Name: Monitorando Alterações em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana após Infecção Viral Usando Análise Celular em Tempo Real Baseada em Impedância (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprenda a monitorar alterações morfológicas em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante infecção viral usando análise celular em tempo real baseada em impedância. Este método não invasivo detecta efeitos transitórios como descolamento celular e vazamento vascular.

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Esta pesquisa recebeu apoio do Ministério do Ensino Superior da Malásia no âmbito do programa do Centro de Excelência da Instituição Superior (HICoE) (MO002-2019) e financiamento sob o Esquema de Bolsas de Pesquisa de Longo Prazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

1. Preparação celular
<ol><li>Preparação de HUVECs<ol><li>Cultivar 7,5 x 105 células HUVEC/mL em um frasco de cultura celular de 75cm2 (revestido com 20 μg/mL de colágeno tipo 1) contendo 12 mL de meio de células endoteliais (MEC) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 0,01% de suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS) que contém fatores de crescimento, hormônios e proteínas necessários para a cultura de HUVECs, e penicilina-estreptomicina a 0,01% (P/S). Incubar as células em estufa de cultura celular a 37 °C com CO2 a 5% (Figura 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Configuração do experimento RTCA
<ol><li>Verificação de resistor executado em RTCA<ol><li>Clique duas vezes no ícone do software RTCA na área de trabalho para iniciar o aplicativo. Uma janela de login aparecerá, digite o nome de usuário e senha para fazer login.</li>
		<li>Coloque uma placa resistora RTCA de 96 poços com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.</li>
		<li>Na guia Exp Notes do software RTCA, digite o nome do experimento, o SN do dispositivo e o tipo de dispositivo (placa QC).</li>
		<li>Na guia Layout na guia Célula do software RTCA, realce todos os poços e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados (acinzentados).</li>
		<li>Na guia Agenda do software RTCA, clique em Step_1. Digite Varreduras: 10 e Intervalo: 30 s. Clique em Aplicar. Clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software para iniciar a execução de verificação. NOTA: Certifique-se de que a conexão dos poços à estação RTCA está correta, observando "Placa digitalizada. Connections OK" na parte inferior da página.</li>
	</ol></li>
	<li>Execução de verificação de resistor para análise de dados<ol><li>Na guia Índice de Células , verifique os dados após a conclusão da execução. Todos os valores de IC devem ser menores que 0,063.</li>
		<li>Na parte inferior da guia Índice de Células , verifique os dados brutos da varredura. Os dados brutos de varredura devem exibir padrões de valores repetidos de 40,0 ± 2,0 (linhas A e H), 67,5 ± 2,5 (linhas B e G), 93,6 ± 2,9 (linhas C e F) e 117,6 ± 3,2 (linhas D e E).</li>
		<li>Para interromper a execução da verificação, clique em Placa > Placa de Liberação. A placa resistora RTCA de 96 poços está agora pronta para ser removida da estação RTCA.</li>
	</ol></li>
	<li>Obtendo leitura de fundo no RTCA<ol><li>Lavar a placa especializada de microeletrodos de ouro revestida com colágeno tipo 1 (revestida com 20 μg/mL de colágeno tipo 1) com 60 μL/poço de solução salina balanceada de Hank (HBSS; com bicarbonato de sódio, sem cloreto de cálcio e sulfato de magnésio) 2x.</li>
		<li>Descarte o HBSS restante e adicione 50 μL/poço de MEC. Coloque a placa especializada de microeletrodos de ouro contendo MEC com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.</li>
		<li>Na guia Notas Exp do software RTCA, digite o nome do experimento, o SN do dispositivo e o tipo de dispositivo (formato de 96 poços).</li>
