Name: Isolamento e purificação de β-glucanas fúngicas como estratégia de imunoterapia para glioblastoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprenda a purificar β-glucanas fúngicas de Pleurotus ostreatus, Ganoderma lucidum e outras espécies para imunoterapia contra glioblastoma. Este método demonstra ativação de microglia e potencial antitumoral.

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Gostaríamos de agradecer à Dra. Vasiliki Economopoulos por seu script interno para medir o sinal de fuluorescência no ImageJ. Gostaríamos também de agradecer ao CITIUS (Universidade de Sevilha) e a todo o seu pessoal pelo apoio durante a manifestação. Este trabalho foi apoiado pelo espanhol FEDER I + D + i-USE, US-1264152 da Universidade de Sevilha, e pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00

As quatro diferentes variantes de cogumelos descritas neste protocolo foram obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Isolamento de β-glucanas fúngicas
<ol><li>Extração e isolamento de polissacarídeos solúveis de cogumelos OBS: Polissacarídeos solúveis de cogumelos (SMPs) foram obtidos de acordo com o procedimento esquematicamente mostrado na Figura 1.<ol><li>Enxaguar suavemente os corpos frutíferos frescos de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum (cerca de 2.000 g/cogumelo) em água destilada cinco vezes.</li>
		<li>Secar os corpos frutíferos a 50 ± 2 °C numa estufa convencional de secagem ao ar até atingir um peso constante (~24 h).</li>
		<li>Moer os cogumelos secos em um moinho de lâminas, obtendo cerca de 200 g de pó de cada cogumelo.</li>
		<li>Suspender 100 g de pó de cogumelo (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum) em 1.000 mL de H2Od. Em seguida, autoclave a 121 °C por 15 min e, finalmente, deixar em temperatura ambiente por 30 min.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão resultante a 6.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Secar o precipitado contendo polissacarídeos insolúveis de cogumelos (PIM) a 50 ± 2 °C numa estufa de secagem ao ar durante 24 horas.</li>
		<li>Descarte o precipitado e mantenha o sobrenadante. Concentrar o sobrenadante 10 vezes em um evaporador rotativo.</li>
		<li>Precipitar o concentrado contendo SMPs com etanol (concentração final de 80%) a 4 °C durante a noite.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de etanol a 6.000 x g por 15 min a 4 °C, reter o pellet (precipitado) e descartar o sobrenadante com uma pipeta.</li>
		<li>Lavar o precipitado três vezes com etanol a 80% antes de dissolvê-lo em H2Od (10% p/v). Ajustar o pH para 6,5/7 e a temperatura para 37 °C e tratar com 2 u e 4 U de α-amilase e glucoamilase, respectivamente, para solubilizar α-glucanas seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Após o tratamento com α-amilase/glucoamilase, ajustar o pH e a temperatura para 8,0 e 50 °C, respectivamente, e tratar com alcalase (2,5 U/g de proteína) (ver Tabela de Materiais) para solubilizar as proteínas. NOTA: Este tratamento enzimático sequencial remove a maioria dos α-glucanos e proteínas que co-precipitam com β-glucanos na precipitação de etanol.</li>
		<li>Após hidrólise, centrifugar o hidrolisado a 6.000 x g por 15 min a 4 °C e o sobrenadante limpo concentrado cinco vezes em evaporador rotativo. Precipitar novamente com etanol 80%.</li>
		<li>Solubilizar o precipitado resultante em H2Od e dialisar em água destilada por 24 h usando membranas de tubos de celulose (membranas de corte de 12.000 Da; ver Tabela de Materiais) para remover moléculas de baixo peso molecular. Recuperar a porção solúvel em água e liofilizá-la para produzir β-glucanas solúveis (SβGs).</li>
	</ol></li>
	<li>Medição de açúcar e proteína<ol><li>Medir o teor de açúcares totais de cada fração pelo método fenol-ácido sulfúrico, utilizando glicose como padrão8. NOTA: A quantificação do teor de β-glucana também pode ser feita usando o kit de ensaio de β-glucana (cogumelo e levedura; ver Tabela de Materiais), com base na hidrólise enzimática e na atividade das oxidorredutases: exo-1,3-β-glucanase, glicose oxidase, β-glucosidase e peroxidase, com a subsequente formação da quinoneimina. Siga as instruções do fabricante, com pequenas modificações.</li>
		<li>Use 18 MH 2 SO4 em vez de 12 MH2SO4.</li>
