.</li>
	<li>No dia seguinte, transfira-os para RT por 1 h. Em seguida, lave-os com PBST 3x por 5 min cada.</li>
	<li>Incubar as amostras durante 1 h em anticorpos secundários de peroxidase de rábano de coelho anti-rato (razão de diluição 1:500) em RT e lavá-las com PBST 3x durante 5 minutos cada. NOTA: Ambos os anticorpos primários e secundários foram diluídos com BSA a 5%.</li>
	<li>Incubar as amostras com o substrato 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) correspondente ao anticorpo marcado com enzima por 5-20 min. Pare a reação com água deionizada quando a intensidade de coloração ideal for atingida. NOTA: A solução DAB precisa ser preparada na hora e protegida da luz. A reação de desenvolvimento de cor deve ser observada em tempo real sob o microscópio para determinar quando parar de colorir. Espécimes positivos exibem coloração intensa, enquanto espécimes negativos não desenvolvem cor.</li>
	<li>Contra-corar as amostras por 30 s com hematoxilina de Weigert. Em seguida, enxágue os tecidos em água corrente por 1 min. Em seguida, desidrate, limpe e sele as lâminas de tecido, conforme mencionado no passo 5.4.</li>
</ol>9. Realização de análise de western blotting
<ol><li>Lisar os tecidos pulmonares para extrair proteínas. Adicionar 200 μL de solução de trabalho RIPA a 20 mg de tecido pulmonar.</li>
	<li>Homogeneizar o tecido no gelo por 5 min usando um moedor elétrico portátil e incubar por 1 h no gelo com agitação suave. Em seguida, centrifugar o homogeneizado a 4 °C por 15 min a 14.800 x g.</li>
	<li>Coletar o sobrenadante e determinar a concentração de proteína com o kit de ensaio de proteína BCA. Fazer a solução de armazenamento de proteína com RIPA a 6 μg/μL de proteína. Adicionar 20 μL de tampão de carga 5x aos 80 μL do lisado proteico. Interromper a estrutura da proteína secundária aquecendo os tubos de microcentrífuga contendo proteínas em um banho de metal (100 °C) por 20 min.</li>
	<li>Após arrefecimento, aliquotar 100 μL da solução de armazenamento de proteínas em cada tubo e armazenar as amostras num frigorífico de -80 °C. Diluir a concentração de proteína para 2–3 μg/μL com 1x tampão de carga antes da eletroforese. NOTA: O processo de extração de proteínas deve ser realizado em gelo. Para a solução de trabalho RIPA, adicionar 1 μL de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a 100 mM a 99 μL de RIPA para inibir a degradação de proteínas fosforiladas.  Prepare 1x buffer de carregamento diluindo 5x buffer de carregamento com RIPA na proporção de 1:4.</li>
	<li>Adicione 20 μg de amostras a cada poço e passe o gel. Para géis concentrados a 5%, use 80 V por 20 min para que as proteínas sejam eletroforadas a partir do mesmo ponto de partida. Para géis isolados a 10%, correr a 100 V durante 1 h para permitir que as proteínas de diferentes pesos moleculares sejam separadas tanto quanto possível.</li>
	<li>Pré-ativar a membrana de PVDF com metanol por 20 s. Transferir as proteínas para a membrana de PVDF usando o método de transferência úmida com corrente de 400 mA por 1-2 h. NOTA: Certifique-se de que o tanque de eletroforese e o tanque de eletrotransferência estejam horizontais. Resfrie todo o tanque com gelo, pois o processo de transferência de membrana gera muito calor.</li>
	<li>Lave a membrana com solução de TBST durante 5 min de cada vez, 5x. Em seguida, bloqueie com 5% de BSA ou 5% de leite desnatado por 1 h. Diluir os anticorpos primários NF-κB (1:1.000) e β-actina (1:1.000) com BSA a 5%. Submergir as tiras na solução de anticorpos e agitá-las suavemente durante a noite a 2-8 °C.</li>
	<li>Lave as tiras com PBST. Em seguida, diluir o anticorpo secundário de cabra anticoelho conjugado à horseradish peroxidase (HRP) (1:10.000) e incubá-los no anticorpo secundário diluído por 1 h na RT com agitação suave.</li>
	<li>Prepare um revelador de quimioluminescência aprimorada (ECL), solte-o na tira e incube por 3 min.</li>
	<li>Exponha a tira a um imageador de gel por 20 s. Meça o valor de cinza da tira para avaliar o nível de proteína pelo software do sistema. Use β-actina como controle interno.</li>
</ol>