		<li>Na guia Layout , na guia Célula do software RTCA, destaque os poços que serão usados e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados (esmaecidos).</li>
		<li>Na guia Agenda do software RTCA, clique em Step_1 e clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software para obter uma leitura em segundo plano. OBS: Verifique se a conexão dos poços está correta, observando "Placa digitalizada. Connections OK" na parte inferior da página.</li>
		<li>Uma vez obtida a leitura de fundo, a placa especializada de microeletrodo de ouro está pronta para a semeadura celular e pronta para ser removida da estação RTCA.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de HUVEC na placa especializada de microeletrodo de ouro<ol><li>Semeando as HUVECs na placa especializada de microeletrodo de ouro com 50 μL/poço de meio condicionado, 1 x 104 células/poço (meio condicionado: MEC suplementada com 10% SFB, 0,01% ECGS e 0,01% P/S). Coloque a placa de volta na estação RTCA com o poço A1 voltado para dentro para incubação noturna em uma incubadora de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2. NOTA: A contagem de células foi realizada na suspensão celular com fator de diluição de dois utilizando um hemocitômetro.</li>
		<li>Na guia Agendar, clique em Adicionar uma Etapa no canto superior esquerdo. Clique em Step_2 e altere as Varreduras: 601 e Intervalo: 2 min. Clique em Step_2 e clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software.</li>
		<li>Após 20 h de incubação e quando os valores de IC na guia Gráfico de Poço mostram um platô, a placa está pronta para infecção. Na guia Agenda do software RTCA, clique em Etapa de Anulação.</li>
		<li>A placa especializada de microeletrodo de ouro está agora pronta para ser removida da estação RTCA para etapas subsequentes.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Infecção viral em HUVECs
<ol><li>Diluição do vírus<ol><li>A cultura de estoque ZIKV é mantida a -80 °C. Para este estudo, remova o estoque de vírus mantido nos frascos criogênicos e dilua o estoque de VZIK com MEC livre de soro em tubos centrífugos de 1,5 mL para obter multiplicidade de infecções (MOIs) de 0,1 e 1. NOTA: O estoque de ZIKV foi previamente preparado por meio de propagação em células Vero e colheita do sobrenadante ZIKV34.</li>
	</ol></li>
	<li>Infecção da monocamada celular<ol><li>Remover e descartar o meio condicionado (ECM suplementado com 10% FBS, 0,01% ECGS e 0,01% P/S) de cada poço. Enxaguar cada poço com 60 μL de HBSS 2x. Inserir o HBSS com o auxílio da lateral do poço; Não dispare a monocamada celular.</li>
		<li>Trabalhando da diluição mais alta para a mais baixa, adicione 40 μL de cada amostra de vírus diluída em ECM sem soro no poço. Triplicar o poço para cada diluição e manter seis poços sem infecção (controle negativo e controle positivo trombina). Não dispare a monocamada celular; Em vez disso, adicione o vírus diluído com a ajuda do lado do poço. Use uma ponta de pipeta fresca para cada inserção. OBS: A trombina foi escolhida como controle positivo por poder aumentar rapidamente a permeabilidade endotelial das HUVECs.</li>
		<li>Incubar a placa numa incubadora de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2 para permitir a adsorção do vírus. Espalhe a placa 5x a cada 15 min para permitir a adsorção do vírus em toda a monocamada celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Adição do meio de cultura celular de sobreposição<ol><li>Após 1 h de incubação, remova e descarte a suspensão do vírus da menor concentração para a mais alta.</li>
