Name: Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a avaliar patologias do epitélio pigmentado da retina em modelos murinos usando microscopia de luz, eletrônica e confocal. Este protocolo padroniza a fenotipagem quantitativa para pesquisa em degeneração macular relacionada à idade.

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Os autores gostariam de agradecer a Satoshi Kinoshita e ao laboratório Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) da Universidade de Wisconsin (UW) pela preparação de nossos tecidos para microscopia de luz. Este núcleo é apoiado pelo Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da UW, pelo Centro de Câncer Carbone da Universidade de Wisconsin (P30 CA014520) e pelo Escritório do Diretor do NIH (S10OD023526). A microscopia confocal foi realizada no UW Biochemistry Optical Core, que foi estabelecido com o apoio do UW Department of Biochemistry Endowment. Este trabalho também foi apoiado por subsídios do National Eye Institute (R01EY022086 para A. Ikeda; R01EY031748 para C. Bowes Rickman; P30EY016665 ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da UW; P30EY005722 para o Duke Eye Center; NIH T32EY027721 para M. Landowski; F32EY032766 para M. Landowski), Timothy William Trout Chairmanship (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); e uma bolsa irrestrita da Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

<ol><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).</li>
<li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+age-related+macular+degeneration+%28AMD%29%3A+relationships+between+the+photoreceptor%2Fretinal+pigment+epithelium%2FBruch%27s+membrane%2Fchoriocapillaris+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progess+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).</li>
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<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperreflective+foci%2C+optical+coherence+tomography+progression+indicators+in+age-related+macular+degeneration%2C+include+transdifferentiated+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34(2021).</li>
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<li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+project+MACULA+retinal+pigment+epithelium+grading+system+for+histology+and+optical+coherence+tomography+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).</li>
<li>Ding, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-amyloid+therapy+protects+against+retinal+pigmented+epithelium+damage+and+vision+loss+in+a+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histologic+findings+in+age-related+macular+degeneration+with+RPE+flatmount+images%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images.</a> Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).</li>
<li>vonder Emde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+cell+shape+descriptors+for+the+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+A+comparison+to+unaffected+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes.</a> Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).</li>
<li>Gambril, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+retinal+pigment+epithelium+dysmorphia+and+loss+of+histologic+autofluorescence+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).</li>
<li>Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+atrophy%3A+a+histopathological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Geographic atrophy: a histopathological assessment.</a> JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).</li>
<li>Zanzottera, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+retinal+pigment+epithelium+phenotypes+in+the+transition+to+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Retina. 36, 12-25 (2016).</li>
<li>Sura, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+contributions+of+basal+laminar+deposit+and+Bruch%27s+membrane+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19(2020).</li>
<li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160(2018).</li>
<li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+morphology+of+human+macular+and+peripheral+Bruch%27s+membrane+in+older+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes.</a> Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).</li>
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<li>Ortolan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+map+of+human+retinal+pigment+epithelium+helps+discover+subpopulations+with+differential+disease+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119(2022).</li>
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<li>Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+fundus+and+retinal+studies+with+SD-OCT%3A+a+comparison+of+five+mouse+inbred+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains.</a> Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).</li>
<li>Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+correlation+of+mouse+photoreceptor-RPE+thickness+between+SD-OCT+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).</li>
<li>Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structural+assessments+of+ocular+disease+in+rodent+models+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61588(2020).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li>
</ol>

Os autores deste protocolo não têm divulgações e conflitos de interesse.

Neste artigo, apresentamos um protocolo de fenotipagem para avaliação das patologias estruturais do EPR em modelos murinos. Descrevemos as etapas necessárias para o processamento dos olhos para várias técnicas de imagem, incluindo microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal, bem como a quantificação de patologias típicas observadas por esses métodos de imagem. Comprovamos a eficácia de nosso protocolo de fenotipagem de EPR examinando camundongos Tmem135 TG e WT de 24 meses de idade, uma vez qu...