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<li>Mansouri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+exosomes+prevent+and+revert+experimental+pulmonary+fibrosis+through+modulation+of+monocyte+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes.</a> JCI Insight. 4 (21), 128060(2019).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Modelos de silicose em camundongos são cruciais para o estudo da patogênese e tratamento da silicose. Este protocolo descreve um método para preparar um modelo de silicose em camundongos através de exposição nasal repetida. Este método permite o estudo das características patológicas da silicose induzida por diferentes tempos de exposição. Os camundongos foram anestesiados em um ventilador e sua frequência respiratória foi monitorada. A frequência respiratória inicial curta e rápida diminuiu gradualmente e se aprofundou ...

Os trabalhadores estão inevitavelmente expostos à poeira irregular de sílica cristalina (MSF), que pode ser inalada e é mais tóxica em vários contextos ocupacionais, incluindo mineração, cerâmica, vidro, processamento de quartzo e concreto 1,2. Uma condição crônica de inalação de poeira conhecida como silicose causa fibrose pulmonar progressiva3. De acordo com dados epidemiológicos, a incidência da silicose vem diminuindo globalmente nas últimas décadas, mas, nos últimos anos, vem aumentando e acometendo pessoas maisjovens4,5,6. O mecanismo subjacente da silicose representa um desafio significativo para a pesquisa científica devido ao seu início insidioso e período prolongado de incubação. Ainda não se sabe como a silicose se desenvolve. Além disso, nenhuma medicação atual pode interromper a progressão da silicose e reverter a fibrose pulmonar.
Os modelos atuais de silicose em camundongos envolvem a ingestão traqueal de uma suspensão mista de DSC. Por exemplo, a administração de DSF nos pulmões adotando o trauma da traqueia cervical após a anestesia não atende à exposição humana repetida à poeira do corante7. O impacto da exposição à poeira ambiente sobre os indivíduos pode ser estudado expondo-os ao MSC na forma de aerossóis, o que reflete com maior precisão as concentrações ambientais dessa substância tóxica8. No entanto, o DSC ambiental não pode ser simplesmente inalado diretamente para os pulmões devido à estrutura fisiológica única do nariz de camundongo9. Além disso, o equipamento associado a essa tecnologia é caro, o que fez com que os pesquisadores reavaliassem o modelo10 da silicose em camundongos. Inalando a suspensão do DSC por gotejamento nasal cinco vezes em 2 semanas, foi possível construir um modelo dinâmico de silicose. Este modelo é consistente e seguro, ao mesmo tempo que é fácil de usar. É importante notar que este estudo permite a inalação repetida de DSC em camundongos. Espera-se que o modelo de silicose em camundongos criado através desse procedimento seja mais benéfico para as necessidades de pesquisa.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 0,5 mL</td><td>Biosharp</td><td>BS-05-M</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina neutra fixador</td><td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Desinfetante</td> de álcool NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CD68</td><td>Abcam</td><td>ab125212</td><td></td></tr><tr><td>Solução de recuperação de antígeno de citrato</td><td>biosharp ciência da vida</td><td>BL619A</td><td></td></tr><tr><td>DAB kit cromogênico</td><td>NJJCBio</td><td>W026-1-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilbenzeno</td> West <td>Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína BCA aprimorado</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0009</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina e Eosina (H& E)</td> <td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0105S</td><td></td></tr><tr><td>HRP substrato</td><td>Millipore Corporation</td><td>P90720</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugado Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)</td> <td>Proteintech</td><td>Sa00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Ácido iceacético</td><td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Ciência</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração tricrômica da Masson</td><td>Solarbio</td><td>G1340</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Macklin</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>Millipore</td><td>AXYMCT150CS</td><td></td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8242S</td><td></td></tr><tr><td>Banho de metal termostático oscilatório</td><td>Abson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de incorporação de parafina</td><td>Precision (Changzhou) Medical Equipment Co.</td><td>Fatiador de parafina PBM-A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jinhua Kratai Instruments Co.</td><td>Tampão fosfato NA</td><td></td></tr><tr><td>(PBS)&nbsp;</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina fisiológica</td><td>O Primeiro Hospital Popular da Cidade de Huainan</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Beyotime Biotechnological</td><td>ST505</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz polarizada</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Balança de precisão</td><td>Acculab</td><td>ALC-110.4</td><td></td></tr><tr><td>Prism7.0</td><td>GraphPad&nbsp;</td><td>Versão 7.0</td><td></td></tr><tr><td>Membranas PVDF</td><td>Millipore</td><td>3010040001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA tampão de lise</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>RODI IoT sistema de purificação de água multifuncional inteligente</td><td>RSJ</td><td>RODI-220BN</td><td></td></tr><tr><td>Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker</td><td>Scilogex</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit de preparação de gel</td><td>Beyotime Biotecnologia</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>Sigma de dióxido de silício</td><td></td><td>#BCBV6865</td><td></td></tr><tr><td>Sirius coloração vermelha</td><td>Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>181012</tr><tr><td>Máquina de anestesia para pequenos animais</td><td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td><td>ZL-04A</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta Universais (0.1&ndash; 10 &micro; L)</td><td>KIRGEN</td><td>KG1011</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta Universais (100&ndash; 1000 &micro; L)</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta Universais (1&ndash; 200 &micro; L)</td><td>KIRGEN</td><td>KG1212</td><td></td></tr><tr><td>Vortex&nbsp; misturador&nbsp;</td><td>VWR</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS GeminiSEM 500</td><td>Zeiss Alemanha</td><td>SEM 500</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actin</td><td>Bioss</td><td>bs-0061R</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de silicose em camundongos estabelecido por inalação repetida de pó de sílica cristalina

