Name: Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar somatas vestibulares e gangliões espirais de roedores neonatais para gravações de patch-clamp. Este método permite estudar propriedades eletrofisiológicas de neurônios do ouvido interno.

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Agradecemos aos Drs. Jing Bing Xue e Ruth Anne Eatock por suas primeiras contribuições a esses métodos. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NIDCD R03 DC012652 e NIH NIDCD DC012653S, e R01 DC0155512 para RK e T32 DC009975 para DB, NN e KR.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+diversity+and+the+organization+of+central+vestibular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways.</a> Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).</li>
<li>Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+set+spike+timing+regularity+of+mammalian+vestibular+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).</li>
<li>Smith, C. E., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stochastic+afterhyperpolarizaton+model+of+repetitive+activity+in+vestibular+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents.</a> Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).</li>
<li>Berglund, A. M., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+innervation+by+spiral+ganglion+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse.</a> The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).</li>
<li>Jagger, D. J., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+type+II+spiral+ganglion+neurones+identified+in+a+neonatal+rat+cochlear+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice.</a> Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).</li>
<li>Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+patterns+of+type+II+spiral+ganglion+neurons+in+vitro%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro).</a> The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).</li>
<li>Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv7-type+channel+currents+in+spiral+ganglion+neurons%3A+involvement+in+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).</li>
<li>Mo, Z. L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+firing+patterns+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).</li>
<li>Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity%2C+ontogeny%2C+and+cAMP+modulation+of+the+hyperpolarization-activated+current+in+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+recordings+at+afferent+dendrites+contacting+cochlear+inner+hair+cells%3A+Monitoring+multivesicular+release+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2442(2010).</li>
<li>Bronson, D., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+acetylcholine+receptors+modulate+HCN+channel+properties+in+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+components+of+membrane+conductance+in+the+giant+axon+of+Loligo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo.</a> The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).</li>
<li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+sodium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+ganglion+17eurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons.</a> Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).</li>
<li>Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential+in+mammalian+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The action potential in mammalian central neurons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).</li>
<li>Izhikevich, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIzhikevich%2C+EM+%22Dynamical+Systems+in+Neuroscience%22">Dynamical Systems in Neuroscience</a>. , MIT Press. (2018).</li>
<li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+depolarization-activated+potassium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).</li>
<li>Risner, J. R., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+potassium+conductances+contribute+to+the+diverse+firing+properties+of+postnatal+mouse+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).</li>
<li>Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-voltage-activated+potassium+channels+underlie+the+regulation+of+intrinsic+firing+properties+of+rat+vestibular+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).</li>
<li>Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity%2C+expression+and+functional+role+of+the+sodium-activated+potassium+current+in+vestibular+ganglion+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons.</a> Neuroscience. 240, 163-175 (2013).</li>
<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+cation+channels%3A+From+genes+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function.</a> Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).</li>
<li>Davis, R. L., Crozier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+firing+properties+of+type+I+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons.</a> Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+signaling+complex%3A+Regulation+of+type+I+spiral+ganglion+neuron+responses+in+the+auditory+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery.</a> Hearing Research. 336, 1-16 (2016).</li>
<li>Eatock, R. A., Christov, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEatock%2C+RA+%22Ionic+Conductances+of+Vestibular+Afferent+Neurons%3A+Shaping+Head+Motion+Signals+From+the+Inner+Ear%22">Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear</a>. , Elsevier. (2020).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+in+the+biophysical+properties+of+spiral-ganglion+and+vestibular-ganglion+neurons+in+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 710275(2021).</li>
<li>Armstrong, C. E., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+frog+saccular+hair+cells%3A+distortion+by+enzymatic+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).</li>
<li>Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+Kcnq4+in+vestibular+neurons+and+neurosensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia.</a> Brain Research. 1139, 117-125 (2007).</li>
<li>Meredith, F. L., Rennie, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+variations+in+K%2B+currents+in+vestibular+crista+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Cai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+activity+of+primary+auditory+neurons+in+the+presence+of+neurotrophins+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics.</a> Hearing Research. 350, 122-132 (2017).</li>
<li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li>
<li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li>
<li>Liu, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion%3A+NaV1.5%2C+NaV1.8%2C+and+tetrodotoxin-sensitive+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Os métodos aqui apresentados são específicos para registros de neurônios isolados; Estudos anteriores se concentraram em gravações de terminais de axônio em uma preparação semi-intacta. Quando comparados com as técnicas de gravação de terminais existentes, os registros isolados oferecem um comportamento de pinça espacial e isopotencial superior. Além disso, esse protocolo fornece acesso a uma amostra mais ampla de neurônios, uma vez que apenas subpopulações portadoras de cálice são acessíveis em registros semi-intactos d...