		<li>Lavar as células infectadas com 60 μL de HBSS 2x. Sobreponha o poço com ECM suplementado com SFB a 2%. Para os poços de controle positivo, diluir a trombina a 20 U/mL com MEC suplementada com SFB a 2% e sobrepor os poços com meio de MEC contendo trombina. Não dispare a monocamada celular; em vez disso, adicione mídia de sobreposição com a ajuda do lado do poço.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocação da placa especializada em microeletrodo de ouro infectada de volta na estação RTCA<ol><li>Na guia Agendar, clique em Adicionar uma Etapa no canto superior esquerdo. Clique em Step_3 e altere as Varreduras: 3.601 e Intervalo: 2 min.</li>
		<li>Clique em OK na janela pop-up exibida. Coloque a placa de microeletrodo de ouro especializado infectado com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.</li>
		<li>Clique em Step_3 e clique em Iniciar/Continuar no canto superior esquerdo do software.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise de dados e exportação de dados
<ol><li>Adição de informações experimentais de cada poço<ol><li>Na guia Layout , clique na guia Cell (Figura 2A). Para inserir as informações da célula de destino e determinar o tipo de poço para cada poço, realce o poço e digite o nome, o número e a cor da célula de destino na parte inferior do software. Clique em Aplicar (Figura 2B).</li>
		<li>Para selecionar e determinar o tipo de poço para cada poço na guia Célula , realce o poço, selecione o tipo de poço (amostra, controle positivo ou controle negativo) e clique em Definir.</li>
		<li>Na guia Layout , clique na guia Tratamento (Figura 2C). Para inserir informações de tratamento, destaque o poço e o tipo no nome do tratamento, concentração de tratamento, unidade e cor. Clique em Aplicar (Figura 2D).</li>
		<li>Para selecionar e determinar o tipo de poço para cada poço na guia Tratamento , realce o poço, selecione o tipo de poço (amostra, controle positivo ou controle negativo) e clique em Definir. NOTA: Para cada seleção, vários poços podem ser destacados ao mesmo tempo.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalização do valor do IC<ol><li>Clique com o botão direito do mouse à direita da guia Análise de dados e selecione Índice de células normalizado na caixa suspensa Eixo Y (Figura 3A). Na seção Eixo X na parte inferior, selecione o tempo normalizado como o último ponto de tempo medido onde a placa especializada de microeletrodo de ouro foi removida para infecção (Figura 3B). NOTA: O processo de normalização realizado pelo software remove a maior parte da variabilidade devido às diferenças na semeadura e fixação do poço, desde que o ponto de normalização escolhido seja antes da adição do vírus e/ou tratamento. Assim, o ponto de tempo ideal de normalização deve ser o último ponto de tempo antes da adição do vírus e/ou do tratamento. O ponto de tempo para normalizar pode ser verificado na guia Agenda em Step_2. O tempo total indicado é o tempo para normalizar (Figura 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Plotagem dos dados obtidos utilizando o software RTCA<ol><li>Na guia Análise de dados , selecione os poços a serem adicionados ao gráfico destacando os poços e clicando <. O índice de célula normalizado em relação ao gráfico de tempo agora está pronto para ser copiado e exportado. Certifique-se de marcar a caixa de seleção Média .</li>
	</ol></li>
	<li>Exportando dados usando o software RTCA<ol><li>No canto superior esquerdo do software RTCA, clique em Placa > Exportar Informações do Experimento.... Marque a caixa para selecionar os dados a serem exportados. Clique em OK. Observação : dados brutos (valores de CI brutos) podem ser exportados quando o índice de célula > tudo está marcado.</li>
		<li>Selecione a pasta para salvar o arquivo de exportação. Clique em SALVAR. Uma janela pop-up aparecerá indicando a exportação de informações experimentais. Quando a exportação estiver concluída, outra janela aparecerá indicando que as informações do experimento exportado estão prontas para serem visualizadas.</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