		<li>Avaliar o teor de glucanas totais e α-glucanas separadamente.</li>
		<li>Meça os valores de β-glucano resultantes como a diferença entre os valores totais de glucano e α-glucano (triplicata) seguindo o protocolo de Kjeldahl. Em certos casos, o teor de proteína pode ser determinado pelo método de Lowry, utilizando-se a albumina para traçar a curva de calibração11,12.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise por espectroscopia de absorção no ultravioleta<ol><li>Obter os espectros ultravioleta (UV) de SβG usando um espectrofotômetro UV-visível (ver Tabela de Materiais) escaneando as amostras na região de 200-400 nm (Figura 2).</li>
		<li>Preparar 1,0 mg/mL de cada SβG em H2Od, transferir a solução para uma cubeta de quartzo e escanear à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise da distribuição de peso molecular<ol><li>Estimar a homoegeneidade de SβGs e a massa molecular de polímeros por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (ver Tabela de Materiais) equipado com um detector de índice de refração e uma coluna de filtração linear em gel ultra-hidrogel (300 mm x 7,8 mm; Gráfico 3).</li>
		<li>Realizar o ensaio a 40 °C usando água deionizada como eluente a uma vazão de 0,5 mL/min-1 e dextrans (110, 80 e 50 kDa) como padrões (ver Tabela de Materiais). Coletar uma fração de 5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)<ol><li>Registre os espectros no infravermelho (Figura 4) em um espectrômetro FTIR na faixa de 4000-500 cm-1. As amostras devem ser previamente misturadas com KBr para formar filmes (procedimento FTIR padrão; consulte as instruções do fabricante e Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Análise da composição molecular<ol><li>Estimar as composições moleculares de SβGs por cromatografia em camada delgada de alta eficiência (HPTLC) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS), seguindo procedimentos padrão12.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Estudo in vitro da estimulação da microglia induzida por β-glucanos
<ol><li>Cultura celular de células de glioblastoma e microglia de camundongos em lâminas de câmara de 8 poços NOTA: Este protocolo é específico para linhagens celulares GL261 (glioblastoma) e BV2 (microglia). No entanto, com pequenas modificações, essas etapas poderiam potencialmente ser usadas para estudar outras linhagens de células cancerígenas e imunes.<ol><li>Preparar meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) modificado com L-glutamina, 4,5 g/L D-glicose e sem piruvato. Adicionar 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Pré-aqueça o material em banho-maria a 37 °C por 15 min.</li>
		<li>Descongelar alíquotas BV2 e GL261 congeladas em banho-maria (37 °C) por 2 min e, pouco antes de descongelar completamente, transportá-las para uma capela de fluxo laminar e plaquear as células em dois frascos T25 estéreis diferentes (um para cada linhagem celular).</li>
		<li>Incubar os frascos T25 a 37 °C, 5% CO2 até que a cultura seja confluente. NOTA: Dependendo das condições de congelamento e do tempo de criopreservação, o tempo até a confluência pode variar. Essas linhagens celulares geralmente necessitam entre 3 a 5 dias para atingir a confluência em um frasco T75.</li>
		<li>Depois que a cultura de células BV2 se tornar confluente, transfira-a para lâminas de câmara de 8 poços 0,6 x 106 células/poço. Mantenha as corrediças da câmara de 8 poços na incubadora por 24 horas.</li>
		<li>Uma vez que as células da microglia são plaqueadas nas lâminas da câmara de 8 poços, repita o mesmo protocolo com as células GL261.</li>
	</ol></li>
	<li>Ativação da microglia com β-glucanas<ol><li>Revestir as células BV2 com quatro diferentes β-glucanas (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus) na concentração de 0,2 mg/mL por 72 h. Uma condição experimental deve permanecer sem tratamento (meio normal), atuando como grupo controle.</li>
		<li>Recolher o sobrenadante com uma pipeta após 72 h e passar o volume restante através de um filtro de seringa de 0,20 μm. Em seguida, congelar o sobrenadante a -80 °C por pelo menos 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamento do GL261 com meio pré-ativado condicionado por microglia<ol><li>Uma vez que o GL261 esteja 80% confluente dentro das lâminas da câmara de 8 poços, adicionar meio microglial tratado com β-glucano (passo 2.2.2) a uma concentração de volume final de 25% por 72 h (volume total: 250 μl/poço).</li>