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

A silicose pode ser causada pela exposição à poeira de sílica cristalina respiratória (MSF) em ambiente industrial. A fisiopatologia, o rastreamento e o tratamento da silicose em humanos têm sido extensivamente estudados usando o modelo de silicose em camundongos. Ao fazer repetidamente camundongos inalarem refrigerante em seus pulmões, os camundongos podem imitar os sintomas clínicos da silicose humana. Essa metodologia é prática e eficiente em termos de tempo e débito e não causa lesão mecânica no trato respiratório superior devido à cirurgia. Além disso, esse modelo pode mimetizar com sucesso o processo de transformação aguda/crônica da silicose. Os principais procedimentos foram os seguintes. O pó CSD esterilizado de 1-5 μm foi totalmente triturado, suspenso em solução salina e disperso em banho-maria ultrassônico por 30 min. Camundongos sob anestesia induzida por isoflurano mudaram de respiração rápida superficial para aspiração profunda e lenta por aproximadamente 2 s. O rato foi colocado na palma de uma mão, e a ponta do polegar tocou suavemente a borda labial da mandíbula do rato para endireitar as vias aéreas. Após cada expiração, os camundongos respiraram a suspensão de sílica gota a gota através de uma narina, completando o processo dentro de 4-8 s. Depois que a respiração dos camundongos se estabilizou, seu peito foi acariciado e acariciado para evitar que o DSC inalado fosse tossido. Os camundongos foram então devolvidos à gaiola. Em conclusão, esse modelo pode quantificar DSC ao longo da passagem fisiológica típica de partículas minúsculas para o pulmão, do trato respiratório superior aos bronquíolos terminais e alvéolos. Também pode replicar a exposição recorrente dos funcionários devido ao trabalho. O modelo pode ser realizado por uma pessoa e não precisa de equipamentos caros. Simula de forma conveniente e eficaz as características da doença da silicose humana com alta repetibilidade.