A infecção viral citocida em células permissivas geralmente está associada a alterações substanciais na morfologia celular e na biossíntese36. As alterações morfológicas celulares induzidas pelo vírus, como encolhimento celular, aumento celular e/ou formação de sincícios, também são conhecidas como efeitos citopáticos (EPCs), característicos de certas infecções virais37. Nas CE, o ECP foi descrito como a destruição das células e quebra das tight junctions entre cada CE, cau...

As células endoteliais (CE) revestem a superfície interna de todos os vasos sanguíneos e linfáticos. Estão conectados por aderentes, tight gap junctions, criando uma barreira semipermeável entre o sangue ou a linfa e os tecidos circundantes 1,2. As junções célula-célula endotelial intactas são críticas para regular o transporte de macromoléculas, solutos e fluidos, cruciais para as atividades fisiológicas dos tecidos e órgãoscorrespondentes3. A barreira endotelial é dinâmica e modulada por estímulosespecíficos4. A ruptura ou perda da função da barreira endotelial é uma característica da fisiopatologia da doença na inflamação aguda e crônica na patogênese de muitasdoenças5,6,7, incluindo a infecção viral8,9,10,11. Para os flavivírus, verificou-se que a proteína não estrutural NS1 pode alterar a permeabilidade endotelial, por exemplo, via ruptura da camada glicocálice endotelial-símile, como resultado do aumento da expressão e ativação da catepsina L, sialidases e endoglicosidase heparinase9. No estado de doença, a integridade da monocamada endotelial é afetada e as junções célula-célula são rompidas, o que pode levar à lesão e disfunção endotelial12 e, eventualmente, manifestações patológicas disseminadas em múltiplos sistemas orgânicos13,14. A infecção viral das CE resulta em alterações nas vias de sinalização celular e no perfil de expressão gênica celular, que podem afetar as funções de barreira de fluidos, causar ruptura das CE e induzir extravasamento vascular 10,15. Descobriu-se que a infecção das CE pelo vírus Zika (VZIK) interrompe a integridade juncional que causa alterações na permeabilidade vascular e leva à disfunção da barreira endotelial, resultando em extravasamento vascular10,15. Estudos mostraram que o VZIK está ligado a defeitos congênitos graves; no entanto, pouco se sabe sobre o mecanismo exato pelo qual isso ocorre16,17. Compreender as alterações da barreira endotelial durante uma infecção é, portanto, fundamental para entender o mecanismo da doença.
As CEs são atualmente utilizadas como um importante sistema experimental modelo vascular in vitro para diversos processos fisiológicos e patológicos 18,19,20,21. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) têm sido extensivamente utilizadas como sistema celular primário não imortalizado para estudar o endotélio vascular e a biologia vascular in vitro 22,23,24,25. As HUVECs foram isoladas pela primeira vez para cultivo in vitro no início da década de 1970 a partir da veia umbilical do cordão umbilical humano26. Os HUVECs têm uma morfologia semelhante a um paralelepípedo que é facilmente feita para proliferar em laboratório. Devido à tensão de cisalhamento após ser mantida por longos períodos no estado confluente, observa-se alongamento da forma celular. As HUVECs podem ser caracterizadas pela presença de corpos de Weibel e Palade (WPB), vesículas pinocíticas, pequenas quantidades de fibrilas localizadas próximas ao núcleo, mitocôndrias com formas tubulares que raramente apresentam ramificações, núcleo elipsoide com fino padrão granular de cromatina condensada e um a três nucléolos presentes em cadanúcleo27. Embora os HUVECs apresentem numerosas características morfológicas, a identificação dos HUVECs não pode ser obtida apenas pelo exame óptico. Ensaios como a coloração por imunofluorescência do endotélio vascular (VE)-caderina, são comumente utilizados para a monitorização da integridade vascular em HUVECs 28,29,30,31.
