Name: Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: Aprenda a visualizar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência. Este método permite examinar antígenos em suas localizações funcionais e avaliar mecanismos de resistência a quimioterápicos e inibidores de PARP.

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Somos gratos pela orientação de Pavel Lobachevsky, PhD no estabelecimento deste protocolo. Também gostaríamos de agradecer à Escola de Medicina da Universidade de Washington no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e Divisão de Oncologia Ginecológica da Universidade de Washington, ao Programa Acadêmico do Reitor da Universidade de Washington, à Fundação do Grupo de Oncologia Ginecológica e ao Programa de Desenvolvimento de Cientistas Reprodutivos por seu apoio a este projeto.

O tecido tumoral e a ascite foram obtidos após a obtenção do consentimento da paciente como parte de um biorrepositório de oncologia ginecológica aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Washington em St. Louis. As pacientes foram incluídas se tivessem câncer de ovário seroso de alto grau em estágio avançado (HGSOC). Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente no banco, salvo indicação em contrário. Todos os reagentes foram preparados à temperatura ambiente (salvo indicação em contrário) e armazenados a 4 °C.
1. Geração de organoides
<ol><li>Gerar os organoides seguindo o relatório publicado anteriormente20.</li>
</ol>2. Chapeamento e irradiação de organoides
<ol><li>Usando organoides em cultura, desaloje as abas dos organoides do prato de cultura através da manipulação manual de uma ponta de pipeta. Recolher os organoides num tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cónico a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta, aspirar o sobrenadante com cuidado.</li>
	<li>Adicionar 1.000 μL de uma enzima recombinante isenta de origem animal ao pellet (ver Tabela de Materiais). Misturar a solução e incubar durante 15 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Centrifugar a solução a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta, aspirar cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	<li>Após centrifugação e aspiração, ressuspender o pellet em 1.000 μL de solução salina tamponada com fosfato.</li>
	<li>Transferir 10 μL da solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e misturar com 10 μL de azul de tripano.</li>
	<li>Tomar 10 μL da solução de células azuis de tripano numa lâmina de câmara de contagem de células e inseri-la na máquina de contagem de células (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Placa de 40.000 células por 20 μL de extrato de membrana basal (BME) em uma lâmina de câmara de vidro de 8 poços (ver Tabela de Materiais). Isso mantém os organoides por 3-5 dias para permitir que as células formem organoides e cresçam até um tamanho adequado.</li>
	<li>Para induzir quebras de DNA de fita dupla, irradie os organoides banhados com 10 Gray (Gy) de irradiação ɣ (consulte Tabela de Materiais para detalhes do irradiador). NOTA: Isso pode levar até 5-10 min.</li>
	<li>Incubar os organoides em seus meios de cultura em incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 por 4 h.</li>
</ol>3. Coloração por imunofluorescência
NOTA: Os volumes referem-se à quantidade por poço da lâmina da câmara de 8 poços (~300 μL).
<ol><li>Após a irradiação e incubação dos organoides, aspirar o meio com uma pipeta, com cuidado, para não perturbar a matriz 3D. Lave com 300 μL de PBS.</li>