A patogênese potencial da silicose em camundongos foi investigada usando o método proposto. Verificamos que o peso corporal dos camundongos do grupo experimental diminuiu significativamente em relação ao grupo controle e que o peso corporal se recuperou lentamente após a cessação da exposição. Devido à dose otimizada usada aqui, nenhuma mortalidade foi observada em camundongos expostos à sílica neste experimento. O roteiro técnico de gotejamento nasal repetido para DSC é mostrado em (Figura 1</strong...

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo de silicose em camundongos através da exposição repetida a suspensões de sílica via gotejamento nasal. Este modelo pode eficiente, convenientemente e flexivelmente mimetizar o processo patológico da silicose humana com alta repetibilidade e economia.

Modelo de silicose em camundongos estabelecido por inalação repetida de pó de sílica cristalina

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

No modelo descrito de silicose em camundongos gerada por infusão intralaser de pó de sílica cristalina, todas as suspensões de refrigerantes simularam várias vezes a ocorrência e o desenvolvimento de silicose humana em grande medida. Este método é de economia de tempo e de nível, além de prático e eficaz. Além disso, não causa nenhuma lesão mecânica no trato respiratório superior devido à operação.Este método também pode ser usado para preparar modelos de doenças de vírus, bactérias, etc. Quem demonstrará o procedimento será Hangbing Cao, aluno de mestrado do meu laboratório, habilidoso na preparação do modelo de camundongo silicose. Comece com a preparação do pó de sílica cristalina ou refrigerante pelo menos um dia antes de administrar os gotejamentos nasais.Para isso, triture a sílica em uma argamassa de ágata por meia hora. Para verificar o tamanho e a forma das partículas, prepare a amostra para microscopia eletrônica de varredura ou MEV usando fita condutora para ligar as partículas de silício. Usando um secador de cabelo, sopre suavemente as partículas não firmemente coladas antes de prosseguir para capturar a imagem.Em seguida, misture a sílica moída e o soro fisiológico estéril em uma concentração de 20 miligramas por mililitro usando um agitador ultrassônico. Por fim, coloque a suspensão preparada por 10 segundos. Administrar 50 microlitros de MSD ao camundongo anestesiado por gotejamento nasal por quatro a oito segundos.Trate o mouse de controle com uma quantidade igual de soro fisiológico, em seguida, segurando o corpo do mouse com a palma da mão, aperte a pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o indicador enquanto fixa os membros posteriores do mouse com os outros dedos. Pressione suavemente a área de batimento cardíaco do mouse com o outro dedo indicador cinco a 10 vezes por cinco segundos. Aqueça o tecido pulmonar embutido em parafina em uma placa quente a 60 graus Celsius por mais de quatro horas.Para desencecar e hidratar a seção de parafina, mergulhe a lâmina em xileno por 30 minutos duas vezes, depois mergulhe sequencialmente a lâmina por cinco minutos cada em anidro 95%85% e 75% etanol e, finalmente, em água deionizada, coloque a lâmina no balde corante de hematoxilina por 10 minutos antes de enxaguar suavemente em água corrente por cinco minutos. Mergulhe-o no balde de coloração de eosina por 10 segundos. Após desidratar a amostra em 75%85%95% e etanol anidro por cinco minutos cada, limpar o corte do tecido mergulhando-o em xileno por cinco minutos e selá-lo com aproximadamente 60 microlitros de gotas de resina neutra.Coloque cuidadosamente o slide da tampa sobre a seção. Para a coloração de Masson, corar as amostras de parafina desparafinadas e hidratadas com hematoxilina de Weigert a 50% recém-preparada por 10 minutos e, após imersão do tecido em liquifação ácida de etanol por 10 segundos, enxaguar suavemente a lâmina com água corrente para o rubor dos núcleos. Em seguida, corar a amostra com gotas de solução corante vermelha por sete minutos e lavar com solução de trabalho de ácido clorídrico a 30% por um minuto.Depois de mergulhar a lâmina em álcool a 95% por 20 segundos, desidratar a amostra com etanol anidro por um a três segundos duas vezes e, como demonstrado anteriormente, limpar e selar a amostra. Para a coloração Sirius red, infiltrar o corte desparafinado e hidratado por uma hora com solução corante Sirius red e, em seguida, corar os núcleos celulares por oito a 10 minutos com solução de coloração hematoxlyn Mayer. Enxágue suavemente em água corrente por 10 minutos antes de desidratar, limpar e selar a lâmina.Infiltrar-se na amostra de parafina desparafinada e hidratada com 30 mililitros de uma solução de recuperação de antígeno EDTA de três miligramas por mililitro. Ferver a amostra por 20 a 30 minutos antes de lavá-la com água deionizada e incubá-la em PBST por cinco minutos. Deixe a amostra de molho por 15 minutos com solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% recém-preparada e lave-a três vezes por cinco minutos cada com PBST.Permeabilizar a membrana do espécime por 15 minutos com solução de Triton 100 a 0,3% e bloquear com 30 a 40 