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma doença cegante comum que afeta populações acima de 55 anos1. Muitos pesquisadores acreditam que a disfunção dentro do epitélio pigmentado da retina (PSE) é um evento patobiológico precoce e crucial na DMRI2. O EPR é uma monocamada de células polarizadas encarregada de manter a homeostase dos fotorreceptores vizinhos e dos vasos sanguíneos de coroide3. Existe uma variedade de modelos para investigar mecanismos associados à doença dentro do EPR, incluindo modelos de cultura de células4,5 e camundongos 6,7,8. Um relatório recente descreveu protocolos padronizados e critérios de controle de qualidade para modelos de cultura de células PSE4, mas nenhum relato tentou padronizar a fenotipagem do EPR em modelos de camundongos. De fato, muitas publicações sobre modelos de camundongos com DMRI carecem de uma descrição completa do EPR ou quantificação das patologias do EPR neles. O objetivo geral deste protocolo é apresentar métodos padrão de fenotipagem de EPR com avaliações quantitativas imparciais para cientistas usando modelos de camundongos com DMRI.
Publicações anteriores observaram a presença de várias patologias do EPR em camundongos através de três técnicas de imagem. Por exemplo, a microscopia de luz permite aos pesquisadores visualizar a morfologia macroscópica da retina murina (Figura 1A) e detectar patologias do EPR, como afinamento do EPR, vacuolização e migração. O afinamento do EPR em um modelo de mouse AMD é exemplificado por um desvio na altura do EPR em relação aos seus respectivos controles (Figura 1B). A vacuolização do EPR pode ser dividida em duas categorias distintas: microvacuolização (Figura 1C) e macrovacuolização (Figura 1D). A microvacuolização do EPR é resumida pela presença de vacúolos no EPR que não afetam sua altura total, enquanto a macrovacuolização é indicada pela presença de vacúolos que se projetam para os segmentos externos dos fotorreceptores. A migração do EPR é distinguida pelo agregado focal de pigmento acima da monocamada do EPR em um corte transversal da retina (Figura 1E). Deve-se ressaltar que as células migratórias do EPR em olhos de doadores de DMRI exibem imunorreatividade a marcadores de células imunes, como o cluster de diferenciação 68 (CD68)9, e poderiam representar células imunes engolindo restos de EPR ou EPR em transdiferenciação9. Outra técnica de imagem chamada microscopia eletrônica de transmissão pode permitir ao pesquisador visualizar a ultraestrutura do EPR e sua membrana basal (Figura 2A). Essa técnica pode identificar o depósito sub-PSE predominante em camundongos, conhecido como depósito laminar basal (BLamD) (Figura 2B)10. Por fim, a microscopia confocal pode revelar a estrutura das células do EPR por meio de imagens de suportes planos do EPR (Figura 3A). Esse método pode revelar a dismorfia do EPR, o desvio do EPR de sua forma clássica em favo de mel (Figura 3B). Também pode detectar multinucleação do EPR, a presença de três ou mais núcleos dentro de uma célula do EPR (Figura 3C). Para um resumo dos tipos de patologias do EPR presentes nos modelos atuais de camundongos com DMRI, remetemos os pesquisadores para essas revisões da literatura 6,7.
Os pesquisadores que estudam a DMRI devem estar cientes das vantagens e desvantagens do uso de camundongos para investigar patologias do EPR antes do protocolo de fenotipagem. Os camundongos são vantajosos por causa de sua vida útil relativamente curta e custo-efetividade, bem como sua manipulabilidade genética e farmacológica. Camundongos também exibem alterações degenerativas do EPR, incluindo migração do EPR, dismorfia e multinucleação, que são observadas em olhos de doadores de DMRI11,12,13,14,15,16,17; isso sugere que mecanismos semelhantes podem estar subjacentes ao desenvolvimento dessas patologias do EPR em camundongos e humanos. No entanto, existem diferenças fundamentais que limitam a traduzibilidade de estudos em camundongos para DMRI humana. Primeiro, os camundongos não têm mácula, uma região anatomicamente distinta da retina humana necessária para a acuidade visual que é preferencialmente afetada na DMRI. Em segundo lugar, algumas patologias do EPR em camundongos, como afinamento e vacuolização do EPR, não são tipicamente vistas em olhos de doadores de DMRI18. Terceiro, camundongos não desenvolvem drusa, uma característica da patologia da DMRI19. Drusen são depósitos contendo lipídios e proteínas com pouquíssimas proteínas da membrana basal que se formam entre a lâmina basal do EPR e a camada colágena interna da membrana de Bruch (BrM)19. Drusen diferem de BLamD, o depósito comum de sub-PSE em camundongos, tanto em sua composição quanto em sua localização anatômica. Os BLamDs são anormalidades enriquecidas com matriz extracelular dependentes da idade e do estresse que se formam entre a lâmina basal do EPR do BrM e os infoldings basais do EPR20. Curiosamente, os BLamDs têm composição e aparência proteica semelhantes em camundongos e humanos 6,10,21. Trabalhos recentes sugerem que os BLamDs podem atuar na patobiologia da DMRI, influenciando a progressão da DMRI para seus estágios mais avançados18,22; portanto, esses depósitos podem representar EPR doente na retina de camundongos. O conhecimento desses benefícios e limitações é fundamental para pesquisadores interessados em traduzir resultados de estudos em camundongos para a DMRI.
Neste protocolo, discutimos os métodos de preparação dos olhos para luz, elétrons de transmissão e microscopia confocal para visualização de patologias do EPR. Também descrevemos como quantificar patologias do EPR de forma imparcial para testes estatísticos. Como prova de conceito, utilizamos o protocolo de fenotipagem do EPR para investigar as patologias estruturais do EPR observadas em camundongos superexpressando a proteína transmembrana 135- (Tmem135) e camundongos selvagens envelhecidos (WT) C57BL/6J. Em resumo, objetivamos descrever a metodologia de fenotipagem para caracterizar a PSE em modelos de camundongos com DMRI, uma vez que atualmente não existem protocolos padronizados disponíveis. Pesquisadores interessados em examinar e quantificar patologias dos fotorreceptores ou coroides, que também são afetadas em modelos de camundongos com DMRI, podem não achar esse protocolo útil para seus estudos.