		<li>Retire o meio após 72 h de incubação e descarte-o.</li>
		<li>Lavar as células com tampão fosfato salino (PBS; pH 7,4, 0,1 M) três vezes por 5 minutos.</li>
		<li>Fixar as células adicionando 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 °C durante 15 minutos. NOTA: Dependendo dos diferentes anticorpos que podem ser usados para imunofluorescência, os métodos de fixação podem diferir dos PFA típicos de 4%. Os fixadores à base de álcool podem ser mais eficientes na preservação de certos epítopos.</li>
	</ol></li>
	<li>Estudo de imunofluorescência<ol><li>Lavar as amostras com PBS com triton X (PBST; 0,01%) por 10 min três vezes.</li>
		<li>Retirar o PBST e adicionar tampão de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 10% em PBST (Tabela 1) por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remover o tampão de bloqueio e adicionar 200 μL por poço de PBS contendo a mistura de anticorpos primários (1:500 anticorpo monoclonal Ki-67 de rato e 1:500 anticorpo caspase-3 clivado de coelho; ver Tabela de Materiais). Incubar durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Após 24 h de incubação a 4 °C, deixar as amostras à temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Lave os poços três vezes por 10 min com PBS em um agitador (baixa velocidade).</li>
		<li>Remova o PBS e substitua por 200 μL por poço de PBS contendo a mistura de anticorpos secundários (1:200 anti-rato anti-rato IgG (H + L) anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 488 e 1:200 burro anti-coelho IgG (H + L) anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 647; ver Tabela de Materiais) por 45 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
		<li>Lave as amostras com PBS por 10 min em um agitador multiuso.</li>
		<li>Retirar o PBS e adicionar 200 μL por poço de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluído em PBS (1:5.000) por 1 min.</li>
		<li>Remova o DAPI (ver Tabela de materiais) e lave as células por 5 minutos em PBS.</li>
		<li>Retire a estrutura do poço e adicione 50 μL de PBS:glicerol (1:1) em cada poço e cubra com uma lamínula.</li>
		<li>Sele as lâminas com esmalte.</li>
		<li>Adquira imagens a 20x usando um sistema de microscópio confocal (ver Tabela de materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Quantificação e análise da proliferação celular tumoral e apoptose
NOTA: Para medir o efeito potencial dos diferentes β-glucanos sobre a proliferação celular tumoral e apoptose, um script in house foi utilizado no software ImageJ para quantificar o número de pixels positivos de Ki67 (proliferação) e cCasp3 (apoptose)13.
<ol><li>Abra o ImageJ. Clique no botão Plugins . Clique em Coloc2, um plugin previamente instalado na pasta do plugin, e finalmente selecione a imagem para analisar11. NOTA: Este plugin foi disponibilizado após contato anterior com o Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Em vez do script, tanto o software ImageJ quanto o Fiji têm ferramentas diferentes para análise de colocalização (veja Tabela de materiais), com propriedades semelhantes.</li>
	<li>Defina limiares de acordo com as condições de controle (não tratadas, somente DMEM). Clique no botão OK . NOTA: Para evitar discrepâncias de fundo e intensidade, todas as imagens devem ser tiradas nas mesmas condições. Preferencialmente, as sessões de imagem devem ser realizadas no mesmo dia, e os parâmetros microscópicos inalterados entre as imagens.</li>
	<li>Certifique-se de que as imagens resultantes dos pixels colocalizados e uma janela de resumo que forneça a porcentagem ou o número bruto de pixels acima do limite sejam exibidas. Normalizar os resultados com relação às condições de controle (não tratadas). NOTA: Todos os dados são dados como média ± MEV. A análise estatística foi realizada por meio de gráficos e softwares de análise (ver Tabela de Materiais). Utilizou-se ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Tukey. Os erros são representados como erro padrão da média (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).</li>
</ol>

