Monitorando Alterações em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana após Infecção Viral Usando Análise Celular em Tempo Real Baseada em Impedância
5 de maio de 2023
O presente estudo descreve um protocolo para monitorar as alterações nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante a infecção viral usando um sistema de análise celular em tempo real (RTCA).
Esse protocolo permitiu a detecção contínua de efeitos transitórios na forma de algumas alterações morfológicas durante uma infecção viral, como descolamento e flutuação de células aderentes. Este protocolo permitiu uma abordagem não-invasiva e não-trabalhosa intensiva para monitorar continuamente as alterações morfológicas celulares e capturar efeitos transitórios como vazamento vascular que poderiam ser perdidos pelo ensaio final. Este protocolo pode ser utilizado para analisar alterações na integridade vascular de outras linhagens celulares em diferentes arranjos experimentais se as células forem aderentes.
Depois de preparar os HUVECs, inicie o aplicativo de software RTCA clicando duas vezes no ícone na área de trabalho. Digite o nome de usuário e a senha na janela de login. Coloque uma placa resistora RTCA de 96 poços com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.
Em seguida, vá para a guia de notas do experimento do software RTCA e digite o nome do experimento, o número de série do dispositivo e o tipo de dispositivo. Na guia layout sob a guia célula do software RTCA, realce todos os poços e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados. Em seguida, abra a guia de agendamento do software RTCA.
Clique em Step_1 e defina varreduras como 10 e intervalo como 30 segundos. Em seguida, clique em iniciar continuar no canto superior esquerdo do software para iniciar a execução da verificação. Após a execução, abra a guia índice de célula para verificar os dados.
Todos os valores do índice celular devem ser menores que 0,063. Em seguida, verifique os dados brutos de varredura na parte inferior da guia de índice de célula para padrões de valores repetidos, conforme descrito no manuscrito. Para concluir a execução de verificação, clique em chapa e selecione placa de liberação.
Remova a placa resistora RTCA de 96 poços da estação RTCA. Para obter a leitura de fundo no RTCA, lave a placa de microeletrodo de ouro especializada revestida de colágeno tipo um duas vezes com 60 microlitros por poço de HBSS. Descarte o HBSS restante e adicione 50 mililitros por poço de matriz extracelular.
Em seguida, coloque a placa na estação RTCA localizada na incubadora de cultura de células com o poço A1 voltado para dentro. Na guia notas exp do software RTCA, digite o nome do experimento, o número de série do dispositivo e o tipo de dispositivo. Navegue até a guia célula do software RTCA e selecione a guia layout.
Destaque os poços a serem utilizados e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados. Agora vá para a aba de agendamento do software RTCA. Clique em Step_1 e clique em iniciar ou continuar no canto superior esquerdo para obter uma leitura de plano de fundo.
A placa já está pronta para a semeadura e remoção das células da estação RTCA. Em seguida, semeamos de 10 a quartas células por poço de HUVECs na placa de microeletrodo de ouro com 50 microlitros por poço de meio condicionado. Coloque a placa de volta na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular, com o poço A1 voltado para dentro.
Em seguida, na guia de programação do software, clique em adicionar uma etapa no canto superior esquerdo. Clique em Step_2. Altere as varreduras para 601, o intervalo para dois minutos e clique em aplicar.
Clique em Step_2 e clique em iniciar ou continuar no canto superior esquerdo do software. Após 20 horas de incubação, quando os valores do índice celular na guia do gráfico do poço mostram um platô, a placa está pronta para a infecção. Na guia agendamento do software RTCA, clique em etapa de anulação.
A placa já está pronta para ser retirada da estação RTCA. Para infectar os HUVECs, recupere o estoque de vírus Zika do freezer de 80 graus Celsius negativos. Diluir o estoque do vírus Zika com matriz extracelular livre de soro em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro para atingir multiplicidades de infecção de 0,1 e um.
Em seguida, descarte o meio condicionado de cada poço e enxágue cada poço com 60 microlitros de HBSS enquanto usa a lateral do poço. Adicione 40 microlitros de amostra de vírus diluída no poço, começando da maior para a menor diluição, usando o lado do poço. Incubar a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir a absorção do vírus.
Gire a placa cinco vezes a cada 15 minutos para permitir a absorção do vírus em toda a monocamada celular. Após uma hora de incubação, remova e descarte a suspensão do vírus da menor concentração para a mais alta. Lave as células infectadas duas vezes com 60 mililitros de HBSS.
Sobrepor os poços com matriz extracelular suplementada com SFB a 2%. Para os poços de controle positivo, diluir a trombina em 20 unidades por mililitro com matriz extracelular suplementada com SFB a 2% e sobrepor os poços com trombina contendo meio de matriz extracelular, utilizando o lado do poço. Agora clique na guia agendar e adicione uma etapa no canto superior esquerdo.
Navegue até Step_3 e modifique as varreduras para 3, 601 e o intervalo para dois minutos. Clique em aplicar e, em seguida, clique em OK na janela exibida. Coloque a placa de microeletrodo de ouro especializado infectado com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura.