	<li>Fixe os organoides em 300 μL de paraformaldeído a 2% (PFA) por 10 min. NOTAS: Não deixe por muito tempo, pois o BME irá despolimerizar e pode ser aspirado.</li>
	<li>Lave os organoides com 300 μL de tampão de coloração (ver Tabela de Materiais). Coloque em um agitador por 5 min.</li>
	<li>Para permeabilização, adicione suavemente 300 μL de tampão de permeabilização (ver Tabela de Materiais) e incube por 20 min. Lavar com 300 μL de tampão de coloração. Coloque em um agitador por 5 min.</li>
	<li>Adicione 300 μL de tampão de coloração para bloquear a etapa de permeabilização. Coloque em um agitador por 30 min. Aspirar para fora do tampão de coloração usando uma pipeta.</li>
	<li>Adicionar 300 μL de anticorpos primários (coelho anti-RAD51, rato anti-Geminin, coelho anti-RPA, rato anti-ɣH2AX, coelho anti-Geminin, rato anti-53BP1; ver Tabela de Materiais) diluídos em tampão de coloração. Incubar a 4 °C durante 16 h. NOTA: Evite a co-coloração com o mesmo animal hospedeiro. Deixe a tampa fora para evitar que os anticorpos se misturem nos poços vizinhos.</li>
	<li>Remova a solução primária de anticorpos. Realize três lavagens com 300 μL de tampão de coloração por 5 min cada no agitador.</li>
	<li>Adicionar 300 μL de anticorpo secundário (anti-rato de cabra Alexa fluor 488 e cabra anti-coelho Alexa fluor 647; ver Tabela de Materiais) diluído em tampão de coloração e incubar durante 1 h no escuro. Observação : todas as etapas subsequentes devem ser executadas no escuro.</li>
	<li>Aspirar a solução secundária de anticorpos. Adicionar 300 μL de DAPI diluído. Coloque em um agitador por 5 min.</li>
	<li>Realize três lavagens com 300 μL de tampão de coloração por 5 min cada no agitador. Remova o tampão de coloração e retire as câmaras utilizando o kit de remoção incluído com as lâminas da câmara (ver Tabela de Materiais). NOTA: Certifique-se de não avançar muito para interromper a matriz 3D.</li>
	<li>Usando uma ponta de pipeta p200 com a ponta cortada, adicione o meio de montagem (consulte Tabela de materiais) para cobrir cada poço com uma aba organoide (por exemplo, 20-30 μL para cada guia organoide).</li>
	<li>Coloque uma tampa sobre o espécime, evitando bolhas.</li>
	<li>Pegue o esmalte transparente e pinte-o nas laterais do vidro da tampa para selar a lâmina. Deixe endurecer durante 1 h e coloque-o a -20 °C. NOTA: Após a imagem, a lâmina pode ser armazenada por pelo menos 6 meses com perda mínima de fluorescência.</li>
</ol>4. Imagens
<ol><li>Adquira imagens usando um microscópio confocal (ver Tabela de Materiais) a 63x a objetivo com óleo de imersão. NOTA: Se a imagem de proteínas nucleares, 63x é vantajoso, mas 40x também é aceitável.</li>
	<li>Use DAPI para localizar os organoides através da ocular. Selecione os filtros apropriados para microscopia com base nos fluoróforos utilizados. Defina os parâmetros para capturar as imagens z-stack. NOTA: Os fluoróforos utilizados no estudo foram DAPI, 488 e 647. Os lasers 405, 488 e 638 foram ligados para visualizar a coloração. NOTA: A pilha z recomendada depende do poder de resolução do objetivo.</li>
	<li>Ajuste a imagem ao vivo: defina o foco, a intensidade do laser, etc. NOTA: Quanto maior a intensidade do laser, maior a probabilidade de a amostra ser fotobranqueada. Portanto, selecione uma intensidade de laser ideal.</li>
	<li>Adquira a pilha z. NOTA: Isso pode levar até 5-10 min.</li>
	<li>A partir das imagens coletadas na pilha z, captura de tela pelo menos três imagens por pilha. NOTA: Certifique-se de obter capturas de tela em toda a pilha para não duplicar os núcleos ao quantificar.</li>
	<li>Salve cada arquivo como um TIFF e prossiga para a análise (etapa 5).</li>