<ol><li>Aldape, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+curing+primary+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Challenges to curing primary brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).</li>
<li>Himes, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+glioblastoma%3A+current+understanding+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications.</a> Frontiers in Oncology. 11, 770561(2021).</li>
<li>Ma, J., Chen, C. C., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2Fmicroglia+in+the+glioblastoma+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Macrophages/microglia in the glioblastoma tumor microenvironment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5775(2021).</li>
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<li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidative+activities+and+chemical+characterization+of+polysaccharides+extracted+from+the+basidiomycete+Schizophyllum+commune%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune.</a> Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).</li>
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<li>Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+mushrooms+and+beta-glucans%3A+impact+on+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health.</a> Nutrients. 13 (7), 2195(2021).</li>
<li>Klaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+edible+mushroom+Laetiporus+sulphureus+as+potential+source+of+natural+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Sciences+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants.</a> International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).</li>
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<li>Holubec, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptosis+by+immunohistochemical+markers+compared+to+cellular+morphology+in+ex+vivo-stressed+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).</li>
<li>Borges, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polysaccharide+production+by+a+strain+of+Pleurotus+djamor+isolated+in+the+south+of+Brazil+and+antitumor+activity+on+Sarcoma+180%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).</li>
<li>Sohretoglu, D., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganoderma+lucidum+polysaccharides+as+an+anti-cancer+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).</li>
</ol>

