Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência
24 de fevereiro de 2023
O presente protocolo descreve métodos para avaliar proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados de pacientes. Aqui estão incluídos métodos abrangentes de chapeamento e coloração, bem como procedimentos de quantificação detalhados e objetivos.
O estudo da resposta a danos no DNA é necessário para entender a fisiopatologia dos potenciais biomarcadores do câncer de ovário em novas terapias-alvo. Esta técnica permite que a amostra permaneça intacta e permite o exame de antígenos em seu local de ação. Este protocolo é rápido e pode ser adaptado a qualquer antígeno passível de imunofluorescência.
Este método fornece informações sobre o câncer de ovário e os processos de reparo de danos ao DNA envolvidos na resistência quimioterápica e inibidora de PARP. Esses métodos podem ser aplicados a outras áreas de estudo que envolvem o uso de culturas 3D e organoides. Para começar, aspirar o meio dos organoides irradiados e incubados sem interromper a matriz 3D.
Em seguida, lave com 300 microlitros de PBS. Fixe os organoides em 300 microlitros de paraformaldeído a 2% por 10 minutos. Após a fixação, lave os organoides com 300 microlitros de tampão de coloração e coloque-os em um agitador por cinco minutos.
Em seguida, permeabilize o organoide adicionando suavemente 300 microlitros de tampão de permeabilização. Após 20 minutos de incubação, retire o tampão e lave com 300 microlitros de tampão de coloração. Coloque os organoides em um agitador por cinco minutos.
Em seguida, adicione 300 microlitros de tampão de coloração para bloquear a etapa de permeabilização. Colocar no agitador durante 30 minutos e aspirar o tampão de coloração utilizando uma pipeta. Em seguida, adicione 300 microlitros de anticorpos primários diluídos em tampão de coloração.
Incubar a quatro graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, remova a solução primária de anticorpos. Realize três lavagens com 300 microlitros de tampão de coloração por cinco minutos cada no agitador.
Adicione 300 microlitros de solução de anticorpos secundários diluída em tampão de coloração e incube por uma hora no escuro. Após uma hora, aspirar a solução de anticorpos secundários e adicionar 300 microlitros de DAPI diluído. Coloque no agitador por cinco minutos.
Realize três lavagens com 300 microlitros de tampão de coloração por cinco minutos cada no agitador. Remova o tampão de coloração e retire as câmaras usando o kit de remoção incluído com as lâminas da câmara. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P200 e use-a para adicionar um meio de montagem para cobrir cada poço contendo uma aba organoide.
Coloque uma tampa deslize sobre o espécime, evitando bolhas. Pegue o esmalte transparente e pinte-o nas laterais do vidro da tampa para selar a lâmina. Deixe endurecer por uma hora e depois coloque-o a 20 graus Celsius.
Adquira imagens usando um microscópio confocal usando uma objetiva de 63X com óleo de imersão. Usando este protocolo, os organoides de câncer de ovário derivados da paciente foram corados para proteínas de reparo de danos ao DNA antes e após a irradiação, e avaliados para biomarcadores como gama H2AX, um marcador de dano ao DNA, e RAD51, um marcador para reparo de recombinação homóloga. RPA, um marcador de estresse de replicação, 53BP1, um marcador de junção não homóloga, e Geminin, um marcador de ciclo celular de fase GS2 também foram avaliados usando esta técnica.
As abas BME tendem a despolimerizar, portanto, prestar muita atenção após a fixação e aspiração é vital. Analisar os antígenos para determinar o dano organoide e a capacidade de montar uma resposta a danos no DNA pode ajudar na avaliação da resistência quimioterápica.
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Visão Geral
Este protocolo descreve métodos para avaliar proteínas de reparação de danos no DNA em organoides de câncer de ovário derivados de pacientes. Inclui técnicas abrangentes de plantio e coloração, juntamente com procedimentos de quantificação objetiva.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa em câncer de ovário
- Resposta a danos no DNA
- Tecnologia de organoides
Fundamento
- Entender a resposta a danos no DNA é crucial para a fisiopatologia do câncer de ovário.
- Este estudo explora potenciais biomarcadores para terapia direcionada.
- O protocolo permite a examinação de antígenos em suas localizações funcionais.
- É adaptável a vários antígenos adequados para imunofluorescência.
Propósito do Estudo
- Investigar processos de reparação de danos no DNA no câncer de ovário.
- Fornecer insights sobre resistência quimioterápica e a inibidores de PARP.
- Desenvolver métodos aplicáveis a outros estudos envolvendo culturas 3D e organoides.
Métodos Utilizados
- Aspiração de meio de organoides irradiados e incubados sem perturbar a matriz 3D.
- Utilização de imunofluorescência para examinação de antígenos.
- Implementação de protocolos rápidos e adaptáveis para vários antígenos.
- Emprego de procedimentos de quantificação objetiva para análise.
Principais Resultados
- Insights sobre mecanismos de reparação de danos no DNA no câncer de ovário.
- Identificação de mecanismos de resistência a quimioterápicos.
- Demonstração da adaptabilidade do protocolo a diferentes antígenos.
- Aplicação potencial de métodos a outras áreas de estudo.
Conclusões
- O protocolo fornece uma ferramenta valiosa para estudar a resposta a danos no DNA no câncer de ovário.
- Aumenta a compreensão dos mecanismos de resistência ao tratamento.
- Os métodos podem ser amplamente aplicados a vários contextos de pesquisa envolvendo organoides.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Visualizing DNA damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids using immunofluorescence enables high-content, spatially resolved biomarker analysis in disease-relevant 3D models. This approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for therapeutic strategies addressing chemoresistance. Integrating these assays at the discovery and preclinical interface supports risk-adjusted portfolio decisions in oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of DNA repair pathways and functional target validation in clinically relevant 3D tumor models.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing protein recruitment and colocalization after genotoxic stress.
- Facilitates identification of predictive biomarkers for chemotherapeutic and PARP inhibitor resistance.
Screening & Assay Development
- Establishes validated immunofluorescence workflows for quantitative protein foci analysis in organoids.
- Delivers reproducible, high-sensitivity readouts for downstream screening of DNA repair modulators.
- Enables standardization of imaging and automated foci quantification for scalable assay deployment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomarker evaluation with disease-relevant 3D models, improving translational continuity.
- Supports preclinical assessment of drug response and resistance mechanisms in patient-derived systems.
- Provides a platform for evaluating temporal and spatial dynamics of DNA repair proteins in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence assay positions within the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational biomarker validation in ovarian cancer research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of DNA repair function and pathway engagement in intact organoids.
- Screening: Provides quantitative, reproducible foci counts for comparative analysis of treatment conditions.
- Analytics: Supports automated image analysis and statistical comparison of protein localization and colocalization.
- Translational Research: Connects in vitro findings to patient-relevant resistance mechanisms and biomarker profiles.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other antigens and 3D disease models for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of resistance.
- Operational Value: Standardizes immunofluorescence workflows for reproducibility and scalability in 3D models.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking biomarker dynamics to therapeutic response.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets and resistance-modifying strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D organoid culture and immunofluorescence imaging.
- Demands access to confocal microscopy and automated image analysis software.
- Necessitates careful handling to preserve organoid integrity during processing.
- Standardization across teams is essential for reproducible quantitative outputs.
- Adaptation to other tumor types or antigens may require protocol optimization.