</ol>5. Análise
NOTA: Use o JCountPro para todas as análises de imagem seguindo o relatório21 publicado anteriormente. Para obter este software, consulte a publicação associada.
<ol><li>No painel de análise de objetos (parte superior do programa) na guia de seleção de arquivos (parte inferior do programa), selecione os arquivos TIFF .</li>
	<li>Clique em Adicionar para mover os arquivos selecionados para o grupo de arquivos selecionados. Selecione Exibir.</li>
	<li>Na guia de segmentação, selecione azul como a cor dos núcleos. Selecione Segmentação automática para otimizar o limiar dos núcleos. NOTA: Se a segmentação automática não identificar com precisão os objetos, o usuário poderá ajustar o ajuste fino e o ajuste bruto da imagem ou consultar o manual do usuário para otimizar ainda mais a segmentação.</li>
	<li>No painel de objetos, selecione Dividir objetos grandes automaticamente e otimizar o tamanho dos núcleos. NOTA: Os núcleos normalmente têm um tamanho incondicional de 5.000 pixels, enquanto o tamanho condicional é de 1.500 pixels. Consulte o manual do usuário para otimizar ainda mais o tamanho dos objetos.</li>
	<li>Selecione Identificar objetos para testar os parâmetros. NOTA: Se esses parâmetros não forem precisos, o tamanho e o ajuste podem ser ajustados junto com outras configurações. Consulte o manual do usuário para obter instruções sobre otimização adicional.</li>
	<li>Depois de ajustar os parâmetros para a imagem, selecione Identificar objetos em todas as imagens para identificar os núcleos em todas as imagens selecionadas.</li>
	<li>Selecione o painel Análise de focos (parte superior do programa).</li>
	<li>Na guia Selecionar arquivos (parte inferior do programa), selecione os arquivos TIFF que foram usados para análise de objetos e selecione os Botões de seta (>>) para mover as imagens para o grupo de arquivos de imagem.</li>
	<li>No grupo de diretórios abaixo dos arquivos de imagem que foram movidos, clique duas vezes na pasta Edição Manual e selecione para mover os arquivos ioc para o grupo de arquivos da coleção de objetos. Observação : todos os TIFFs selecionados devem ter correspondido a arquivos ioc.</li>
	<li>Pressione Select (Selecionar ) para mover os arquivos para o grupo de arquivos selecionado. Selecione a guia Contagem de focos na parte inferior do programa.</li>
	<li>Otimize os parâmetros seguindo as etapas abaixo.<ol><li>Índice de configurações da cartola: 12.</li>
		<li>Canal de foco: Selecione a cor dos focos (verde: ɣ-H2AX; vermelho: RAD51).</li>
		<li>Configurações da cúpula H: altura da cúpula %: 30; limiar %: 28 e 28.</li>
		<li>Configuração de forma/tamanho: Tamanho mínimo do foco, pixels: 5. Selecione Aplicar forma/tamanho. Tamanho máximo do foco (condicional): 32. Redondeza mínima, x100: 96. Foco máximo, pixels: 60.</li>
		<li>Filtro de ruído: tamanho 1. NOTA: Se determinar se um núcleo é positivo para coloração de geminina, sob o segundo canal, selecione verde e, em análise, selecione intensidade.</li>
	</ol></li>
	<li>Para testar os parâmetros definidos, selecione os botões abaixo na ordem: Top Hat > H-Dome > Foci Count. Observação : se esses parâmetros não funcionarem, o tamanho e o ajuste podem ser ajustados junto com outras configurações. Consulte o manual do usuário para saber mais sobre como a imagem pode ser ainda mais otimizada.</li>
	<li>Uma vez que os parâmetros são otimizados para as imagens selecionadas, selecione Contagem automática para contar os focos em cada imagem por núcleo. Se o segundo canal for desejado, o programa determinará a intensidade que pode ser usada.</li>
</ol>

