Name: Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Aprenda a gerar células dendríticas derivadas de monócitos bovinos para avaliar a imunogenicidade vacinal in vitro. Este método preenche uma lacuna crítica na vacinologia pecuária e serve como ferramenta valiosa para triagem de candidatos vacinais.

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Agradecemos à Dra. Eveline Wodak e à Dra. Angelika Loistch (AGES) por seu apoio na determinação do estado de saúde dos animais e por fornecer BTV, ao Dr. Bernhard Reinelt pelo fornecimento de sangue bovino e ao Dr. Bharani Settypalli e Dr. William Dundon da AIEA por conselhos úteis sobre os experimentos de PCR em tempo real e edição de linguagem, respectivamente.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este estudo demonstra um método padronizado in vitro para geração e fenotipagem de MoDCs bovinas e seu uso subsequente na medição da imunogenicidade vacinal de uma vacina comercial (por exemplo, RV). MoDCs bovinas podem ser usadas como uma ferramenta para rastrear antígenos vacinais potenciais contra doenças de bovinos e prever seu potencial impacto clínico com base em respostas imunes antes de prosseguir para testes in vivo em animais. As MoDCs geradas foram identificadas com base em suas característic...

A vacinação veterinária representa um aspecto crucial da pecuária e da saúde, pois contribui para melhorar a segurança alimentar e o bem-estar animal, conferindo proteção contra doenças que afetam o setor pecuário globalmente1. Um método in vitro eficaz para avaliar a imunogenicidade de possíveis candidatas a vacinas ajudaria a acelerar o processo de desenvolvimento e produção de vacinas. Faz-se necessário, portanto, ampliar o campo dos ensaios imunológicos com metodologias inovadoras baseadas em estudos in vitro , pois isso ajudaria a desvendar a complexidade dos processos imunes relacionados à imunização e infecção por patógenos. Atualmente, estudos de imunização animal in vivo e estudos de desafio, que requerem amostras periódicas (por exemplo, sangue e baço), são usados para medir a imunogenicidade de vacinas candidatas e adjuvantes. Esses ensaios são caros, demorados e têm implicações éticas, pois, na maioria dos casos, a eutanásia dos animais é realizada ao final dos ensaios.
Como alternativa aos ensaios in vivo, células mononucleares do sangue periférico (CMSP) têm sido utilizadas para avaliar respostas imunes induzidas por vacinas in vitro2. As CMSP são uma população heterogênea de células composta por 70%-90% de linfócitos, 10%-20% de monócitos e um número limitado de células dendríticas (DCs, 1%-2%)3. As CMSP abrigam células apresentadoras de antígenos (APCs), como células B, monócitos e DCs, que patrulham constantemente o organismo em busca de sinais de infecção ou dano tecidual. As quimiocinas secretadas localmente facilitam o recrutamento e a ativação de APCs para esses locais, ligando-se a receptores de superfície celular. No caso dos monócitos, as quimiocinas direcionam seu destino para se diferenciarem em CD ou macrófagos4. Assim que as DCs encontram e capturam um patógeno, migram para órgãos linfoides secundários, onde podem apresentar antígenos peptídicos patogênicos processados utilizando proteínas de superfície classe I ou II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) para células T CD8+ ou células T CD4+, respectivamente, desencadeando uma respostaimune5,6.
O papel fundamental desempenhado pelas DCs na orquestração de uma resposta imune protetora contra vários patógenos as torna um interessante alvo de pesquisa para a compreensão dos mecanismos imunes intracelulares, especialmente na concepção de vacinas e adjuvantes contra agentes infecciosos7. Como a fração de DCs que pode ser obtida a partir de CMSP é bastante pequena (1%-2%), monócitos têm sido usados para gerar CDs in vitro8. Essas DCs derivadas de monócitos (MoDCs) foram inicialmente desenvolvidas como uma possível estratégia de tratamento na imunoterapia do câncer9. Mais recentemente, as MoDCs têm sido utilizadas para pesquisa de vacinas 10,11,12, sendo os monócitos clássicos o subtipo predominante (89%) para a produção de MoDC 13. A produção de MoDCs in vitro foi previamente obtida através da adição de fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) administrado em combinação com outras citocinas, como interleucina-4 (IL-4), fator de necrose tumoral α (TNF-α) ou IL-1314,15,16.