Não há interesses concorrentes a declarar.

Este trabalho descreve o uso de técnicas bem estabelecidas para isolar, purificar e caracterizar com sucesso o conteúdo de SβGs de quatro fungos diferentes. Os resultados mostraram como após a extração em água quente das SMPs, obtidas de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus, seguida de tratamento hidrolítico com α-amilase, glucosidase e protease, os teores de α-glucana e proteína foram reduzidos, enriquecendo significativamente a quantidade de SβGs puros.
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Apesar do advento de novas conquistas no campo da neuro-oncologia, a expectativa de vida dos pacientes com glioblastoma permanece escassa. As terapias padrão-ouro contra tumores cerebrais são baseadas na fusão de cirurgia, radioterapia e quimioterapia. No entanto, na última década, a imunoterapia emergiu como uma poderosa estratégia para o tratamento de diferentes tipos decâncer1. Assim, a possibilidade de aproveitar a resposta imune do organismo contra as células tumorais tornou-se recentemente o quarto pilar da oncologia.
Há muito se sabe que um dos maiores desafios na área é superar a forte imunossupressão encontrada no microambientetumoral2. Particularmente, no caso do glioblastoma, uma das formas mais comuns e agressivas de câncer cerebral, desvendar caminhos-chave que orquestram tais cenários pró-tumorais e encontrar novos compostos que poderiam neutralizar a resposta depressiva do sistema imunológico pode abrir caminho para futuras terapias contra essa doença incurável.
O cérebro possui suas próprias células do sistema imunológico, e o tipo de célula mais relevante são a microglia. Comprovadamente, essas células têm um comportamento bastante complexo em diferentes doençascentrais3. No caso de tumores cerebrais primários (por exemplo, glioblastoma), essas células são deslocadas para um fenótipo anti-inflamatório que suporta as células tumorais para colonizar o parênquima cerebral3. Inúmeras publicações têm reforçado o papel importante dessas células durante a progressão tumoral. Uma das principais razões para isso é que a micróglia associada ao glioma e os macrófagos infiltrados (MAGs) respondem por um terço da massa tumoral total, sugerindo a influência inequívoca de seus estados de ativação durante a progressão do tumor cerebral 4,5.
Nesse sentido, os β-glucanos fúngicos têm sido descritos como moléculas potentes que desencadeiam respostas imunes efetivas, incluindo fagocitose e produção de fatores pró-inflamatórios, levando à eliminação de agentes perniciosos 6,7,8,9,10. Os β-glucanos fúngicos têm sido geralmente estudados usando extratos de diferentes partes do cogumelo. Entretanto, a atribuição de efeitos específicos requer sua purificação para evitar ambiguidades e poder compreender o mecanismo de ação de tais moléculas como agentes imunomoduladores8.
Neste trabalho, β-glucanas solúveis são purificadas do corpo frutífero de quatro diferentes cogumelos, regularmente empregados como cogumelos comestíveis (Pleurotus ostreatus e Pleurotus djamor) e medicinais (Ganoderma lucidum e Hericium erinaceus). Em particular, estes quatro cogumelos têm uma grande utilização na indústria alimentar e farmacêutica e foram produzidos no âmbito de uma economia circular ecológica numa empresa comercial (ver Tabela de Materiais).
A fim de estabelecer as bases para o uso futuro de β-glucanas fúngicas em terapias de câncer cerebral, estratégias de purificação bem definidas e estudos pré-clínicos que se aprofundam em sua interação putativa com células do sistema imunológico são essenciais para avaliar seu papel potencial como mediadores antitumorais. Este trabalho descreve as inúmeras etapas de isolamento e purificação necessárias para recuperar os β-glucanos solúveis contidos nos corpos frutíferos do cogumelo selecionado. Uma vez purificadas com sucesso, as células da microglia são ativadas para melhorar seu fenótipo inflamatório. Células de glioblastoma de camundongo (GL261) são revestidas com um meio diferente condicionado por microglia, previamente tratado com esses extratos, e então seu efeito sobre o comportamento das células tumorais é avaliado. Curiosamente, estudos piloto de nosso laboratório (dados não mostrados) descobriram como a microglia pró-inflamatória pode retardar a migração de células tumorais e as propriedades de invasão não apenas em células de glioblastoma, mas também em outras linhagens de células cancerosas. Este trabalho multidisciplinar pode fornecer uma ferramenta útil para pesquisadores de oncologia testarem compostos promissores capazes de aumentar a resposta imune em muitos tipos diferentes de tumores.