Finalmente, clique em Step_3 e clique em iniciar continuar no canto superior esquerdo do software. O valor do índice celular de HUVECs infectados com o vírus Zika P6-740 em uma multiplicidade de infecção de 0,1 começou a cair em 15 horas após a infecção, em comparação com o controle de infecção negativo. Os HUVECs infectados com uma dose mais alta do vírus Zika P6-740 em uma multiplicidade de infecção de um mostraram uma queda no índice celular em 11 horas após a infecção.
Nas 24 horas pós-infecção, houve uma queda de 5% e 7% no valor do índice celular normalizado quando as células endoteliais foram infectadas em uma multiplicidade de infecção de 0,1 e um, respectivamente. Uma redução de 50% no valor do índice celular normalizado foi registrada em 96 horas pós-infecção e 66,75 horas pós-infecção após a infecção em uma multiplicidade de infecção de 0,1 e um, respectivamente. O valor do índice celular normalizado atingiu seu ponto mais baixo em 107 horas após a infecção, com uma redução de 51% e 60% após a infecção em uma multiplicidade de infecção de 0,1 e um, respectivamente.
O valor normalizado do índice celular apresentou um aumento de 4% e 13% a partir de 107 horas após a infecção até o final do experimento às 168 horas após a infecção. Antes de cada experimento RTCA, uma corrida de verificação do resistor usando a placa RTCA de 96 poços é essencial para garantir que cada biossensor funcione bem para produzir valores confiáveis de índice celular.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para monitorar alterações morfológicas em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante infecção viral utilizando um sistema de análise celular em tempo real (RTCA). Por meio deste protocolo, realiza-se a detecção não invasiva e contínua de efeitos transitórios, como desprendimento celular e vazamento vascular, fornecendo insights sobre a integridade vascular.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Efeitos da infecção viral em células endoteliais
- Tecnologia de análise em tempo real de células
- Avaliação da integridade vascular
Contexto
- Importância do monitoramento das respostas das células endoteliais durante infecções virais
- Limitações dos ensaios tradicionais de ponto final
- Necessidade de métodos de monitoramento não invasivos
Métodos Utilizados
- Análise celular em tempo real (RTCA) para monitoramento contínuo
- Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs)
- Aplicação intravenosa do vírus Zika em diferentes multiplicidades de infecção
Resultados Principais
- Detecção de alterações morfológicas e reduções no índice de células após infecção
- Reduções normais no índice de células de 5% a 50% observadas em diversos pontos temporais
- O protocolo permite a análise de linhagens celulares semelhantes sob diferentes condições
Conclusões
- O estudo demonstra um método robusto para investigar as respostas das células endoteliais a infecções virais.
- Este protocolo contribui com insights valiosos para a biologia vascular e os mecanismos das doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O monitoramento contínuo e baseado em impedância da integridade das células endoteliais permite a detecção precoce da ruptura da barreira durante infecção viral, reforçando a confiança preditiva em estudos de biologia vascular. Essa abordagem de análise celular em tempo real (RTCA) atende à necessidade de avaliação não invasiva e quantitativa de respostas celulares transitórias, fundamentais para reduzir riscos em alvos e orientar a identificação de compostos líderes em pipelines de doenças infecciosas. O método aprimora a tomada de decisões em portfólios ao fornecer dados robustos e reprodutíveis sobre a função da barreira endotelial sob desafio patogênico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação quantitativa da ruptura da barreira endotelial por agentes virais.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao capturar alterações morfológicas transitórias em tempo real.
- Facilita a validação funcional de alvos em vias de integridade vascular.
- Fornece dados para triagem de alvos com base em respostas celulares dinâmicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece leituras validadas e reprodutíveis sobre a saúde e permeabilidade de células endoteliais.
- Padroniza as condições do ensaio para triagem em alto rendimento de compostos que modulam a barreira.
- Gera saídas quantitativas de índice celular adequadas para análise comparativa.
- Permite avaliação confiável de antivirais candidatos ou biológicos que afetam a integridade vascular.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha respostas endoteliais in vitro com fenótipos de vazamento vascular relevantes para a doença.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos vasculares.
- Fornece dados preditivos para o avanço ajustado ao risco de candidatos terapêuticos.
- Facilita o desenvolvimento de biomarcadores para desfechos de integridade vascular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo RTCA integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir o monitoramento em tempo real e quantitativo das respostas de células endoteliais à infecção viral.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos virais de rompimento da barreira e disfunção endotelial.
- Triagem: Fornece medições quantitativas e reprodutíveis do índice celular para prontidão do ensaio e avaliação de compostos.
- Análises: Permite comparação estatística de condições de infecção e efeitos dependentes da dose sobre a integridade celular.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos pré-clínicos de vazamento vascular e alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Oferece uma plataforma escalável e adaptável para diversos tipos celulares aderentes e configurações experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos da barreira endotelial e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios baseados em células.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao fornecer dados precoces e acionáveis sobre alvos vasculares.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos que afetam a integridade vascular.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de células e na operação de ensaios baseados em impedância.
- Necessita de acesso a instrumentação RTCA e placas com microeletrodos de ouro compatíveis.
- Exige padronização rigorosa entre equipes no preparo do ensaio e na análise de dados.
- Adaptável a outros modelos de células aderentes mediante otimização do protocolo.
- Depende da verificação e controle de qualidade dos biossensores para resultados confiáveis.