O sucesso de um ensaio in vitro de MoDC depende da capacidade das MoDCs maduras estimuladas por antígeno de modular a extensão e o tipo da resposta imune específica para o tipo de antígeno detectado17. O tipo de patógeno reconhecido e apresentado pelas MoDCs determina a diferenciação de células T helper (Th) CD4+ em células Th1, Th2 ou Th17 efetoras e é caracterizado por um perfil de citocinas secretoras específicas do patógeno. Uma resposta Th1 é induzida contra patógenos intracelulares e resulta na secreção de interferon-gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral beta (TNF-β), que modula a proteção fagocitária-dependente. A resposta Th2 é desencadeada contra organismos parasitários e é caracterizada pela secreção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que inicia a proteção humoral fagocítica-independente. Th17 oferece proteção neutrofófila dependente contra infecções bacterianas e fúngicas extracelulares mediadas pela secreção de IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 e TNF-α 18,19,20,21. Com base em estudos anteriores, observou-se que nem todos os patógenos se enquadram no perfil de citocinas esperado. Por exemplo, as MoDCs dérmicas, em resposta à infecção parasitária por Leishmania, estimulam a secreção de IFN-γ de células T CD4+ e células T CD8+, induzindo uma resposta Th1 pró-inflamatória protetora22.
Também foi demonstrado que, em MoDCs de frango preparadas com lipopolissacarídeo (LPS) de Salmonella, podem induzir uma resposta variável contra Salmonella typhimurium ativando respostas Th1 e Th2, enquanto Salmonella gallinarum induz uma resposta Th2 isoladamente, o que poderia explicar a maior resistência desta última à depuração de MoDC23. A ativação de MoDCs contra Brucella canis (B. canis) também foi relatada em MoDCs caninas e humanas, o que significa que isso poderia representar um mecanismo de infecção zoonótica24. As MoDCs humanas preparadas com B. canis induzem uma forte resposta Th1 que confere resistência à infecção grave, enquanto as MoDCs caninas induzem uma resposta Th17 dominante com uma resposta Th1 reduzida, levando subsequentemente ao estabelecimento de infecção crônica25. As MoDCs bovinas apresentam maior afinidade pelo vírus da febre aftosa (FMDV) conjugado com imunoglobulina G (IgG) em comparação com a FMDV não conjugada isoladamente, uma vez que as DCMs formam um complexo vírus-anticorpo em resposta às primeiras10. Em conjunto, esses estudos mostram como as MoDCs têm sido usadas para analisar a complexidade das respostas imunes durante a infecção por patógenos. As respostas imunes adaptativas podem ser avaliadas pela quantificação de marcadores específicos associados à proliferação linfocitária. O Ki-67, proteína intracelular detectada apenas em células em divisão, é considerado um marcador confiável para estudos de proliferação26 e, da mesma forma, CD25 expresso na superfície das células T durante a fase tardia de ativação corresponde à proliferação linfocitária27,28.
Este estudo demonstra um método padronizado para a geração in vitro de MoDCs bovinas seguido de sua aplicação em um ensaio imunológico in vitro utilizado para testar a imunogenicidade de vacinas. Uma vacina antirrábica (VR) comercialmente disponível foi utilizada para validar a eficácia deste ensaio. A ativação e proliferação de linfócitos T foram medidas por citometria de fluxo, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e ensaio imunoenzimático (ELISA) por meio da análise de marcadores de ativação celular bem estabelecidos, como Ki-67 e CD25, e da secreção de IFN-γ 28,29,30,31. Nenhum teste experimental em animais ou humanos é realizado durante o ensaio MoDC.