Este estudo descreve o protocolo de análise celular em tempo real (ATR) da infecção de HUVECs. O sistema RTCA utiliza placas especializadas revestidas a ouro contendo microeletrodos que fornecem uma superfície condutora para a fixação celular. Quando as células se ligam à superfície do microeletrodo, uma barreira que impede o fluxo de elétrons através dos microeletrodos é formada. A medida da impedância gerada pelos microeletrodos pode ser utilizada para obter informações sobre alguns processos celulares, incluindo a fixação celular, proliferação e migração32. O ensaio relatado é um ensaio celular baseado em impedância que, juntamente com um analisador celular em tempo real, fornece medição contínua da proliferação de células vivas, mudanças morfológicas (como encolhimento celular) e qualidade da ligação celular de forma não invasiva e livre de marcação. Neste estudo, o analisador celular em tempo real é usado para monitorar a integridade endotelial e as alterações morfológicas das HUVECs durante a infecção pelo ZIKV. Resumidamente, o instrumento mede o fluxo de elétrons transmitidos em placas especializadas de microtitulação revestidas com microeletrodos de ouro na presença de um meio de cultura (solução eletricamente condutora). A aderência celular ou alterações no número e morfologia celular perturbam o fluxo de elétrons e causam variações de impedância que podem ser captadas pelo instrumento (Figura 1 Suplementar). A diferença entre o crescimento, proliferação e aderência do HUVEC antes e após a infecção pelo VZIK é registrada em tempo real por um sinal de impedância elétrica e, em seguida, traduzida para o valor do índice celular (IC). O valor de IC da pré-infecção é usado como linha de base para a normalização do valor de IC. As alterações nos valores de IC refletem alterações morfológicas celulares ou perda de aderência celular com a infecção33. Os resultados do estudo mostram que o protocolo RTCA permite a detecção de efeitos transitórios ou alterações morfológicas celulares durante a infecção viral em comparação com um ensaio final, como a coloração de imunofluorescência da VE-caderina. O método RTCA pode ser útil para analisar as alterações da integridade vascular do HUVEC quando da infecção por outros vírus.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Nest</td><td>615601</td><td></td></tr><tr><td>37 > C incubadora com 5% de CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 frasco de cultura de tecidos&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>Solução antibiótica penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Sciencell</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de segurança biológica, Classe II</td><td>Holten</td><td>HB2448</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo 1</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS)</td><td>Sciencell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Meio de células endoteliais (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>E-placa 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232368001</tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sciencell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Laboroptik LTD</td><td>Neubauer melhorou</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)</td><td>Sciencell</td><td>8000</td><td></td></tr><tr><td>microscópio invertido</td><td>ZEISS</td><td>TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Latitude 3520 Laptop</td><td>Dell&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta multicanal (10 - 100 &micro; L)</td> <td>Micropipeta</td><td>multicanal Eppendorf 3125000036</td><td></td></tr><tr><td>(30 - 300 &micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Reagente reservatório</td><td>Tarsons</td><td>T38-524090</td><td></td></tr><tr><td>Placa resistor RTCA 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>05232350001</tr><tr><td>RTCA Software Pro (Versão 2.6.1)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>5454433001</tr><tr><td>Pipetas monocanal (10 - 100 &micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas monocanal (100 - 1000 e micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas monocanal (20 - 200 e micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Analisador de células em tempo real SP (Modelo: W380)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>00380601030</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232</td></tr></tbody></table>