<ol><li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li>
<li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer%3A+ASCO+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li>
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<li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers%3A+sensitivity+to+PARP+inhibitors%2C+platinum%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li>
<li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li>
<li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654(2015).</li>
<li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li>
<li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+%CE%B3-H2AX+assay+to+monitor+DNA+damage+and+repair+in+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research.</a> Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).</li>
<li>Fuh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+deficiency+real-time+clinical+assays%2C+ready+or+not%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not.</a> Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).</li>
<li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li>
<li>Lee, E. K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054(2020).</li>
<li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li>
<li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer%3A+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984(2022).</li>
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<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
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<li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A resposta a danos no DNA desempenha um papel integral no desenvolvimento do câncer de ovário e na resistência à quimioterapia. Portanto, uma compreensão completa dos mecanismos de reparo do DNA é imperativa. Aqui, uma metodologia é apresentada para estudar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides intactos 3D. Um protocolo reprodutível e confiável é desenvolvido utilizando anticorpos característicos para avaliar danos ao DNA, recombinação homóloga, junção final não homóloga e estresse de replicação. É importante...

O câncer de ovário é a principal causa de morte por malignidade ginecológica. A maioria dos pacientes é tratada com medicamentos prejudiciais ao DNA, como a carboplatina, e aqueles com tumores deficientes em reparo homólogo de recombinação (HRR) podem receber inibidores da polipoli (ADP-ribose) polimerase (PARP) 1,2. No entanto, a maioria dos pacientes desenvolve resistência a essas terapias e morre dentro de 5 anos após o diagnóstico. A desregulação da resposta a danos no DNA (DDR) tem sido associada ao desenvolvimento de câncer de ovário e à resistência à quimioterapia e ao inibidor dePARP3. Assim, o estudo da DDR é imperativo na compreensão da fisiopatologia do câncer de ovário, potenciais biomarcadores e novas terapias direcionadas.
Os métodos atuais para avaliar a DDR utilizam imunofluorescência (FI), pois isso permite a identificação e localização precisas de proteínas de dano ao DNA e análogos de nucleotídeos. Uma vez que há uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA, a proteína histona H2AX é rapidamente fosforilada, formando um foco onde as proteínas de reparo de danos ao DNA se reúnem4. Esta fosforilação pode ser facilmente identificada utilizando IF; de fato, o ensaio ɣ-H2AX tem sido comumente empregado para confirmar a indução de um DSB 5,6,7,8,9. O aumento do dano ao DNA tem sido associado à sensibilidade à platina e à eficácia de agentes prejudiciais ao DNA 10,11,12, e ɣ-H2AX tem sido proposto como um biomarcador associado à resposta quimioterápica em outros tratamentos contra o câncer 13. Após um DSB, uma célula proficiente em HRR realiza uma série de eventos que levam o BRCA1 e o BRCA2 a recrutar RAD51 para substituir a proteína de replicação A (RPA) e se ligar ao DNA. O reparo HRR usa um modelo de DNA para reparar fielmente o DSB. No entanto, quando os tumores são deficientes em HRR, eles dependem de vias de reparo alternativas, como a junção final não homóloga (NHEJ). Sabe-se que o NHEJ é propenso a erros e cria uma alta carga mutacional na célula, que usa o 53BP1 como regulador positivo14. Essas proteínas de dano ao DNA podem ser identificadas com precisão como focos usando IF. Além da coloração para proteínas, o IF pode ser usado para estudar a proteção do garfo e a formação de lacunas de DNA de fita simples. A capacidade de ter garfos estáveis tem sido correlacionada com a resposta à platina e, recentemente, ensaios de gap mostraram o potencial de predizer a resposta aos inibidores de PARP 6,15,16,17. Portanto, a coloração para os análogos de nucleotídeos após a introdução no genoma é outra maneira de estudar a DDR.
Até o momento, a avaliação da DDR no câncer de ovário tem sido amplamente limitada a linhagens celulares 2D homogêneas que não recapitulam a heterogeneidade clonal, o microambiente ou a arquitetura de tumores in vivo 18,19. Pesquisas recentes sugerem que os organoides são superiores às linhagens celulares 2D no estudo de processos biológicos complexos, como os mecanismos DDR6. A presente metodologia avalia RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA e geminina em DOP. Esses métodos avaliam o organoide intacto e permitem o estudo dos mecanismos de DDR em um ambiente mais semelhante ao microambiente tumoral in vivo. Juntamente com a microscopia confocal e a contagem automatizada de focos, essa metodologia pode ajudar na compreensão da via DDR no câncer de ovário e na personalização dos planos de tratamento para as pacientes.