<table><tbody><tr><td>0,1 M tampão cacodilato pH7.2</td><td>PolyScientiifc R& D Company</td><td>S1619</td><td></td></tr><tr><td>100 Capacidade Slide Box</td><td></td><td></td><td>Dois são necessários para este protocolo (um para H & Lâminas coradas com E e uma para montagens planas de RPE.)</td></tr><tr><td>100% Etanol&nbsp;</td><td>MDS Warehouse</td><td>2292-CASE</td><td>Pode ser usado para fazer soluções de etanol diluído neste protocolo.</td></tr><tr><td>Torneira de 1 via, 2 travas Luer fêmeas</td><td>Qosina</td><td>11069</td><td></td></tr><tr><td>1x Solução tampão de fosfato (PBS)</td><td></td><td></td> <td>Pré-fabricada 1x PBS pode ser usada neste protocolo.</td></tr><tr><td>Microtubos de 2,0 mL</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-283-LR</td><td></td></tr><tr><td>24 Cavidade Incorporando Cápsula Substituto Molde</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>70165</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de PVC de 24 polegadas com extremidades Luer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1376778</td><td></td></tr><tr><td>400 Mesh Gilder Barra Fina Grades de Malha Quadrada</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>T400-</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td>MDS Warehouse</td><td>2293-CASE</td><td></td></tr><tr><td>Absorventes com Barreira à Prova d'Água contra Umidade (23 polegadas por 24 polegadas)</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr><tr><td>Ajustável 237 ml&nbsp; Frasco de Spray</td><td>VWR</td><td>23609-182</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 Burro Conjugado Anti-Coelho IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Folha de Alumínio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precision glide 19 Gauge Seringa Agulha</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Z192546 pinça de samambaia; Curvo; Serrilhados cruzados finos; 4" de comprimento, 1 mm de largura da ponta</td><td>Instrumento cirúrgico Roboz</td><td>RS-5211</td><td>Conhecido como pinça curva neste protocolo.</td></tr><tr><td>Escova de Cabelo de Camelo</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>65575-02</td><td></td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td><td></td><td></td>de Eutanásia de Dióxido</tr><tr><td>de Carbono Medidor de Fluxo de Dióxido de Carbono</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tanque</td><td></td><td></td><td></td>de Dióxido de Carbono</tr><tr><td>Grampos de Extensão de Pinos Castaloy</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-769-7Q</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Base em L de Ferro Fundido</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11-474-207</td><td></td></tr><tr><td>Programa</td><td></td><td></td> Cell Prolifer <td>Disponível para download: https://cellprofiler.org/releases</td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Colorfrost Microscópio Slides Lavanda</td><td>VWR</td><td>10118-956</td><td></td></tr><tr><td>Computador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr>Água <td>destilada H20</td><td></td><td></td><td>do Sistema de Purificação Milli-Q foi utilizada neste protocolo.</td></tr><tr><td>Pinças de ponta fina Dumont; Padrão #55</td><td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-4984</td><td>Conhecido como pinça de ponta fina neste protocolo, e 3 são necessários para este protocolo (dois para dissecações e um para processamento de microscópio eletrônico).</td></tr><tr><td>Suporte de Grade para Microscopia</td><td>Eletrônica Electron Microscopy Sciences</td><td>71147-01</td><td></td></tr><tr><td>EPON 815 Resina</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>14910</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Mark-It Marcação de Tecido Corante Amarelo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22050460</td><td>Por favor, siga o protocolo do fabricante ao usar este corante para marcação de tecido.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mídia de montagem Epredia</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-110-610</td><td>Uso para montagem de H & E slides.&nbsp;</td></tr><tr><td>Série de Iluminadores Fiber-Lite Mi-150, Fonte de Luz Halógena de 150 w</td> Fonte <td>de Luz Mi-150</td> da <td>Dolan-Jenner Industries</td><td>para microscópio de dissecação.