monitorando alterações em células endoteliais da veia umbilical humana após infecção viral usando análise celular em tempo real baseada em impedância

Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis

As células endoteliais revestem a superfície interna de todos os vasos sanguíneos e linfáticos, criando uma barreira semipermeável que regula a troca de fluidos e solutos entre o sangue ou a linfa e seus tecidos circundantes. A capacidade de um vírus atravessar a barreira endotelial é um importante mecanismo que facilita a disseminação do vírus no corpo humano. Muitos vírus são relatados para alterar a permeabilidade endotelial e/ou causar ruptura da barreira celular endotelial durante a infecção, o que é capaz de causar extravasamento vascular. O presente estudo descreve um protocolo de análise celular em tempo real (RTCA), usando um analisador celular comercial em tempo real para monitorar a integridade endotelial e as mudanças de permeabilidade durante a infecção pelo vírus Zika (ZIKV) das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os sinais de impedância registrados antes e após a infecção pelo VZIK foram traduzidos para valores de índice celular (IC) e analisados. O protocolo RTCA permite a detecção de efeitos transitórios na forma de alterações morfológicas celulares durante uma infecção viral. Este ensaio também pode ser útil para estudar alterações na integridade vascular de HUVECs em outros arranjos experimentais.

Antes da infecção pelo ZIKV, o IC registrado para a monocamada HUVEC cultivada em uma placa de microtitulação revestida com microeletrodo de ouro era superior a 8, sugerindo fortes propriedades de aderência. Placas ou poços com índice de IC menor que 8 devem ser descartados. Os HUVECs foram então infectados com ZIKV em um MOI de 0,1 e 1, e a impedância celular foi registrada por 7 dias. O valor de IC dos HUVECs infectados com ZIKV P6-740 em um MOI de 0,1 (linha azul clara) começou a cair em 15 h pós-infecção (HPI), em co...

O presente estudo descreve um protocolo para monitorar as alterações nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante a infecção viral usando um sistema de análise celular em tempo real (RTCA).

Monitorando Alterações em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana após Infecção Viral Usando Análise Celular em Tempo Real Baseada em Impedância

Endothelial cells line the inner surface of all blood and lymphatic vessels, creating a semi-permeable barrier regulating fluid and solute exchange ...