<table><tbody><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio (PBS++)</td><td>Sigma</td><td>14-040-133</td><td></td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (PBS)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>ICN1860454</tr><tr><td>Anticorpo Ant-53BP1&nbsp;</td><td>A BD Biosciences</td><td>612522</td><td>diluída a 1:500 em tampão de coloração</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Geminina&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab104306</td><td>diluído para 1:200 em tampão de coloração</td></tr><tr><td>Anti-Geminin Antibody&nbsp;</td><td>ProteinTech</td><td>10802-1-AP</td><td>diluído a 1:400 em tampão de coloração</td></tr><tr><td>Anti-RAD51 Anticorpo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab133534</td><td>diluído a 1:1000 em tampão de coloração</td></tr><tr><td>Anti-yH2AX Anticorpo&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-636</td><td>diluído a 1:500 em tampão de coloração</td></tr><tr><td>Anticorpo Ant-phospho-RPA32 (S4/S8)</td><td>Bethyl Laboratories&nbsp;</td><td>A300-245A-M</td><td>diluído a 1:200 em tampão de coloração</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP1605 100</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga; Centrífuga Sorvall St 16R</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75004240</tr><tr><td>Microscópio Confocal, sistema confocal Leica SP5 DMI4000</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td>389584</tr><tr><td>Tubos Cônicos, 15 mL</td><td>Corning&nbsp;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess 3 FL (Máquina de Contagem de Células)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAF2000</tr><tr><td>Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip</td><td>LA Colors</td><td></td><td>Qualquer esmalte transparente será suficiente</td></tr><tr><td>Cultrex&nbsp; Extrato de Membrana de Base RGF, Tipo 2</td><td>&nbsp; R& D Systems&nbsp;</td><td>3533-010-02</td><td>Provavelmente poderia usar Matrigel ou outra Matriz BME&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; R37606</td><td>NucBlue Reagente ReadyProbes de Célula Fixa, Diluído em 1x PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>NC0756056</tr><tr><td>JCountPro</td><td>JCountPro</td><td></td><td>Para acessar o software, envie um e-mail para: jcountpro@gmail.com&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>07-000-243</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte para Unhas&nbsp;</td><td>StatLab</td><td>SL102450</td><td></td></tr><tr><td>Parafomraldeído (PFA), 2%&nbsp;</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica&nbsp;</td><td>157-4</td><td>Diluir para 4% de PFA em PBS++ para obter 2% de PFA</td></tr><tr><td>Permeabilização Buffer</td><td>Made in Lab</td><td></td><td>0.2% X-100 Triton em PBS++&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta&nbsp;</td><td>Chuva</td><td></td><td></td>17014967</tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; P36930</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Coloração</td><td>Feito em Laboratório</td><td></td><td>0.5% BSA, 0.15% Glicina, 0.1% X-100 Triton em PBS++&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de Deslizamento de Câmara Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>12-565-8</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Alderich&nbsp;</td><td></td><td></td>11332481001</tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano, 0,4%</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604013</td><td>enzima recombinante X-RAD</td></tr><tr><td>320 Irradiador Biológico livre de</td> origem animal<td>Irradiação de Raios-X de Precisão&nbsp;</td><td>X-RAD320</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando proteínas de reparo de danos ao dna em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

A imunofluorescência é uma das técnicas mais utilizadas para visualizar antígenos alvo com alta sensibilidade e especificidade, permitindo a identificação e localização precisas de proteínas, glicanos e pequenas moléculas. Embora esta técnica esteja bem estabelecida em cultura de células bidimensionais (2D), pouco se sabe sobre seu uso em modelos celulares tridimensionais (3D). Os organoides do câncer de ovário são modelos tumorais 3D que recapitulam a heterogeneidade clonal das células tumorais, o microambiente tumoral e as interações célula-célula e célula-matriz. Assim, são superiores às linhagens celulares para a avaliação da sensibilidade a fármacos e biomarcadores funcionais. Portanto, a capacidade de utilizar a imunofluorescência em organoides primários de câncer de ovário é extremamente benéfica na compreensão da biologia desse câncer. O presente estudo descreve a técnica de imunofluorescência para detectar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário (DOP) de alto grau derivados de pacientes serosos. Após a exposição das DOP à radiação ionizante, a imunofluorescência é realizada em organoides intactos para avaliar as proteínas nucleares como focos. As imagens são coletadas usando imagens z-stack em microscopia confocal e analisadas usando software automatizado de contagem de focos. Os métodos descritos permitem a análise do recrutamento temporal e especial de proteínas de reparação de danos no DNA e a colocalização dessas proteínas com marcadores do ciclo celular.

O protocolo apresentado pode colorir, visualizar e quantificar com sucesso proteínas de reparo de danos ao DNA nuclear em organoides. Essa técnica foi utilizada para corar e avaliar as DOP antes e após a irradiação. As DOP foram expostas a 10 Gy de radiação e avaliadas quanto aos seguintes biomarcadores: ɣ-H2AX (Figura 1), um marcador de dano ao DNA; RAD51 (Figura 2), um marcador para HRR; 53BP1, um marcador de NHEJ; RPA, um marcador de tensão de replicação (<st...