microlitros de albumina de soro bovino a 5% ou BSA por uma hora. Depois de remover a solução de bloqueio, adicionar anticorpos primários adequadamente diluídos NF-kappa B e CD-68 e incubar o espécime durante a noite a dois a oito graus Celsius em uma caixa úmida IHC de lâmina de microscópio. No dia seguinte, após transferir a amostra para a temperatura ambiente por uma hora, lave-a três vezes por cinco minutos cada com PBST.Incubar a amostra durante uma hora em anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano de coelho anti-rato à temperatura ambiente. Após a incubação, lavar as amostras novamente três vezes por cinco minutos cada com PBST e, em seguida, incubar a amostra com o substrato DAB correspondente ao anticorpo marcado com enzima por cinco a 20 minutos. Após extinguir a reação com água deionizada, contracorar a amostra por 30 segundos com hematoxilina de Weigert.Enxágue em água corrente por um minuto, desidrate, limpe e sele o tecido. Antes de proceder à análise de western blot, homogeneizar o tecido com solução de trabalho RIPA sobre gelo por cinco minutos usando um moedor elétrico portátil. Incubar durante uma hora no gelo com agitação e centrifugar o homogeneizado a 14, 800 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius.Colete o sobrenadante e determine a concentração de proteína com um kit de ensaio de proteína BCA. Adicione 20 microlitros de tampão de carregamento 5X ao sobrenadante e, em seguida, aqueça os seis microgramas por microlitro de solução de armazenamento de proteína preparada com RIPA em um banho de metal a 100 graus Celsius por 20 minutos. Armazenar alíquotas de 100 microlitros da solução proteica em cada tubo a menos 80 graus Celsius.Para eletroforese, diluir as alíquotas para dois a três microgramas por microlitro com lisado de RIPA e, em seguida, adicionar 20 microgramas de amostra por poço para executar o gel. Transferir a proteína para uma membrana de PVDF pré-ativada com metanol por 20 segundos usando o método de transferência úmida com corrente de 400 miliamperes por uma a duas horas. Após lavar a membrana cinco vezes por cinco minutos cada com solução de PBST, bloquear com BSA a 5% ou leite desnatado por uma hora.Submergir as tiras na solução de anticorpos primários contendo NF-kappa B e beta actina diluída com BSA a 5%. Agite as tiras suavemente durante a noite a dois a oito graus Celsius antes de lavá-las com PBST. Em seguida, incubar as tiras, primeiro no anticorpo secundário diluído por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave e, em seguida, com revelador de quimioluminescência aprimorado por três minutos.Exponha a tira a um imageador de gel por 20 segundos e meça o valor de cinza da tira para avaliar o nível de proteína pelo software do sistema. As imagens de MEV do MSC mostraram que as partículas tinham forma irregular. A coloração Sirius red realizada para medir a deposição de colágeno mostrou que a progressão da fibrose pulmonar em camundongos foi significativamente acelerada após a exposição ao DSC por um mês.A microscopia polarizadora revelou três tipos diferentes de fibras colágenas, das quais as fibras colágenas tipo um mostradas em vermelho são um fator de risco para silicose, no entanto, nenhuma fibrose significativa foi encontrada no grupo veículo. Isso também foi indicado pelos respectivos escores de fibrose. A coloração HE do tecido pulmonar de camundongos tratados com DSC mostrou nódulos típicos de sílica caracterizados por necrose liquefeita após fagocitose de MSC no centro circundado por macrófagos na periferia.A coloração de Masson também mostrou que os nódulos estavam enriquecidos com MSC acompanhada de fibrose. A coloração imunoistoquímica do CD-68 revelou ainda a ampla presença de macrófagos no tecido pulmonar. A microscopia de luz polarizada mostrou que esses macrófagos haviam ingerido DSC, causando lesão pulmonar grave.A coloração imunoistoquímica mostrou maior marcação pelo NF-kappa B, indicando maior resposta inflamatória no grupo tratado com DSC do que no grupo veículo. O western blot representativo também mostrou que os camundongos tratados com DSC apresentaram maior expressão de NF-kappa B no pulmão, e a diferença na expressão entre os dois grupos foi significativa. Para evitar obstrução respiratória e promover a recuperação respiratória, a área cardíaca do camundongo deve ser massageada suavemente de cinco a 10 vezes, conforme demonstrado após um período de cinco segundos.Esse modelo pode explorar alguns mecanismos subjacentes da silicose e auxiliar na triagem terapêutica de drogas, além de estabelecer parâmetros cruciais, como dosagem e duração. Essa tecnologia oferece um meio conveniente, eficaz e econômico de expor modelos de camundongos a material particulado se isso adicionar bactérias. O monitoramento do comportamento de camundongos pode auxiliar na determinação dos efeitos potenciais da inalação de material particulado.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra um método para gerar um modelo de disseminação pleural em camundongos injetando suspensão de células de câncer de pulmão na cavidade torácica de um camundongo imunodeficiente.