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing</td><td>Buffer Gibco, Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td>tampão de cloreto de amônio-potássio para lise de hemácias residuais em</td></tr><tr><td>tubos de heparina de vacutainer</td> BD de fração PBMC colhida <td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td><td>366480</td><td>10 mL, aditivo heparina sódica 158 unidades USP, tubo de vidro, tamanho 16 x 100 mm</td></tr><tr><td>Kit de crescimento de células dendríticas bovinas</td><td>Bio-Rad, Reino Unido</td><td>PBP015KZZ</td><td>Coquetel de citocinas composto por IL-4 bovino recombinante e</td></tr><tr><td>IFN-gama bovino GM-CSF; Kit ELISA</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA5638KZZ</td><td>Kit uso para medir IFN-&gama; expressão em cultura sobrenadante</td></tr><tr><td>CD14 Anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2678F</td><td>Camundongo anti-bovino CD14 monoclonal, clone CC-G33, isotipo IgG1</td></tr><tr><td>CD25 Anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2430PE</td><td>camundongo anti bovino CD25 monoclonal, clone IL-A11, isotipo IgG1</td></tr><tr><td>CD4 Anticorpo</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1653A647</td><td>Anticorpo monoclonal CD4 bovino de camundongo, clone CC8, anticorpo IgG2a</td></tr><tr><td>CD40</td><td>isotipo Bio-Rad</td><td>MCA2431F</td><td>anticorpo monoclonal CD40 bovino de camundongo, clone IL-A156, anticorpo IgG1</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA837F</td><td>anticorpo monoclonal CD8 bovino de camundongo, clone CC63, anticorpo anticorpo IgG2a</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2437PE</td><td>Anticorpo monoclonal CD86 anti-bovino de camundongo, clone IL-A190, isotipo IgG1</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real</td><td>Bio-Rad-Thermal</td><td></td> <td>cycler Máquina de PCR</td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga</td><td>Corning Falcon Corning&nbsp;</td><td>352096 & 352070</td><td>15 mL e 50 mL, fundo cônico de poypropileno de alta clareza, graduado, estéril, tampa de rosca de vedação, tubo de falcão</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Plus</td><td>BD Bio Sciences</td><td>555028</td><td>Kit de fixação/permeabilização com BD golgiPlug, uso para coloração de células de citômetro de fluxo</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1009832500</td><td>Absolute para análise EMSURE&nbsp; ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td>Qualified, inactivated Ficoll</td></tr><tr><td>Plaque PLUS</td><td>GE Health care Life Sciences, USA</td><td>341691</td><td>Meio de isolamento de linfócitos</td></tr><tr><td>Agente de limpeza FlowClean</td><td>Beckman Coulter, Life Sciences</td><td>A64669</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td><td>-</td><td>Citômetro de fluxo Software de histograma</td></tr><tr><td>FlowTubes/ FACS&nbsp; (Classificação de célula única ativada por fluorescência) Tubo</td><td>Falcon Corning&nbsp;</td><td>352235</td><td>Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo esterial de 5 mL com tampa de pressão do filtro de células, uso em análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Fluoresceinisotiocynat-Dextran</td><td>Sigma Aldrich, Alemanha</td><td>60842-46-8</td><td>FITC-dextran MW</td></tr><tr><td>Gallios Citômetro de Fluxo</td> <td>Máquina de citômetro de fluxo</td><td>Beckman Coulter-Placas</td><td></td></tr> <tr><td>de PCR de 96 poços</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>96 poços, perfil baixo, parede fina, rodapé, branco/claro</td></tr><tr><td>MicroBeads humanos CD14</td><td>Miltenyi Bioteck, Alemanha</td><td>130-050-201</td><td>Microbeads de 2 mL conjugados ao isotipo monoclonal IgG2a do anticorpo anti-humano CD14, usado para a seleção de monócitos bovinos de PBMCs</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman Coulter,</td><td></td> <td>Germany-Citômetro de fluxo multicolor software de análise de dados</td></tr><tr><td>MACS Coluna</td><td>Miltenyi Bioteck, Alemanha</td><td>130-042-401</td><td>Classificação de células ativadas magnéticas ou coluna de separação de células magentic imune para separação de várias populações de células CD14 com base em antígenos de superfície celular</td></tr><tr><td>MHC Classe II DQ DR Anticorpo Polimórfico</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2228F</td><td>Camundongo anti-ovelhas MHC Classe II DQ DR Polimórfico: FITC, clone 49.1, isotipo IgG2a, reativo cruzado com</td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga</td> bovina <td>Sigma Aldrich</td><td>HS4325</td><td>1,5 mL, fundo cônico, graduado, tubo estéril</td></tr><tr><td>Microsoft