Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Este protocolo permite a identificação de parceiros de ligação a proteínas de uma sequência de RNA conhecida, puxando-os para baixo do extrato celular usando oligonucleotídeos de RNA biotinilados. Em comparação com métodos que requerem detergentes ou altas temperaturas para separar as proteínas do RNA, esses protocolos usam condições muito brandas que permitem também preservar potenciais complexos proteicos. Quem demonstrará o procedimento será Jakob Rupert, um estudante de doutorado sob minha disposição.

Comece a colheita total de proteína removendo o meio dos poços da placa de célula HEK 293T e lave os poços das seis placas de poço com um mililitro de PBS. Descarte o PBS e transfira as placas para o gelo, antes de adicionar 200 microlitros de tampão de lise a cada poço. Separar e quebrar as células usando um raspador de células antes de transferir o extrato celular derivado de dois poços para o mesmo tubo de 1,5 mililitro.

Após 30 minutos de incubação em gelo e centrifugação, transferir o sobrenadante para um tubo pré-resfriado. Em seguida, calcule o volume de extrato proteico correspondente a 1,5 miligramas de proteínas. Em seguida, leve todas as amostras a um volume final de 600 microlitros usando um tampão de lise.

Mantenha as amostras no gelo até o uso. Para preparar as contas, misture-as no buffer de armazenamento mexendo no tubo. Depois de calcular os 100 microlitros de meio de lama por amostra, coloque o volume calculado da lama em um rack magnético.

Para lavar as contas, remova a solução de armazenamento e lave as contas adicionando um mililitro de tampão de lise e invertendo-o manualmente. Em seguida, remova o tampão usando o rack magnético e repita a etapa de lavagem. Às contas, adicione um volume de tampão de lise igual ao volume inicial do meio de lama e misture-o agitando o tubo antes de distribuir o meio uniformemente em tantos tubos de 1,5 mililitro quanto as amostras.

Para o bloqueio de contas, remova o tampão usando o rack magnético e adicione 600 microlitros de 0,25 miligramas por mililitro de solução de TRNA de levedura preparada em tampão de lise. Incubar durante uma hora à temperatura ambiente numa roda giratória. Remova a solução de TRNA usando o rack magnético antes de adicionar 600 microlitros de tampão de lise e lave-a misturando manualmente.

Repita a etapa de lavagem e descarte o tampão. Para cada tubo contendo os 100 microlitros iniciais do meio de lama, prepare 200 microgramas de oligonucleotídeo de RNA em 600 microlitros de tampão de lise. Adicione o oligo às contas e incube por uma hora à temperatura ambiente enquanto gira.

Retire a solução das esferas e lave duas vezes com 600 microlitros de tampão de lise, girando os tubos durante cinco minutos cada um à temperatura ambiente. Descarte o buffer. Para ligação de proteínas em contas, separe 5% ou 30 microlitros de volume da solução proteica de 600 microlitros e mantenha-a como entrada ou IN para análise posterior.

Adicione a mistura de proteína restante a cada tubo de contas carregadas e incube com rotações lentas durante a noite a quatro graus Celsius. Remova a fração de proteína não ligada das esferas usando o rack magnético. Economize 5% ou 30 microlitros de seu volume e rotule-o através ou FT. Adicione um mililitro de tampão de lavagem 1 às contas e gire-o por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Descarte o buffer e repita essa lavagem uma vez. Adicione um mililitro de tampão de lavagem 2 às contas. E depois de incubar a quatro graus Celsius em um rotador por cinco minutos, descarte o sobrenadante.

Para eluir os ligantes específicos, adicione 100 microlitros de tampão de eluição 1 às contas. Depois de misturar manualmente por agitação, incube-o por cinco minutos à temperatura ambiente. Coloque os tubos numa batedeira térmica e agite vigorosamente durante cinco minutos a 95 graus Celsius.

Em seguida, coloque o tubo no rack magnético e colete a fração eluída em um tubo limpo. Uma vez feito, gire rapidamente as contas com uma centrífuga de bancada para maximizar a recuperação do eluato. E economize 5% ou cinco microlitros do volume total de eluato ou EL para análises posteriores.

As proteínas eluídas foram identificadas por espectrometria de massas. A plotagem das proteínas significativamente enriquecidas em um gráfico de vulcão revelou que o conteúdo de proteína total e as proteínas enriquecidas eluídas do RNA foi significativamente maior do que o RNA, sugerindo que o RNA pode estabelecer um número maior de interações específicas. Como exemplos da concordância entre os resultados previstos e obtidos, os escores de interação para mais RNA e menos RNA com proteínas do proteoma humano mostraram que HNRNPH3 foi previsto para se ligar mais RNA seletivamente, e PCBP2 para interagir especificamente com RNA.

Além disso, a proteína RBM41 foi prevista como promíscua para ambos os oligonucleotídeos de RNA. A análise por espectroscopia de massa das amostras de ensaio pull-down de proteínas confirmou a presença de HNRNPH3 no RNA e PCBP2 no RNA negativo. Enquanto RBM41 foi encontrado para interagir com ambos.

Western blot foi utilizado para detectar a presença de TDP-43 nas etapas de otimização dos resultados e protocolos. No RNA, o TDP-43 foi observado na amostra de entrada e no eluato, indicando sua presença desde o início. O TDP-43 foi retido por RNA durante as etapas de lavagem e eluído no final com um tampão salino alto.

Ao mapear interações de RNA de proteínas, este método pode revelar redes macromoleculares por trás de muitas vias fisiológicas. Por exemplo, regulação transcricional ou mecanismos patológicos, incluindo câncer e neurodegeneração.