Os neurônios bipolares do nervo vestibulococlear conectam as células ciliadas sensoriais da orelha interna ao tronco encefálico. São os principais portadores de informações sobre sons e movimentos da cabeça; Danos a essas células importantes levam à surdez e distúrbios do equilíbrio. As porções vestibular e auditiva do nervo são compostas, cada uma, por tipos celulares distintos e morfologicamentediversos1,2. No sistema vestibular, duas subpopulações aferentes disparam espontaneamente em intervalos regulares ouirregulares2. Acredita-se que o tempo da espícula aferente reflita uma diversidade subjacente na composição dos canaisiônicos 3,4. No sistema auditivo, existem duas subpopulações principais de neurônios do gânglio espiral (GNG); enquanto os GNC Tipo I entram em contato com células ciliadas internas individuais5, os GNs Tipo II entram em contato com múltiplas células ciliadas externas5. Registros in vitro de culturas semi-intactas e organotípicas sugerem diferenças nas propriedades de membrana dos SGNs Tipo I e TipoII 6,7.
Muitos canais iônicos e receptores de neurotransmissores encontrados nos terminais desses neurônios também são encontrados em seus corpos celulares. Dessa forma, culturas do somato vestibular isolado e do gânglio espiral podem ser estudadas in vitro para entender como canais iônicos e receptores de neurotransmissores contribuem para a resposta desses neurônios. A morfologia compacta dos corpos celulares isolados permite registros elétricos de alta qualidade, adequados para a caracterização detalhada de canais iônicos dependentes de voltagem e receptores de neurotransmissores. O fácil acesso a uma variedade representativa de subtipos de neurônios permite a análise de alto rendimento da diversidade celular.
Este artigo apresenta um método para isolar e cultivar corpos de células ganglionares dissociadas da porção superior do gânglio vestibular em ratos no dia pós-natal (P)9 a P20. Também são apresentadas sugestões para estender esses métodos ao gânglio espiral, além das etapas necessárias para extrair, dissociar e plaquear com sucesso as células ganglionares. Esses métodos são uma evolução daqueles desenvolvidos em publicações de diversos laboratórios8,9,10. Também está incluída neste artigo a orientação para a seleção de células saudáveis para gravações de patch-clamp.
Finalmente, o protocolo descreve o procedimento para o registro de patch-clamp usando a configuração de patch perfurado11. Embora a configuração de patch perfurado seja mais demorada e tecnicamente mais desafiadora do que a configuração de patch rompido mais comum, ela é melhor para manter o meio citoplasmático que permite sessões de gravação longas e estáveis. Os benefícios dessa configuração de gravação são ilustrados aqui através da estabilidade melhorada das correntes catiônicas ativadas por hiperpolarização em remendo-perfurado em relação aos registros de mancha-rompida.
Este protocolo está organizado em cinco seções. As seções 1 a 3 descrevem soluções e ferramentas que podem ser preparadas e armazenadas com antecedência. A seção 4 descreve os passos para dissecar e plaquear os vestibulares e SGNs. A seção 5 descreve os passos para o registro dos neurônios após um período em cultura. Em nossas mãos, a seção 4 e a seção 5 são realizadas durante um período de 2 dias consecutivos.