Esse protocolo permitiu a detecção contínua de efeitos transitórios na forma de algumas alterações morfológicas durante uma infecção viral, como descolamento e flutuação de células aderentes. Este protocolo permitiu uma abordagem não-invasiva e não-trabalhosa intensiva para monitorar continuamente as alterações morfológicas celulares e capturar efeitos transitórios como vazamento vascular que poderiam ser perdidos pelo ensaio final. Este protocolo pode ser utilizado para analisar alterações na integridade vascular de outras linhagens celulares em diferentes arranjos experimentais se as células forem aderentes.Depois de preparar os HUVECs, inicie o aplicativo de software RTCA clicando duas vezes no ícone na área de trabalho. Digite o nome de usuário e a senha na janela de login. Coloque uma placa resistora RTCA de 96 poços com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.Em seguida, vá para a guia de notas do experimento do software RTCA e digite o nome do experimento, o número de série do dispositivo e o tipo de dispositivo. Na guia layout sob a guia célula do software RTCA, realce todos os poços e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados. Em seguida, abra a guia de agendamento do software RTCA.Clique em Step_1 e defina varreduras como 10 e intervalo como 30 segundos. Em seguida, clique em iniciar continuar no canto superior esquerdo do software para iniciar a execução da verificação. Após a execução, abra a guia índice de célula para verificar os dados.Todos os valores do índice celular devem ser menores que 0,063. Em seguida, verifique os dados brutos de varredura na parte inferior da guia de índice de célula para padrões de valores repetidos, conforme descrito no manuscrito. Para concluir a execução de verificação, clique em chapa e selecione placa de liberação.Remova a placa resistora RTCA de 96 poços da estação RTCA. Para obter a leitura de fundo no RTCA, lave a placa de microeletrodo de ouro especializada revestida de colágeno tipo um duas vezes com 60 microlitros por poço de HBSS. Descarte o HBSS restante e adicione 50 mililitros por poço de matriz extracelular.Em seguida, coloque a placa na estação RTCA localizada na incubadora de cultura de células com o poço A1 voltado para dentro. Na guia notas exp do software RTCA, digite o nome do experimento, o número de série do dispositivo e o tipo de dispositivo. Navegue até a guia célula do software RTCA e selecione a guia layout.Destaque os poços a serem utilizados e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados. Agora vá para a aba de agendamento do software RTCA. Clique em Step_1 e clique em iniciar ou continuar no canto superior esquerdo para obter uma leitura de plano de fundo.A placa já está pronta para a semeadura e remoção das células da estação RTCA. Em seguida, semeamos de 10 a quartas células por poço de HUVECs na placa de microeletrodo de ouro com 50 microlitros por poço de meio condicionado. Coloque a placa de volta na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular, com o poço A1 voltado para dentro.Em seguida, na guia de programação do software, clique em adicionar uma etapa no canto superior esquerdo. Clique em Step_2. Altere as varreduras para 601, o intervalo para dois minutos e clique em aplicar.Clique em Step_2 e clique em iniciar ou continuar no canto superior esquerdo do software. Após 20 horas de incubação, quando os valores do índice celular na guia do gráfico do poço mostram um platô, a placa está pronta para a infecção. Na guia agendamento do software RTCA, clique em etapa de anulação.A placa já está pronta para ser retirada da estação RTCA. Para infectar os HUVECs, recupere o estoque de vírus Zika do freezer de 80 graus Celsius negativos. Diluir o estoque do vírus Zika com matriz extracelular livre de soro em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro para atingir multiplicidades de infecção de 0,1 e um.Em seguida, descarte o meio condicionado de cada poço e enxágue cada poço com 60 microlitros de HBSS enquanto usa a lateral do poço. Adicione 40 microlitros de amostra de vírus diluída no poço, começando da maior para a menor diluição, usando o lado do poço. Incubar a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir a absorção do vírus.Gire a placa cinco vezes a cada 15 minutos para permitir a absorção do vírus em toda a monocamada celular. Após uma hora de incubação, remova e descarte a suspensão do vírus da menor concentração para a mais alta. Lave as células infectadas duas vezes com 60 mililitros de HBSS.Sobrepor os poços com matriz extracelular suplementada com SFB a 2%. Para os poços de controle positivo, diluir a trombina em 20 unidades por mililitro com matriz extracelular suplementada com SFB a 2% e sobrepor os poços com trombina contendo meio de matriz extracelular, utilizando o lado do poço. Agora clique na guia agendar e adicione uma etapa no canto superior esquerdo.Navegue até Step_3 e modifique as varreduras para 3, 601 e o intervalo para dois minutos. Clique em aplicar e, em seguida, clique em OK na janela exibida. Coloque a placa de microeletrodo de ouro especializado infectado com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura.Finalmente, clique em Step_3 e clique em iniciar continuar no canto superior esquerdo do software. O valor do índice celular de HUVECs infectados com o vírus Zika P6-740 em uma multiplicidade de infecção de 0,1 começou a cair em 15 horas após a infecção, em comparação com o controle de infecção negativo. Os HUVECs infectados com uma dose mais alta do vírus Zika P6-740 em uma multiplicidade de infecção de um mostraram uma queda no índice celular em 11 horas após a infecção.Nas 24 horas pós-infecção, houve uma queda de 5% e 7% no valor do índice celular normalizado quando as células endoteliais foram infectadas em uma multiplicidade de infecção de 0,1 e um, respectivamente. Uma redução de 50% no valor do índice celular normalizado foi registrada em 96 horas pós-infecção e 66,75 horas pós-infecção após a infecção em uma multiplicidade de infecção de 0,1 e um, respectivamente. O valor do índice celular normalizado atingiu seu ponto mais baixo em 107 horas após a infecção, com uma redução de 51% e 60% após a infecção em uma multiplicidade de infecção de 0,1 e um, respectivamente.O valor normalizado do índice celular apresentou um aumento de 4% e 13% a partir de 107 horas após a infecção até o final do experimento às 168 horas após a infecção. Antes de cada experimento RTCA, uma corrida de verificação do resistor usando a placa RTCA de 96 poços é essencial para garantir que cada biossensor funcione bem para produzir valores confiáveis de índice celular.

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Research

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Biology

Biologia

Este protocolo de vídeo ilustra o isolamento e cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) de cordão umbilical humano. Uma vez isolados essas células podem ser usadas em ensaios de angiogênese in vitro como o Gel de fibrina Optimized Bead Assay também demonstrada pelo laboratório Hughes.

Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

A técnica de impedância elétrica em tempo real baseado medir Invasão de monocamada de células endoteliais por células cancerosas

Este artigo primeiro descreve um procedimento para isolar células endoteliais humanas a partir de veias umbilicais e, em seguida, mostra como usar estas células para examinar transmigração de neutrófilos em condições de escoamento. Ao utilizar uma câmara de fluxo de baixo volume feita a partir de um polímero com as características ópticas do vidro, ao vivo de células imagem fluorescente de populações de células raras é também possível.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neste vídeo, demonstramos o processo de monitoramento em tempo real de eventos celulares, incluindo a proliferação de células aderentes, por meio de um ensaio de impedância celular. Aqui, as células aderentes atuam como isolantes, restringindo o fluxo de corrente entre os eletrodos e aumentando a impedância.

Análise baseada em impedância celular para monitoramento de processos celulares em tempo real

Este vídeo descreve uma técnica baseada em impedância celular para estudar a cinética de sobrevivência de vírus que induzem efeitos citopáticos. O método mede a impedância elétrica de células aderentes infectadas por vírus pré-tratadas com solução salina.

Ensaio de cinética de sobrevivência baseado em impedância celular para avaliar a sobrevivência do vírus

Este protocolo avaliados eléctrico Cell-substrato impedância de detecção, um método para gravar e analisar o espectro de impedância de células aderentes, para a quantificação da ligação da célula, a proliferação, a motilidade, e as respostas celulares a estímulos farmacológicos e tóxicos. Detecção de permeabilidade endotelial e avaliação de célula-célula e célula-substrato contatos são enfatizadas.

Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

As células endoteliais primárias da veia umbilical humana (HUVECs) foram cultivadas até a confluência dentro de um dispositivo de rede microfluídica. A junção celular endotelial e as distribuições de F-actina foram ilustradas e as mudanças na concentração de cálcio intracelular e na produção de óxido nítrico em resposta ao trifosfato de adenosina (ATP) foram quantificadas em tempo real em níveis celulares individuais.

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

Protocolos para cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), transfecção transitória de marcadores marcados com fluorescência de crescimento de microtúbulos, imagens de células vivas e análise automatizada da dinâmica de crescimento de microtúbulos interfásicos são detalhados.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

Relatado aqui é um protocolo para a quantificação de partículas virais infecciosas usando monitoramento em tempo real da impedância elétrica de células infectadas. Uma aplicação prática deste método é apresentada quantificando a decadência do vírus influenza A sob diferentes parâmetros físico-químicos imitando condições ambientais.

Monitorando a sobrevivência do vírus da influenza fora do hospedeiro usando análise celular em tempo real

Aqui, demonstramos o uso da impedância elétrica baseada em células (CEI) como um método muito fácil e direto para estudar a infecção e replicação do vírus Zika em células humanas em tempo real. Além disso, o ensaio CEI é útil para a avaliação de compostos antivirais.

Plataforma de impedância elétrica baseada em células para avaliar inibidores do vírus Zika em tempo real

O ensaio TCID50 relatado aqui utiliza medições de impedância em tempo real sem rótulo e o módulo de Virologia do sistema para monitorar objetivamente os efeitos citopáticos (CPE) induzidos pelo vírus em tempo real. Esse ensaio simplificado reduz significativamente o tempo de atuação prática, ao mesmo tempo em que suporta medições de CPE cinética quantitativa de alto rendimento e possibilita cálculos automatizados e em tempo real do TCID50.

Um ensaio de Dose Infecciosa de Cultura de Tecidos de 50% em Tempo Real, Otimizado e Sem Marcação, usando Impedância para Quantificação Automatizada de Títulos Virais

Aprenda a monitorar alterações morfológicas em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) durante infecção viral usando análise celular em tempo real baseada em impedância. Este método não invasivo detecta efeitos transitórios como descolamento celular e vazamento vascular.

Monitorando Alterações em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana após Infecção Viral Usando Análise Celular em Tempo Real Baseada em Impedância (Vídeo) | JoVE Journal

Monitorando Alterações em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana após Infecção Viral Usando Análise Celular em Tempo Real Baseada em Impedância

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