Power Point</td><td></td> <td>Microsoft-As</td> <td>ilustrações gráficas do projeto experimental</td></tr><tr><td>Controle Negativo IgG1 de Mouse:FITC para CD14, Anticorpo CD40</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928F</td><td>Controle isotípico CD14 e anticorpo monoclonal CD40&nbsp;</td></tr><tr><td>Controle Negativo de IgG1 de Camundongo: PE para Anticorpo CD86</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>Controle de Isotipo Anticorpo monoclonal CD86&nbsp;</td></tr><tr><td>Controle Negativo de IgG1 em Camundongo: RPE para Anticorpo CD25</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>Controle de Isotipo Anticorpo monoclonal CD25&nbsp;</td></tr><tr><td>Controle Negativo de IgG2a de Camundongo: FITC para Anticorpo MHC Classe II</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA929F</td><td>Controle de isotipo para anticorpo monoclonal MHC classe II&nbsp;</td></tr><tr><td>Nobivac Raiva</td><td>MSD Saúde Animal, UK-1</td><td></td> <td>&micro; L/mL de vacina inativada cultivada em células contendo > 2 UI/mL Cepa do vírus da raiva</td></tr><tr><td>Selos ópticos</td><td>Bi0-Rad</td><td>TCS0803</td><td>0,2 mL tubo de PCR plano 8 tiras de tampa, óptico, ultraclaro, compatível para máquina de qPCR</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Tampão fosfato solução salina (PBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>pH 7,4, concentração</td></tr> <tr><td>de 1xPrism - Software GraphPad 5</td><td>Dotmatics-Statistical</td><td></td> <td>software</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-humano Ki-67 purificado</td><td>Biolegend, EUA</td><td>350501</td><td>Anticorpo monoclonal, reativo cruzado com vaca, clone ki-67</td></tr><tr><td>Camundongo purificado IgG1 k Isotipo Ctrl Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>400101</td><td>Controle de isotipo para anticorpo monoclonal Ki-67</td></tr><tr><td>READIDROP Iodeto de propídio</td><td>BD Bio Sciences</td><td>1351101</td><td>Marcador de células vivas/mortas usado para citometria de fluxo, corante reativo de amina</td></tr><tr><td>Proteína IL-2 humana recombinante</td><td>R& D System, EUA</td><td>202-IL-010/CF</td><td>Interleucina-2, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Uso do kit para extração de RNA total; Buffer RLT = buffer de lise; Tampão RW1 = tampão de lavagem rigoroso contendo guanidina; Buffer RDD = buffer DNase; Tampão EPR = tampão de lavagem suave; RNaseOUT = inibidor de RNase.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>Meios de cultura celular com L-glutamina e bicarbonato de sódio</td></tr><tr><td>SMART-servier medical art&nbsp;</td><td>Les Laboratories Servier-Licenciado</td><td></td> <td>sob uma licença Creative Commons atribuição 3.0 não adaptada</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5270</td><td>2x qPCR mix conatinas dNTPs, Ss07d fusão polimerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, corantes de normalização ROX.</td></tr><tr><td>Sistema de Síntese de Fita Inicial SuperScript III</td><td>Invitrogen, Kit</td><td>de 18080051</td> Thermo Fisher <td>para síntese de cDNA</td></tr><tr><td>Placa de teste de cultura de tecidos 24</td><td>TPP, Suíça</td><td>92024</td><td>Placa de 24 poços, esterilizada por radiação, tratamento com crescimento aprimorado, volume 3,18 mL</td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td>0,4%, 100 mL, corante para avaliar a viabilidade celular</td></tr><tr><td>Água Destilada UltraPure DNase/RNase-Free</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>0.1 &micro; m água destilada filtrada por membrana</td></tr><tr><td>Tubos de Coleta de Sangue de Heparina VACUETTE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206067</td><td>Os Tubos de Coleta de Sangue de Heparina VACUETTE têm um topo verde e contêm heparina de lítio, sódio ou amônio secas por pulverização nas paredes internas e são usados em química clínica, imunologia e sorologia. O anticoagulante heparina ativa a antitrombina, que bloqueia a cascata de coagulação e, assim, produz uma amostra de sangue/plasma total.</td></tr><tr><td>Água</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W3500-1L</td><td>Filtrado estéril, bioReagente adequado para cultura de células</td></tr></tbody></table>

determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

As células dendríticas (DCs) são as mais potentes células apresentadoras de antígenos (APCs) dentro do sistema imunológico. Eles patrulham o organismo à procura de patógenos e desempenham um papel único dentro do sistema imunológico, ligando as respostas imunes inatas e adaptativas. Essas células podem fagocitar e, em seguida, apresentar antígenos capturados para células imunes efetoras, desencadeando uma gama diversificada de respostas imunes. Este trabalho demonstra um método padronizado para a geração in vitro de células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (MoDCs) isoladas de células mononucleares do sangue periférico de bovinos (PBMCs) e sua aplicação na avaliação da imunogenicidade vacinal.
A triagem celular baseada em magnética foi usada para isolar monócitos CD14+ de CMSP, e a suplementação de meio de cultura completo com interleucina (IL)-4 e fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) foi usada para induzir a diferenciação de monócitos CD14+ em MoDCs virgens. A geração de MoDCs imaturas foi confirmada pela detecção da expressão dos marcadores de superfície celular do complexo principal de histocompatibilidade II (MHC II), CD86 e CD40. Uma vacina antirrábica comercialmente disponível foi usada para pulsar as CCMOs imaturas, que foram posteriormente co-cultivadas com linfócitos virgens.
A análise por citometria de fluxo das MoDCs antígeno-pulsadas e da co-cultura de linfócitos revelou estimulação da proliferação de linfócitos T através da expressão dos marcadores Ki-67, CD25, CD4 e CD8. A análise da expressão do RNAm de IFN-γ e Ki-67, por PCR quantitativo, mostrou que as MoDCs podem induzir o priming antígeno-específico de linfócitos neste sistema de co-cultivo in vitro . Além disso, a secreção de IFN-γ avaliada por ELISA mostrou um título significativamente maior (**p < 0,01) na co-cultura MoDC-linfócito pulsada pela vacina antirrábica do que na co-cultura de linfócitos MoDC não pulsada por antígeno. Estes resultados mostram a validade deste ensaio in vitro MoDC para medir a imunogenicidade vacinal, o que significa que este ensaio pode ser usado para identificar potenciais candidatos vacinais para bovinos antes de prosseguir com ensaios in vivo , bem como em avaliações de imunogenicidade vacinal de vacinas comerciais.

Esta metodologia descreve a geração in vitro de MoDCs bovinos para a avaliação de antígenos vacinais candidatos antes da realização de estudos in vivo. A Figura 1 ilustra o esquema experimental de geração de MoDC bovina e a aplicação das MoDCs para o ensaio in vitro. Utilizando a técnica de triagem celular de base magnética, foi possível coletar aproximadamente 26 milhões de miócitos CD14+ das CMSP colhidas, que foram previamente isoladas de 50 mL de san...

A metodologia descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (MoDCs) e sua aplicação na avaliação in vitro de candidatos antigênicos durante o desenvolvimento de potenciais vacinas veterinárias em bovinos.

Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Este protocolo representa um ensaio funcional in vitro utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos para medir a imunogenicidade vacinal antes de estudos in vivo. Portanto, preenchendo uma lacuna existente na vacinologia animal. É a geração e aplicação de células dendríticas.Como as células apresentadoras de antígenos mais potentes, as células dendríticas tornaram-se um alvo chave de pesquisa para a compreensão dos mecanismos imunológicos intracelulares, incluindo a eficácia da vacina. Este ensaio pode ser implementado como uma ferramenta para triagem de candidatos vacinais, como um estado de controle de qualidade para a produção de vacinas, e para a seleção de antígenos e adjuvantes. Quem demonstrará o procedimento será Richard Kangethe, cientista do laboratório de produção e saúde animal.Comece invertendo e misturando o sangue obtido da punção da veia jugular da panturrilha com vacutainers heparinizados. Em seguida, transfira 20 mililitros de sangue heparinizado para um tubo estéril de 50 mililitros e dilua-o com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Pipetar 15 mililitros de meio de isolamento de linfócitos para um tubo estéril de 50 mililitros e inclinar o tubo para uma posição de 45 graus.Coloque cuidadosamente 30 mililitros de meio PBS de sangue sobre o isolamento de linfócitos usando uma pipeta de 25 mililitros e retorne lentamente o tubo para uma posição vertical antes de centrifuga-lo. Em seguida, colete a fina camada branca de células mononucleares do sangue periférico ou camada PBMC usando uma pipeta de Pasteur e transfira-a para um novo tubo de 50 mililitros. Lave os PBMCs colhidos duas vezes usando 40 mililitros de PBS por lavagem e misture bem.Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em 15 mililitros de tampão potássio cloreto de amônio ou tampão ACK. Após 10 a 15 minutos de incubação à temperatura ambiente, adicione até 40 mililitros de PBS e centrifugue o tubo com aceleração e desaceleração máximas. Ressuspender o pellet em 10 mililitros de meio de cultura completo.Em seguida, adicione cinco microlitros de tampão CD14 MicroBead por 10 milhões de células e misture completamente usando uma pipeta. Para análise por citometria de fluxo, adicionar 10 microlitros de isotiocianato de fluoresceína CD14 ou anticorpo corante FITC aos PBMCs e incubá-lo por 15 minutos a quatro a oito graus Celsius antes de prosseguir com a citometria de fluxo. Para os PBMCs sem manchas, adicione um mililitro de tampão de fax e centrifugue-o por sete minutos a 500g e quatro graus Celsius.Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de fax por 100 milhões de células. Em seguida, insira a coluna de separação de células imunomagnéticas no separador e coloque um tubo de coleta de 50 mililitros sob a saída da coluna para coletar o fluxo. Depois de lavar a coluna com um tampão de fax desgaseificado de um mililitro, substitua o tubo de 15 mililitros usado por um novo.Pipetar cem milhões de células em 500 microlitros de tampão de cada vez, permitindo que a suspensão celular passe pela coluna. Em seguida, lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão de fax desgaseificado de cada vez. Após a coleta do fluxo, rotule a primeira fração de linfócitos virgens eluídos como a fração celular CD14 negativa.Retire a coluna do separador e coloque um novo tubo estéril de 15 mililitros sob a coluna para a coleta de efluentes. Adicione cinco mililitros de buffer de fax na coluna e empurre-o imediatamente usando o êmbolo. Coletar e rotular o segundo fluxo ou a fração de monócitos virgens como a fração celular CD14 positiva.Adicione meio de cultura completo aos monócitos CD14 positivos colhidos para atingir 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, adicione uma suspensão de células mililitros a cada poço de uma placa estéril de 24 poços antes de suplementar cada poço com 40 microlitros do coquetel de citocinas fornecido no kit. No segundo dia, transfira metade do conteúdo de cada poço para tubos individuais de 1,5 mililitro usando uma pipeta.Após centrifugar os tubos de 1,5 mililitro a 500g por sete minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 microlitros de meio de cultura fresco completo. Transfira 500 microlitros dessa suspensão de células ressuspensas de volta para os poços correspondentes para que o volume final no poço se torne de um mililitro. Enriqueça cada poço com 20 microlitros de coquetel de citocinas.Para gerar MoDCs pulsadas por antígeno, adicione um microlitro por mililitro de vacina contra o vírus da raiva ou suspensão de RV a um mililitro de cultura de MoDC ingênua na placa de 24 poços e incube a placa por 48 horas a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. No sétimo dia, mantenha a placa de 24 poços contendo as MoDCs pulsadas por antígeno no gelo por 10 minutos antes de adicionar um mililitro de PBS gelado por poço e misturá-la completamente. Transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros.Lave os poços com dois mililitros de PBS gelado. Coletar as células residuais dentro de cada poço e transferir o conteúdo lavado para seus respectivos tubos. Centrifugar a suspensão celular a 500g por sete minutos.Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda a pastilha de células MoDCs pulsadas por antígeno em meio de cultura completo para ajustar a concentração final de 100.000 células por mililitro. Para a co-cultura de linfócitos MoDC, semeie os poços de uma placa estéril de 24 poços com um mililitro da suspensão de células linfocitárias virgens e um mililitro de suspensão de MoDC pulsada ou não pulsada por antígeno no sétimo dia do pulso de antígeno. Após dois dias de incubação, completar cada poço com 20 nanogramas por mililitro de interleucina-2 recombinante e continuar a incubação por mais 120 horas.No dia 14, transferir um mililitro da co-cultura para um tubo estéril de 1,5 mililitro e centrifugar o tubo. Em seguida, ressuspenda a pastilha de células com um mililitro de MoDCs pulsadas ou não pulsadas por antígeno. Misture bem e transfira as suspensões celulares para seus poços correspondentes.Após a coloração da superfície celular das CMSP e dos linfócitos e monócitos virgens, transferir um mililitro da suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mililitro usando pipeta e centrífuga por 10 minutos a 500g. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS e transfira-o para um tubo de 15 mililitros. Colete também as células residuais e os tubos correspondentes usando um mililitro de PBS.Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS ao tubo de 15 mililitros que contém as células e misture por pipetagem. Após centrifugar o tubo por sete minutos a 850g, retirar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o pellet de células com suspensão residual deixada após a decantação do sobrenadante. Transfira a suspensão da célula para uma placa de 96 poços com fundo em V e sele os poços para evitar derramamento.Uma vez concluída a coloração, realizar a análise do citômetro de fluxo. A partir da visualização em tempo real, ajuste o limiar de fluorescência, incluindo tensão e ganho e tamanho da célula para, eventualmente, desenhar portas em torno da população celular desejada, excluindo quaisquer detritos celulares. A coloração de células CD14 e a citometria de fluxo mostraram que a fração de monócitos virgens de produção era composta por 98% de células de monócitos CD14 positivas e funcionalmente capaz de captar antígenos.As DCMs virgens fenotipicamente caracterizadas pela avaliação da expressão de MHC Classe 2 e marcadores co-estimulatórios de superfície celular CD86 e CD40 validaram as células dendríticas ou fenótipo DC-like. Durante a co-cultura de linfócitos MoDC no nono dia, uma alteração morfológica mostrando extensão dendrítica foi observada no pulso do VD para MoDCs. Em comparação com a cultura de linfócitos MoDC não pulsada, um aumento significativo na proliferação linfocitária foi demonstrado pela suprarregulação dos marcadores de ativação Ki67 e CD25 nas células T CD4 positivas e CD8 positivas no dia 16 na co-cultura de linfócitos MoDC pulsada.As células T CD8 positivas das co-culturas MoDC pulsadas maduras exibiram uma upregulation de Ki67 oito vezes maior em comparação com o grupo inespecífico. As células CD4 positivas na mesma co-cultura mostraram um aumento de sete vezes no Ki67 em comparação com os controles, demonstrando a capacidade das MoDCs primed de RV de apresentar o antígeno de RV para linfócitos virgens e ativá-los em uma condição in vitro. A quantificação por qPCR das co-culturas mostrou aumento de mais de 30% na expressão de interferon gama e mais de 5% na expressão de Ki67 em todas as co-culturas usando GAPDH como calibrador.Uma concentração significativamente maior de interferon gama secretado foi observada na co-cultura de linfócitos MoDC pulsada de VD em comparação com o grupo de tratamento inespecífico. Execute a etapa de camadas muito lenta e cuidadosamente, garantindo que o sangue seja colocado sobre o meio de isolamento de linfócitos. Tenha cuidado extra para coletar todos os PBMCs sem coletar muito material das outras camadas.Outros métodos como citometria de fluxo, ELISA e PCR quantitativo, entre outros, podem ser aplicados após esse procedimento para avaliar a ativação de marcadores imunes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em MoDC de células dendríticas derivadas de monócitos para medir a imunogenicidade de vacinas disponíveis comercialmente. Os ensaios do MoDC investigam as respostas das células dendríticas a antígenos, patógenos ou tratamentos e podem fornecer informações sobre respostas imunes, desenvolvimento de vacinas e pesquisa de imunoterapia.