Estabelecendo um modelo de camundongo de câncer de pulmão disseminado pleural

Este estudo descreve a geração bem sucedida de um novo modelo animal de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), repetidamente expondo ratos a concentrações elevadas de ozono.

Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

Vários modelos animais de fibrose pulmonar foram estabelecidos usando bleomicina para esclarecer a patogênese da fibrose pulmonar e encontrar novos alvos de drogas. No entanto, a maioria dos modelos de fibrose pulmonar direcionados ao tecido pulmonar tem administração desigual de medicamentos. Aqui, propomos um modelo de fibrose pulmonar uniforme induzida por nebulização de bleomicina nasal.

Um modelo de camundongo de fibrose pulmonar induzida por nebulização de bleomicina nasal

Este estudo descreve uma técnica para estabelecer um modelo de silicose em ratos com inalação de sílica por todo o corpo em uma câmara inalatória. Os ratos com silicose poderiam mimetizar de perto o processo patológico da silicose humana de maneira fácil, econômica e com boa repetibilidade.

Estabelecendo um modelo de silicose em ratos via exposição de corpo inteiro à sílica respirável

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Uso de Nicotina em Modelo de Camundongo Exposto à Sílica para Promover a Transição Epitélio-Mesenquimal Pulmonar

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Aprenda a estabelecer um modelo de silicose em camundongos usando inalação repetida de pó de sílica cristalina via gotas nasais. Este método prático simula eficientemente a progressão da doença humana sem causar lesões mecânicas.

Modelo de silicose em camundongos estabelecido por inalação repetida de pó de sílica cristalina

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