<table><tbody><tr><td>Anfotericina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4888-100MG</td><td>Para gravações de patches perfurados.</td></tr><tr><td>ATP di-sódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>Aditivo para solução interna</td></tr><tr><td>B27 Suplemento (50x), sem soro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>aditivo para meio de cultura, para SGN</td></tr><tr><td>Beakers (1000, 100, 10) mililitro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de bancada</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Bico de</td><td></td><td></td><td></td> Bunsen</tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td>Aditivo para solução interna</td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5318</td><td>uma enzima de três para digerir tecido</td></tr><tr><td>Tampa de vidro, retangular, espessura #1, 22x40&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0707</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biotium</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, do pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>uma enzima de três para digerir tecidos</td></tr><tr><td>Dumont #3 Fórceps (Blunt)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps (Fine)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Fórceps ( Fine)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>Aditivo para solução interna</td></tr><tr><td>Extrator de Eletrodos</td><td>Narashige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz de epi-iluminação&nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>CL 1500 ECO</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>para limpeza da cabeça e ao redor da bancada de dissecação</td></tr><tr><td>Capilares de borossilicato filamentoso para eletrodos</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF140-117-10</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de dissecção de arestas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>para puxar pipetas de trituração</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Inativado</td><td>por Calor Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td>aditivo para meio de cultura</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>para tamponamento de pH todas as soluções no protocolo</td></tr><tr><td>Placa quente / agitadores magnéticos&nbsp;</td><td>VWR</td><td>76549-914</td><td></td></tr><tr><td>Balde isolado cheio de gelo</td><td></td><td></td><td>para manter todas as amostras e soluções frescas</td></tr><tr><td>K2SO4, sulfato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9458-250G</td><td>Aditivo à solução interna</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P93333</td><td>Aditivo à solução interna</td></tr><tr><td>KOH (1 M)</td><td>Honeywell</td><td>319376-500ML</td><td>Para trazer solução interna para pH desejado.</td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Grande</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14133-13</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz médio&nbsp;</td>Soluções de <td>dissecação e banho</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td></tr><tr><td>Câmara de gravação de banho de baixo perfil para pratos de cultura</td><td>Seringas Luer-Lok Warner Instruments</td><td>64-0236</td><td></td></tr><tr><td>, 302832 BD de 30 ml</td><td></td><td></td><td>para aspiração de solução L-15/HEPES/HEPES.</td></tr><tr><td>Suplemento MEM + Glutamax</td><td>Fisher Scientific</td><td>41-090-101</td><td>base do meio de cultura</td></tr><tr><td>MgCl2-Hexahidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Aditivo para solução interna</td></tr><tr><td>agulha microFil para enchimento de micropipetas - calibre 34;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narashige</td><td>MF-90</td><td>Para polimento de eletrodos.</td></tr><tr><td>Suplemento N2 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>aditivo para meio de cultura, para</td></tr><tr><td>SGN NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Aditivo para solução interna</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>Thomas Scientific</td><td>319511-500ML</td><td>para titulação pH</td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Advanced Instruments Inc.</td><td>3320</td><td></td></tr><tr><td>Oxigênio, grau médico, com regulador e tubulação adequados</td><td>USC Material Management</td><td>MEDOX200 (Identificador: 00015)</td><td>para dissolução em soluções de dissecação e banho</td></tr><tr><td>Bulbo de pipeta Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur (3 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td>bulbo para pipetas de trituração</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Aditivo</td><td>científico 15140122</td><td>para prevenir a contaminação do meio de cultura</td>Solução de</tr><tr><td>eutanásia à base de pentobarbital (por exemplo, dosagem Fatal Plus. 50 &ndash; 60 mg/kg)&nbsp;</td><td>MWI Animal Health</td><td>15199</td> para filtros de membrana PES <td>de eutanásia</td></tr>, <tr><td>0,2 micrômetro.</td><td>Nalgene</td><td>566-0020</td><td>para soluções de filtragem</td></tr><tr><td>Filtros de seringa estéril de membrana PES, 0,22 um, 30 mm&nbsp;</td><td>CELLTREAT</td><td>229747</td><td>para filtrar soluções aspiradas em seringas Placas</td></tr> de <tr><td>Petri, 35 x 10 mm</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-103</td><td>para micro dissecação e para segurar Solução de imersão de ponta em configuração de remendo perfurado</td></tr><tr><td>Placas de Petri, 60 x 15 mm</td><td>Midland Scientific</td><td>P7455</td><td>para dissecção bruta</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Mettler Toledo</td><td>Modelo S20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetadores (1000, 200, 10) microlitro</td><td>usa scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura com fundo de vidro revestido de poli-d-lisina</td><td>Mattek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>para revestir neurônios para cultura</td></tr><tr><td>Plataforma de troca rápida, base aquecida, para placas de cultura de 35 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Referência Cell</td><td>World Precision Instruments</td><td>RC1T</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi</td><td>Miltex</td><td>4-315</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Bisturi</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Escala Científica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Sorológicas (10, 25) mililitros</td> Kit de Graxa <td>de Silicone Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(para vedação de lamínula e câmara)</td> <td>Warner Instruments</td><td>64-0378</td><td></td></tr><tr><td>Guilhotina para Pequenos Animais</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>Guilhotina para pequenos animais</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td>para decapitação em dissecar ratos com mais de P15.</td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecção Estéreo&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica reta</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Seringa (3, 10, 30) mililitro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td>uma de três enzimas para digerir tecido</td></tr><tr><td>Seringa tuberculina&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881500105</td><td>para a administração de solução de eutanásia por injeção intraperitoneal</td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas, 2,5 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Balão volumétrico, 1000 mililitros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>945300</td><td></td></tr><tr><td>Água estéril, R>18,18 megaOhms cm (por exemplo, filtrada por uma purificação de água Millipore-Sigma sistema)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>CDUFBI001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultivo de somatas vestibulares e gangliões espirais de roedores neonatais para gravações de patch-clamp