<table><tbody><tr><td>Corrediças de câmara de 8 poços</td><td>Thermo Fisher, EUA</td><td>171080</td><td></td></tr><tr><td>Forno de secagem a ar</td><td>J.P. Selecta S.A., Espanha</td><td>2000210</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Alcalase</td><td>Novozymes, Dinamarca</td><td>protease</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher, EUA</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Thermofisher, EUA</td><td>A32728</td><td></td></tr><tr><td>Moinho de lâminas</td><td>Retsch, Alemanha</td><td>&nbsp; SM100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>MERK, Alemanha</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de tubo de celulose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>MERK, Alemanha</td><td>Eppendorf, 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Pluggins de colocalização</td><td>ImageJ</td><td></td><td>(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis&nbsp;)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MERK, Alemanha</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dextrans</td><td>Pharmacosmos, Holbalk, Dinamarca</td><td>Dextran 410, 80, 50</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s modificado Eagle&agudo; s medium, Gluta MAXTM</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA</td><td>10564011</td><td></td></tr><tr><td>Extenda (&alpha;- Amilase/Glucoamilase)</td><td>Novozymes, Dinamarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro FT-IR</td><td>Bruker-Vertex, Suíça</td><td>VERTEX 70v</td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>de representação gráfica e análiseGraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema H2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters Corp, Milford, MA, EUA</td><td>Incubadora de HPLC</td><td></td>Waters 2695</tr> Espectômetro de massa <tr><td></td><td>Eppedorf</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Q Exactive GC, Thermo Scientific</td><td>725500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>MERK, Alemanha</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>Crison, Barcelona, Espanha</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA</td><td>1010-015</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Caspase-3 clivado em coelho (Asp175)</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab243998</td><td></td></tr><tr><td>Rato Ki-67 Monoclonal</td><td>Thermofisher, USA</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>B&uuml; chi Ib&eacute; rica S.L.U., Espanha</td><td>El Rotavapor R-100</td><td></td></tr><tr><td>Coluna linear de filtração em gel ultra-hidrogel (300 mm x 7,8 mm)</td><td>Waters Corp, Milford, MA, EUA</td><td>WAT011545</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Visível</td><td>Amersham Bioscience, Reino Unido</td><td>Ultrospec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories, C.A, EUA</td><td>H-5000-60</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>J.P. Selecta S.A., Espanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microscópio confocal Zeiss LSM 7 DUO.</td><td>Zeiss, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glucano Kit de Ensaio</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlanda</td><td>K-BGLU</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glucanos</td><td>Setas y Hongos del Sur, S.L.</td><td></td><td>Forneceu as quatro variantes de cogumelos</td></tr></tbody></table>

isolamento e purificação de β-glucanas fúngicas como estratégia de imunoterapia para glioblastoma

Isolation and Purification of Fungal &#946;-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma

Um dos maiores desafios no desenvolvimento de terapias eficazes contra o glioblastoma é superar a forte supressão imunológica dentro do microambiente tumoral. A imunoterapia tem emergido como uma estratégia eficaz para transformar a resposta do sistema imune contra as células tumorais. Macrófagos e micróglias associados à glioma (MAGs) são os principais impulsionadores desses cenários anti-inflamatórios. Portanto, aumentar a resposta anticancerosa em MAGs pode representar uma terapia coadjuvante potencial para tratar pacientes com glioblastoma. Nessa linha, as moléculas fúngicas de β-glucano têm sido conhecidas há muito tempo como potentes moduladores imunológicos. Sua capacidade de estimular a atividade imune inata e melhorar a resposta ao tratamento tem sido descrita. Essas características moduladoras são parcialmente atribuídas à sua capacidade de se ligar a receptores de reconhecimento de padrões, que, curiosamente, são muito expressos em GAMs. Assim, este trabalho está focado no isolamento, purificação e subsequente uso de β-glucanas fúngicas para aumentar a resposta tumoricida da microglia contra células de glioblastoma. As linhagens celulares de glioblastoma de camundongo (GL261) e microglia (BV-2) são usadas para testar as propriedades imunomoduladoras de quatro diferentes β-glucanas fúngicas extraídas de cogumelos fortemente utilizados na indústria biofarmacêutica atual: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum. Para testar esses compostos, ensaios de co-estimulação foram realizados para medir o efeito de um meio pré-ativado condicionado por microglia sobre a proliferação e ativação da apoptose em células de glioblastoma.

Purificação bem sucedida de β-glucanas A massa de MP, SMPs e SβGs obtida dos corpos frutíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus após o processo de extração e purificação está resumida na Tabela 1. A composição básica (carboidratos totais, β-glucanos e proteínas) de MP, SMPs e SβGs obtidos dos fungos está representada na Tabela 2. Esses resultados mostram como o protocolo permitiu a recuperação de uma grande quan...