</td></tr><tr>Programa <td></td><td></td><td>Fiji ImageJ</td><td>Disponível para download: https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Conector de Gancho Flexaframe Castaloy</td><td>Thermo Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>14-666-18Q</td><td></td></tr><tr><td>Capa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de exaustão Glutaraldeído 2,5% em tampão de fosfato, pH 7,4, 32%</td> <td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>16537-05</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 Microscópio Eletrônico de Transmissão (JEOL) com um ORIUS (1000) CCD</td> Câmera <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratório Benchtop Shaker</td><td></td><td></td><td>Dois são necessários para esses experimentos. Um deve estar em temperatura ambiente, enquanto o outro deve estar em uma câmara fria de 4 graus Celsius.</td></tr><tr><td>Etiquetas de Etiquetas Cryo a Laser</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>77564-05</td><td></td></tr><tr><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td> de<td>Citrato de Chumbo</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC7Ultramicrótomo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Reichert Ultracut S Microtome</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LifterSlips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22X22I24788001LS</td><td>Use essas lamínulas para as montagens planas do RPE, pois elas têm bordas elevadas e acomodam a espessura do RPE.</td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Micro Dissecadora McPherson-Vannas</td><td></td> Hematoxilina VWR 100504-406 <td></td> da Mayer Instrumento Cirúrgico Roboz RS-5600 <td>Conhecida como tesoura micro-dissecante em protocolo.&nbsp;</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Mouses A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Qualquer modelo de mouse AMD e seus respectivos controles podem funcionar para este protocolo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de micro dissecação; Versão padrão; Curvo; Pontas afiadas; 24 mm de comprimento da lâmina; Instrumento</td><td>Cirúrgico Roboz</td> de Comprimento Total <td>4.5" RS-5913</td><td>Conhecido como tesoura curva neste protocolo.</td></tr><tr><td>Racks</td><td></td><td></td><td></td>de microtubos</tr> <tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1RS Microscópio</td><td></td><td></td><td></td>Confocal</tr><tr><td>Normal Soro de Burro</td><td>SouthernBiotech</td><td>0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Número 11 Lâminas de bisturi descartáveis estéreis</td><td>VWR</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, 32%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td> de Petri Pencil <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR&nbsp;</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ZO-1 policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>402200</td><td></td></tr> Ciências <tr>de <td>Microscopia Eletrônica</td><td>de Óxido de Propileno</td><td>20412</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>VWR</td><td>10040-386</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja rasa para perfusões de camundongos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Eosin Y Alcoólico</td><td>VWR</td><td>89370-828</td><td></td></tr><tr><td>Grampos de Marcador Permanente Sharpie Ultra Fine Tip Preto</td><td></td><td>642736</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para Coloração</td><td>Grainger</td><td>49WF31</td><td></td></tr><tr><td>Deslizamentos de Vidro de Cobertura Quadrada</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Prato de coloração com tampa</td><td>Grainger</td><td>49WF30</td><td>Precisa 15 para H & Procedimento de coloração E.</td></tr><tr><td>Seringa Descartável Luer-Slip Target Toda em Plástico 50 mL&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>S7510-50</td><td>Use apenas o corpo da seringa.</td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Fisher</td><td>1464917</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Uranila</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Forno a Vácuo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Montagem Média</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Use para montagem de montagens planas RPE.&nbsp;</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>22050283</tr><tr><td>Zeiss Axio Imager 2 Microscópio</td><td></td><td></td> de Luz <td>Este microscópio tem a capacidade de gerar imagens 20x costuradas. Se um microscópio de luz não tiver essa capacidade, tire imagens de toda a retina que estão ligeiramente sobrepostas umas às outras. Use o Adobe Photoshop para unir essas imagens. Consulte os manuais do programa Adobe Photoshop para costura de imagens.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio de Dissecção Zeiss Stemi 2000</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>65575-02</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para avaliação e quantificação de patologias do epitélio pigmentado da retina em modelos murinos de degeneração macular relacionada à idade