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

A morfologia compacta dos neurônios ganglionares isolados e cultivados da orelha interna permite caracterizações detalhadas dos canais iônicos e receptores de neurotransmissores que contribuem para a diversidade celular nesta população. Este protocolo descreve os passos necessários para o sucesso da dissecação, dissociação e cultura em curto prazo da somata de neurônios bipolares da orelha interna para fins de gravações de patch-clamp. Instruções detalhadas para a preparação dos neurônios do gânglio vestibular são fornecidas com as modificações necessárias para o plaqueamento dos neurônios do gânglio espiral. O protocolo inclui instruções para a realização de gravações de patch-clamp de células inteiras na configuração de patch perfurado. Resultados de exemplo que caracterizam os registros de clamp de tensão de correntes mediadas por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (HCN) destacam a estabilidade da configuração de gravação de patch perfurado em comparação com a configuração mais padrão de patch rompido. A combinação desses métodos, somata isolada mais registros perfurados de patch-clamp, pode ser usada para estudar processos celulares que requerem registros longos e estáveis e a preservação do meio intracelular, como a sinalização através de receptores acoplados à proteína G.

A execução de protocolos de fixação de tensão através da aplicação de famílias de passos de tensão revela a ativação dependente de tensão de uma variedade de diferentes famílias de correntes. Exemplos representativos de correntes de células inteiras evocadas a partir de um VGN e adaptadas de registros publicados13 são mostrados na Figura 1A,B. A aplicação de tensões despolarizantes (Figura 1B) ativa uma corrente interna (...

São apresentados métodos que fornecem instruções detalhadas para dissecar, dissociar, cultivar e registrar patch-clamp dos neurônios do gânglio vestibular e do gânglio espiral da orelha interna.

Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Muitos canais iônicos e receptores de neurotransmissores que são encontrados nos terminais dos neurônios aferentes auditivos e vestibulares também são encontrados em seus corpos celulares. Culturas de corpos celulares isolados podem ser estudadas in vitro para entender como esses canais iônicos e receptores influenciam as respostas dos neurônios. A morfologia compacta dos corpos celulares permite registros elétricos de alta qualidade para caracterizar as propriedades voltagem-dependentes dos canais iônicos e receptores de neurotransmissores.Além disso, o fácil acesso a uma ampla variedade de tipos celulares permite um alto rendimento por meio de uma análise física da diversidade celular. Os procedimentos serão demonstrados pela aluna de pós-graduação Katherine Regalado, juntamente com os bolsistas de pós-doutorado, Dr.Daniel Bronson e Nathaniel Nowak do meu laboratório. Para começar, segure uma pipeta de pastagem de vidro à chama de um queimador de Bunsen para preparar pipetas de tritração para dissociação celular.Quando a ponta de vidro começar a derreter, estique o vidro até o diâmetro desejado da ponta. Puxe uma extremidade da pipeta para longe da chama para criar uma pequena cu

isolating-culturing-vestibular-spiral-ganglion-somata-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o processo de isolamento de explantes de gânglios espirais do ouvido interno e co-cultura com o órgão de Corti em uma matriz de multieletrodos. Os gânglios espirais são cuidadosamente extraídos e seccionados em seções de tecido menores ou explantes. Esses explantes são cultivados na área ativa da matriz de multieletrodos para promover o crescimento do processo neuronal.