O presente protocolo descreve as etapas de purificação e estudos subsequentes de quatro diferentes β-glucanos fúngicos como potenciais moléculas imunomoduladoras que aumentam as propriedades antitumorais da micróglia contra células de glioblastoma.

Isolamento e purificação de β-glucanas fúngicas como estratégia de imunoterapia para glioblastoma

One of the biggest challenges in developing effective therapies against glioblastoma is overcoming the strong immune suppression within the tumor ...

Os beta-glucanos fúngicos são importantes moduladores do sistema imunológico. Melhorar os protocolos de pureza e isolamento é essencial para afirmar seu papel potencial como coadjuvantes para a terapia do câncer. Um alto grau de quatro diferentes beta-glucanas foi obtido usando vários dispositivos comumente encontrados em laboratórios de biologia molecular e proteômica.Este protocolo concentra-se em testar os efeitos dos beta-glucanos na microglia, a célula imunitária residente mais abundante do cérebro. A modulação do fenótipo da micróglia no glioblastoma pode produzir informações importantes sobre o assunto. Comece a extração de polissacarídeos solúveis de cogumelos ou SMPs enxaguando corpos frutíferos frescos de Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum com água destilada cinco vezes.Em seguida, seque completamente os corpos frutíferos lavados a 50 graus Celsius em um forno de secagem convencional ao ar por aproximadamente 24 horas antes de moê-los em um moinho de lâminas obtendo cerca de 200 gramas de pó de cada cogumelo. Em seguida, suspenda 100 gramas de todos os quatro pós de cogumelos ou MP em 1.000 mililitros de água destilada e autoclav

isolation-purification-fungal-glucan-as-an-immunotherapy-strategy-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.

Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro utilizando β-glucanos para ativar células microgliais para a produção de radicais superóxido, uma espécie reativa de oxigênio. Nas células cancerígenas cerebrais, os oxidantes reativos gerados suprimem ativamente a proliferação de células tumorais e induzem a morte celular.

Um ensaio para analisar o teste β-glucano como estratégia de imunoterapia contra células cancerígenas cerebrais

O vídeo demonstra o isolamento de células mononucleares do sangue periférico que se infiltram em tumores a partir de um cérebro de camundongo usando dissociação mecânica e digestão enzimática. Isso é seguido pela centrifugação do gradiente de densidade para coletar as células imunes para análise posterior.

Isolando células imunes infiltrantes de tumor de um cérebro murino

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Os efeitos linfodepletivos e imunomoduladores do padrão de tratamento da quimioterapia e radiação podem ser aproveitados para aumentar a eficácia antitumoral da imunoterapia com células T. Descrevemos um método para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas do EGFRvIII e administrá-las no contexto do tratamento padrão de glioblastoma.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Compreender o comportamento maligno do câncer requer a criação de modelos precisos de como as células tumorais interagem com componentes do microambiente tumoral, como macrófagos. Aqui descrevemos dois métodos para estudar a interação das células de glioblastoma com macrófagos associados a tumores e micróglia, onde o efeito na invasão do glioblastoma é avaliado.

Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

Tumor-buscando terapêuticas tronco células mesenquimais (MSCs) mostram a promessa como um tratamento para glioblastoma invasiva. Transplante de ideal envolve entrega de MSCs na cavidade de ressecção do tumor em andaimes. Aqui, pré-clínicos técnicas para estudar o tratamento de MSC do glioblastoma são fornecidas incluindo: ressecção de tumor guiada por imagem; implantação do MSC-semeado andaimes; e terapia pós-operatória de rastreamento.

Ressecção guiada por imagem de Glioblastoma e intracraniana implantação de andaimes terapêuticos de células-tronco-semeado

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

Aprenda a purificar β-glucanas fúngicas de Pleurotus ostreatus, Ganoderma lucidum e outras espécies para imunoterapia contra glioblastoma. Este método demonstra ativação de microglia e potencial antitumoral.

Isolamento e purificação de β-glucanas fúngicas como estratégia de imunoterapia para glioblastoma

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