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma doença debilitante da retina em populações envelhecidas. Acredita-se que a disfunção do epitélio pigmentado da retina (EPR) seja um evento patobiológico chave na DMRI. Para entender os mecanismos que levam à disfunção do EPR, modelos de camundongos podem ser utilizados por pesquisadores. Foi estabelecido por estudos anteriores que camundongos podem desenvolver patologias do EPR, algumas das quais são observadas nos olhos de indivíduos diagnosticados com DMRI. Descrevemos um protocolo de fenotipagem para avaliar patologias do EPR em camundongos. Este protocolo inclui a preparação e avaliação de cortes transversais da retina usando microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão, bem como de montagens planas de EPR por microscopia confocal. Detalhamos os tipos comuns de patologias murinas do EPR observadas por essas técnicas e formas de quantificá-las através de métodos imparciais para testes estatísticos. Como prova de conceito, usamos este protocolo de fenotipagem do EPR para quantificar as patologias do EPR observadas em camundongos superexpressando a proteína transmembrana 135 (Tmem135) e camundongos selvagens C57BL/6J envelhecidos. O principal objetivo deste protocolo é apresentar métodos padrão de fenotipagem da PSE com avaliações quantitativas imparciais para cientistas usando modelos de DMRI em camundongos.

A conclusão do protocolo de fenotipagem da PSE descrito neste artigo fornece uma análise quantitativa das anormalidades estruturais da EPR comumente observadas em modelos murinos de DMRI. Para confirmar a eficácia desse protocolo, nós o usamos em camundongos que são conhecidos por apresentar patologias do EPR, incluindo camundongos transgênicos que superexpressam WT Tmem135 impulsionado pelo promotor de beta-actina de frango (Tmem135 TG)30 e camundongos C57BL/6J envelhecidos31,32.</s...

Modelos murinos podem ser ferramentas úteis para investigar a biologia do epitélio pigmentado da retina (EPR). Foi estabelecido que camundongos podem desenvolver uma série de patologias do EPR. Aqui, descrevemos um protocolo de fenotipagem para elucidar e quantificar patologias do EPR em camundongos usando microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal.

Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Este protocolo é o primeiro a descrever como processar e avaliar o tamanho de camundongos para patologias do FRy usando microscopia eletrônica de transmissão de luz e microscopia confocal. A principal vantagem deste protocolo é a inclusão de avaliações quantitativas das patologias do FRy, utilizando estas três técnicas de imagem para comparações estatísticas. As técnicas descritas neste protocolo também podem ajudar a expandir nosso conhecimento de vias moleculares importantes para a saúde da EPR.Indivíduos que não dissecaram previamente o tamanho do camundongo podem ter dificuldades com esse protocolo. Sugerimos que esses indivíduos pratiquem com alguns camundongos para dominar as técnicas descritas neste protocolo. Para começar, prepare um sistema de perfusão de alimentação por gravidade em uma almofada absorvente para perfusão cardíaca em uma capela de fumaça.Despeje 40 mililitros de tampão fixador recém-preparado no barril da seringa do sistema de perfusão. Gire a válvula paralelamente à linha de tubulação para permitir que o buffer flua através da linha de tubulação. Lave a linha até que todas as bolhas de ar sejam removidas da linha.Em seguida, vire a válvula perpendicularmente à linha de tubulação para impedir que o buffer flua para a linha de tubulação. Para realizar a perfusão cardíaca, transferir o camundongo eutanasiado para uma bandeja rasa próxima ao sistema de perfusão. Com o abdômen voltado para cima.Borrife o abdômen com etanol a 70% e, em seguida, crie um corte inferior de cinco centímetros usando tesoura curva e pinça através da pele e da parede abdominal no lado esquerdo do mouse abaixo da caixa torácica. Proceder a um corte medial de três centímetros através da pele e da parede abdominal no topo do corte inferior. Faça outro corte inferior de cinco centímetros no final do corte medial através da pele e da parede abdominal no lado direito mais distante do rato, abaixo da caixa torácica.Realizar mais incisão medial de três centímetros para retirada do retalho cutâneo abdominal com pinça curva. Em seguida, corte o diafragma e o esterno para expor o coração. Insira a agulha do calibre no ventrículo esquerdo do coração e gire a válvula.Corte o átrio direito com tesoura curva para permitir que o sangue e o fixador saiam do coração. Deixe 10 mililitros de tampão fixador para perfundir o mouse por um a dois minutos, ou até que o fígado fique pálido e nenhum sangue flua para fora do átrio direito. Uma vez concluída a perfusão, gire a válvula perpendicularmente à linha de tubulação para interromper o fluxo tampão.Para nuclear os olhos, retire o rato da bandeja rasa e coloque-o sobre a almofada absorvente em um exaustor. Em seguida, oriente a cabeça do mouse com o olho esquerdo voltado para o experimentador e o olho direito fora de vista. Anote o lado superior do olho com um corante de marcação de tecido.Empurre suavemente para baixo ao redor da cavidade ocular com o polegar e o indicador para a protrusão do olho da cavidade ocular. Em seguida, usando uma tesoura curva, segure o olho com a lâmina em um ângulo de 30 graus da cavidade ocular e corte ao redor do olho. Retire o globo ocular da cabeça com pinça curva e coloque-o em uma almofada absorvente.Corte a córnea com uma lâmina de bisturi número 11 e coloque o olho com pinça curva em um microtubo de dois mililitros contendo dois mililitros de tampão fixador. Depois de nuclear ambos os olhos, incube-os em um tampão fixador durante a noite em um agitador em uma sala de quatro graus a uma velocidade de 75 rpm. No dia seguinte, substituir o tampão fixador por dois mililitros de PBS e incubar por 10 minutos em um agitador à temperatura ambiente e 75 rpm.Em seguida, para gerar segmentos posteriores, coloque o olho em uma placa de Petri preenchida com PBS sob um microscópio dissecante. Levante suavemente qualquer gordura e músculo para longe do globo ocular com pinças de ponta fina. Aparar cuidadosamente a gordura e o músculo com uma tesoura microdissecante em direção paralela ao globo ocular até que o globo ocular tenha uma cor preta-azulada uniforme Coloque pinças de ponta fina no local da punção corneana e corte ao redor do perímetro da córnea começando no local da punção com uma tesoura microdissecante para remover a córnea e a íris do globo ocular.Em seguida, usando pinças de ponta fina, remova suavemente a lente do globo ocular para obter o segmento posterior. Coloque o segmento posterior em um tubo contendo dois mililitros PBS, e armazenar a quatro graus Celsius em uma geladeira até o uso. Transfira o olho para uma placa de Petri contendo PBS e remova a córnea e a íris conforme demonstrado.Puxe a lente com pinça de ponta fina. Em seguida, com duas pinças de ponta fina, separe suavemente a retina neural do segmento posterior. Corte cuidadosamente a retina neural na cabeça do nervo óptico para remoção da taça ocular posterior.Coloque o copo para os olhos em um microtubo de dois mililitros contendo cinco microlitros de PBS. Para fixar os óculos posteriores, adicione 500 microlitros de metanol ao tecido e incube em um agitador a 75 rpm, por cinco minutos. Repetir a fixação com metanol três vezes com incubação final por duas horas.Após a fixação, lavar o tecido três vezes com PBS, antes de proceder à coloração por imunofluorescência e visualização por microscopia confocal. Camundongos TMEM 135 TG com quatro meses de idade mostraram uma redução significativa no epitélio pigmentado da retina ou espessura do EPR a 600 e 900 micrômetros de distância do nervo óptico, em relação aos camundongos selvagens do tipo pareados por idade. Incidentes de patologias do EPR incluindo microvascuolização, macrovacuolização e migração de camundongos WT e TMEM 135 TG com 325 dias de idade foram calculados.A frequência média de microvacuolização por EPR foi menor no tipo selvagem em comparação com os camundongos TMEM 135 TG. Não foram detectadas macrovacuolização e migração de PSE no tipo selvagem em comparação com os valores médios observados em camundongos TMEM 135 TG. Na microscopia eletrônica de transmissão, depósitos laminares basais foram observados em retinas de 24 meses de idade que estavam ausentes em retinas de dois meses de idade.A análise das frequências cumulativas das alturas dos depósitos laminares basais indicou um desvio para a direita da linha para os 24 meses de idade, em comparação com os dois meses de idade, demonstrando um aumento nos depósitos em camundongos de 24 meses de idade. Essa observação foi apoiada por maiores alturas médias nas retinas aos 24 meses de idade. PSE em camundongos TMEM 135 TG com quatro meses de idade foi dismórfico.O EPR nas retinas TG TMEM 135 é maior e menos denso do que as retinas selvagens pareadas por idade. Além disso, mais células de EPR multinucleadas nas retinas TG foram observadas, em comparação com os controles. Seguindo esse protocolo, os pesquisadores puderam avaliar vias específicas usando técnicas de biologia molecular em camundongos, o que poderia contribuir para a compreensão de como essas patologias do FRy se desenvolvem em camundongos.Esse protocolo ajudará a padronizar a fenotipagem do FR em camundongos, o que traduzirá os achados de estudos em camundongos para outros modelos de DMRI e ajudará na compreensão da patobiologia da DMRI.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Indocianina Verde Angiografia (ou AIV), realizado pela injeção veia da cauda fornece imagens de alta qualidade do curso tempo AIV para caracterizar anormalidades no rato coróide.