O presente protocolo descreve métodos para avaliar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados de pacientes. Aqui estão incluídos métodos abrangentes de chapeamento e coloração, bem como procedimentos de quantificação detalhados e objetivos.

Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

O estudo da resposta a danos no DNA é necessário para entender a fisiopatologia dos potenciais biomarcadores do câncer de ovário em novas terapias-alvo. Esta técnica permite que a amostra permaneça intacta e permite o exame de antígenos em seu local de ação. Este protocolo é rápido e pode ser adaptado a qualquer antígeno passível de imunofluorescência.Este método fornece informações sobre o câncer de ovário e os processos de reparo de danos ao DNA envolvidos na resistência quimioterápica e inibidora de PARP. Esses métodos podem ser aplicados a outras áreas de estudo que envolvem o uso de culturas 3D e organoides. Para começar, aspirar o meio dos organoides irradiados e incubados sem interromper a matriz 3D.Em seguida, lave com 300 microlitros de PBS. Fixe os organoides em 300 microlitros de paraformaldeído a 2% por 10 minutos. Após a fixação, lave os organoides com 300 microlitros de tampão de coloração e coloque-os em um agitador por cinco minutos.Em seguida, permeabilize o organoide adicionando suavemente 300 microlitros de tampão de permeabilização. Após 20 minutos de incubação, retire o tampão e lave com 300 microlitros de tampão de coloração. Coloque os organoides em um agitad

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve um protocolo para detectar focos de reparo de DNA induzidos por radiação nas linhagens de células de câncer de cólon usando coloração por imunofluorescência. As proteínas de reparo do DNA são ativadas no local do dano ao DNA; portanto, podemos detectá-los usando anticorpos específicos e visualizá-los sob um microscópio de fluorescência.

Avaliação de focos de danos ao DNA: para identificar focos de danos ao DNA induzidos por radiação em linhagens de células cancerígenas usando coloração por imunofluorescência

Neste vídeo, descrevemos o método de imunofluorescência para visualizar a localização das proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 nos locais de quebras de DNA de fita dupla em núcleos de células irradiadas.

Visualização baseada em imunofluorescência das interações da proteína de reparo do DNA

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente estabelecida. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Os organoides derivados do paciente (DOP) são uma cultura tridimensional (3D) que pode imitar o ambiente tumoral in vitro. No câncer de ovário seroso de alto grau, as DOPs representam um modelo para estudar novos biomarcadores e terapias.

Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau

Aqui, descrevemos um método baseado em imunofluorescência para quantificar os níveis de DNA de fita simples nas células. Este método eficiente e reprodutível pode ser utilizado para examinar o estresse de replicação, uma característica comum em vários tipos de câncer de ovário. Além disso, este ensaio é compatível com um pipeline de análise automatizado, o que aumenta ainda mais a sua eficiência.

Quantificando o estresse de replicação em células de câncer de ovário usando imunofluorescência de DNA de fita simples

Apresentamos um protocolo que pode ser usado para realizar testes terapêuticos com organoides de câncer de ovário derivados de pacientes.

Modelos organoides derivados de pacientes com câncer de ovário para testes pré-clínicos de drogas

Este protocolo oferece uma estrutura sistemática para o estabelecimento de organoides de câncer de ovário de diferentes estágios da doença e aborda os desafios da variabilidade específica da paciente para aumentar o rendimento e permitir uma expansão robusta a longo prazo para aplicações subsequentes. Inclui etapas detalhadas para processamento de tecidos, semeadura, ajuste dos requisitos de meios e coloração por imunofluorescência.

Estratégia para Biobanco de Organoides para Câncer de Ovário: Abordando a Heterogeneidade Interpaciente entre Subtipos Histológicos e Estágios da Doença

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Aprenda a visualizar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência. Este método permite examinar antígenos em suas localizações funcionais e avaliar mecanismos de resistência a quimioterápicos e inibidores de PARP.

Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal

Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência

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