Cultura de explantes de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de multieletrodos

Este vídeo mostra um método para isolar neurônios vestibulares do ouvido interno de um filhote de camundongo. Ele descreve meticulosamente as etapas envolvidas na dissecação do ouvido interno, na colheita do gânglio vestibular e, posteriormente, na dissociação do gânglio em células únicas. Essas células são então cultivadas em placas com fundo de vidro para estabelecer uma cultura de neurônios vestibulares.

Isolando neurônios do gânglio vestibular de um ouvido interno de camundongo

Este vídeo demonstra uma técnica de patch-clamp de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana. Uma pipeta de vidro fina com um eletrodo é usada para abordar as células amácrinas starburst (SACs) dentro da retina. Depois de formar uma vedação, a sucção é aplicada para romper a membrana e formar a configuração de patch clamp de célula inteira. Finalmente, o fluxo de íons através dos receptores sinápticos SAC é medido usando a configuração.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana

Este vídeo demonstra a técnica patch-clamp para medir correntes iônicas em corpos celulares de neurônios sensoriais do ouvido interno. Ele detalha a preparação e o uso de uma pipeta de grampo de remendo polida preenchida com uma solução interna contendo anfotericina B, que perfura a membrana para permitir o movimento de íons, preservando as condições intracelulares. Os pulsos de tensão são aplicados para acionar e registrar a atividade do canal iônico, fornecendo informações sobre suas...

Gravações perfuradas de patch-clamp de corpos celulares de neurônios sensoriais do ouvido interno

A estimulação do nervo infravermelho tem sido proposto como uma alternativa para a estimulação eléctrica em uma variedade de tipos de nervos, incluindo os que estão associados ao sistema auditivo. Este protocolo descreve um método de patch clamp para estudar o mecanismo da estimulação do nervo no infravermelho de uma cultura de neurónios auditivos primários.

Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

Análise da função das células ciliadas vestibular é complicada por sua localização profunda na parte mais difícil do crânio, no osso temporal petroso. A maioria dos estudos com células capilares funcionais têm utilizado intensamente as células ciliadas isoladas. Aqui nós descrevemos uma preparação semi-intactos do epitélio vestibular rato para estudos eletrofisiológicos e de microscopia de dois fótons.

Uma preparação semi-intactas isolada do Rato Vestibular epitélio sensorial de Eletrofisiologia e de alta resolução Microscopia de dois fótons

Nós descrevemos a dissecação do sistema nervoso do mar marinho...

Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

Este manuscrito descreve como preparar gânglios da raiz dorsal intactos para gravações de patch clamp. Esta preparação mantém o microambiente para neurônios e células gliais satélites, evitando assim as alterações fenotípicas e funcionais observadas usando neurônios DRG dissociados.

Remendo Recordings Grampo na Intact gânglios das raízes dorsais de ratos adultos

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, purificação e cultivo de células marginais primárias da stria vascular do camundongo, e para estabelecer modelos in vitro de estresse oxidativo e senescência celular para estudar distúrbios da parede lateral coclear.

Isolamento e Cultura de Células Marginais Primárias da Stria Vascularis de Camundongos Neonatais

We present a new dissection method to extract the vestibular ganglion and all five vestibular organs (utricle, saccule, and three cristae: lateral/horizontal, anterior, and posterior) as one whole-mount vestibular complex. Confocal imaging allows visualization of vestibular neuron cell bodies for quantification, as well as neuronal projections to the sensory...

Whole-Mount Dissection of the Vestibular Complex and Quantification of Vestibular Ganglion Neurons in Mice

Aprenda a isolar e cultivar somatas vestibulares e gangliões espirais de roedores neonatais para gravações de patch-clamp. Este método permite estudar propriedades eletrofisiológicas de neurônios do ouvido interno.

Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp

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