Detectar alterações no coróide Vasculature em um modelo do rato de Degeneração Macular relacionada com a Idade de-curso Tempo Indocianina Verde Angiografia

Aqui, apresentamos um método para registrar respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento da retina (RPE) em camundongos usando uma técnica conhecida como DC-ERGs descrita pela primeira vez por Marmorstein, Peachey, e colegas no início dos anos 2000.

Eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG) para gravar as respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento de retina do rato

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células RPE do mouse, que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas Transwell. O procedimento leva aproximadamente 3 horas.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação e a coloração da imunofluorescência de montagem e análise plana de retina de camundongos. O uso de fluoresceína fundus angiography (FFA) para filhotes de camundongos e processamento de imagem também são descritos em detalhes.

Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio

A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. Histologia, ensaio de quebra da barreira hemorrânica e angiografia de fluorescência são técnicas valiosas para entender a fisiopatologia da retina, o que poderia aumentar ainda mais o rastreamento eficiente de drogas contra a retinopatia diabética.

Avaliação fisiofisiológica da retina em um modelo de rato

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

Descrevemos um método para separar eficientemente o epitélio pigmentar da retina (EPR) da retina em olhos humanos e gerar montagens planas inteiras de EPR/coroide para análises histológicas e morfométricas da EPR.

Geração eficiente e consistente de epitélio/coroide de pigmento da retina a partir de olhos humanos para análise histológica

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Os eventos de splicing em tandem ocorrem em locais separados por menos de 12 nucleotídeos. A quantificação das proporções de tais variantes de splice é viável usando uma abordagem de PCR quantitativa absoluta. Este manuscrito descreve como as variantes de splice do gene STAT3, nas quais dois eventos de splicing resultam na inclusão/exclusão de Serine-701 e α/β C-termin, podem ser quantificadas.

Mesclando Absoluto e dados relativos PCR quantitativo para quantificar STAT3 Splice Variant Transcrições

Aprenda a avaliar patologias do epitélio pigmentado da retina em modelos murinos usando microscopia de luz, eletrônica e confocal. Este protocolo padroniza a fenotipagem quantitativa para pesquisa em degeneração macular relacionada à idade.

Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade (Vídeo) | JoVE Journal

Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

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