Um ensaio in vitro baseado em células dendríticas pulsadas por vacina para induzir a proliferação de linfócitos

O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.

Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

Ensaio enzyme-linked immunospot cultivadas interferão-γ longo termo é usado como uma medida das respostas de memória central e correlaciona-se com a resposta à vacina anti-micobacterianos de protecção. Com este ensaio, as células mononucleares de sangue periférico são estimuladas com antigénios micobacterianos e interleucina-2 durante 14 dias, permitindo a diferenciação e a expansão das células T de memória central.

Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

Aqui, demonstramos como os monócitos são isolados por separação de esferas magnéticas de células mononucleares do sangue periférico após centrifugação por gradiente de densidade de sangue anticoagulado humano. Após a incubação por 5 dias, os monócitos humanos são diferenciados em células dendríticas imaturas e estão prontos para procedimentos experimentais em um ambiente não clínico.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Uma nova técnica para antígeno rápida exposição sobre uma superfície bacteriana é apresentada, que envolve a superfície biotinylation seguido por exposição às proteínas de interesse em fusão com avidin monomérico. Carregando a BCG com antígenos selecionados com êxito melhora sua imunogenicidade, sugerindo que a decoração de superfície pode substituir abordagens genéticas tradicionais.

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

Procedimentos experimentais para a extração subsequente dos tecidos linfáticos para testar a ativação de células dendríticas linfoides são descritos após o tratamento de um nanomaterial imunoestimulante.

Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

Descrevemos um protocolo para a conjugação química do modelo de ovalbumin de antígeno para um anticorpo específico do receptor de endocitose para o direcionamento de células dendríticas in vivo. O protocolo inclui a purificação do anticorpo, a conjugação química do antígeno, bem como a purificação do conjugado e a verificação de uma conjugação eficiente.

Conjugação Química de um anticorpo purificado DEC-205-Directed com proteína de comprimento completo para direcionar células dendríticas de camundongos in vitro e in vivo

Um protocolo único e abrangente para gerar células dendríticas derivadas de monócitos humanos dessialiladas (mo-DCs) a partir de células mononucleares isoladas do sangue periférico (PBMCs) usando um tratamento com sialidase é apresentado. Além disso, são descritos métodos para avaliar a caracterização fenotípica e funcional das mo-DCs e avaliar como o tratamento com sialidase melhora o nível de maturação das mo-DCs.

Geração de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos com Fenótipos Sialilados Diferentes

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14+ humanos

Aprenda a gerar células dendríticas derivadas de monócitos bovinos para avaliar a imunogenicidade vacinal in vitro. Este método preenche uma lacuna crítica na vacinologia pecuária e serve como ferramenta valiosa para triagem de candidatos vacinais.

Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

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