Name: Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprenda a realizar imagem subcelular de cálcio em neurônios de Caenorhabditis elegans com alta resolução in vivo. Este método permite estudar dinâmicas de cálcio em compartimentos neuronais específicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 concedido a F. Hoerndli). Agradecemos também ao Dr. Attila Stetak pelo plasmídeo pAS1.

1. Criação de cepas transgênicas
<ol><li>Usando um método de clonagem de escolha8,9, clone vetores de expressão para conter o promotor Pflp-18 ou Prig-3 (para sinal AVA-específico no cordão nervoso ventral), seguido pelo indicador de escolha Ca2+ e, em seguida, um UTR 3' (veja a discussão para obter mais informações)10. Uma lista de plasmídeos e suas fontes pode ser encontrada na Tabela Suplementar 1.</li>
	<li>Seguir o protocolo estabelecido para a criação de cepas transgênicas através da microinjeção de uma mistura de DNA (<100 ng/μL; ver Tabela Suplementar 1 para as concentrações de cada plasmídeo) contendo o transgene indicador Ca2+ (~20 ng/μL) e o DNA de resgate lin-15+ (marcador de seleção) na gônada de um adulto de 1 dia de idade C. elegans10 (genótipo: LIN-15 (N765TS); fenótipo: multivulva)10,11. NOTA. Manter os pais lin-15(n765ts) a 15 °C para suprimir a mutação sensível à temperatura.</li>
	<li>Manter os pais injetados a 20 °C até que a progênie F1 atinja a idade adulta para permitir a seleção transgênica usando a ausência do fenótipo multivulva.</li>
	<li>Clonalmente passam13 progênies F1 adultas que não possuem o fenótipo multivulva, pois indica a expressão do arranjo extracromossômico contendo o indicador Ca2+ 11.</li>
	<li>Avaliar a expressão do indicador Ca2+ na progênie F2 ou F3 que não têm o fenótipo multivulva montando e imageando adultos com 1 dia de idade, conforme descrito posteriormente na seção 3. NOTA. Uma expressão relativamente alta do indicador é necessária para a rápida aquisição de imagens, como descrito aqui (veja a discussão para mais detalhes).</li>
	<li>Realizar experimentos em gerações subsequentes das cepas transgênicas com uma expressão ótima do indicador Ca 2+ (ver a discussão para mais detalhes), mantendo as cepas em condições padrão (20 °C em placas NGM)12.</li>
</ol>2. Configuração óptica
<ol><li>Use um microscópio capaz de imagens de lapso de tempo de longo prazo. NOTA. Os dados representativos foram adquiridos utilizando-se microscópio confocal de disco giratório invertido equipado com lasers de excitação de 488 nm e 561 nm.</li>
	<li>Use uma objetiva de baixa ampliação (ou seja, 10x/0,40) para a localização bruta do worm.</li>
	<li>Para alcançar a resolução subcelular, alterne e localize os neurônios usando uma objetiva de alta magnificação. NOTA. Uma objetiva de óleo de 100x/1,40 NA foi utilizada para obter os dados representativos neste estudo.</li>
	<li>Adquira as imagens usando uma câmera ultrassensível capaz de aquisição rápida de imagens (>50 fps).</li>
	<li>Use um filtro de emissão padrão para o indicador Ca2+ de escolha (ou seja, um filtro de emissão de 525 nm ± 50 nm para GCaMP6f e mitoGCaMP).</li>
	<li>Adicione um corretor Z-drift (ZDC) para a aquisição de fluxos de imagem com mais de 10 s, pois a dessecação da almofada de ágar durante a sessão de imagem faz com que o neurito saia do foco em alguns segundos. NOTA. Se uma configuração de microscopia não permitir ZDC, ou se longos períodos de imagem (>20 min) forem desejados, aplique uma borda de graxa de silício ou vaselina derretida ao redor da almofada de ágar para retardar a dessecação.</li>
</ol>3. Preparação de vermes para aquisição de imagens
<ol><li>Preparação das almofadas de ágar<ol><li>Completar 3 ml de ágar a 10% dissolvendo ágar de grau molecular em M912 num tubo de cultura de vidro de 13 mm x 100 mm e micro-ondas durante vários segundos (ver Tabela de Materiais). NOTA. O ágar fundido pode ser mantido em um bloco de calor por até 1 h ou pode ser feito fresco cada vez que as almofadas de ágar são necessárias.</li>
		<li>Coloque uma lâmina de microscópio entre duas lâminas adicionais, cada uma com duas camadas de fita adesiva de laboratório (ver Figura 1A-i).</li>
		<li>Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1.000 μL (sem filtro) e use-a para pipetar uma pequena gota de ágar na tampa central (Figura 1A-i).</li>
		<li>Achate o ágar pressionando outra lâmina para baixo em cima do ágar (Figura 1A-ii).</li>
		<li>Após o resfriamento, corte o ágar em um pequeno disco usando a abertura de um tubo de cultura de vidro de 13 mm x 100 mm (Figura 1A-iii) e, em seguida, remova o ágar circundante.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparando a solução de laminação de worms<ol><li>Dissolva o pó de muscimol em M9 para criar um estoque de 30 mM. Separar em alíquotas de 50 μL e conservar a 4 °C.</li>
		<li>Descongele uma nova alíquota de 30 mM de muscimol a cada 3-5 dias (e armazene a 20 °C enquanto estiver em uso).</li>
		<li>Diluir um estoque de muscimol de 30 mM na proporção de 1:1 com esferas de poliestireno para fazer a solução de laminação.</li>
	</ol></li>
	<li>Posicionando um worm para geração de imagens<ol><li>Colocar 1,6 μL da solução de laminação no centro da almofada de ágar. NOTA: A quantidade de líquido deve ser ajustada para imagens de animais mais jovens (menos) ou mais velhos (mais).</li>
		<li>Usando o worm pick preferido (isto é, um coletor de fio de vidro ou platina)13, transfira um verme da idade desejada sem o fenótipomultivulva 11 para a solução de rolamento na almofada de ágar (Figura 1A-iv). NOTA. Os dados representativos são de hermafroditas com 1 dia de idade (cepa GCaMP6f = FJH185; cepa mitoGCaMP; FJH597; ver Tabela Suplementar 1), que pode ser identificada pela presença de apenas uma fileira de ovos. Veja a discussão para obter mais detalhes sobre como trabalhar com vermes de diferentes idades.</li>
		<li>Aguarde ~5 min para que o muscimol reduza o movimento do verme e, em seguida, solte uma lamínula de 22 mm x 22 mm em cima da almofada de ágar, restringindo fisicamente o movimento do verme.</li>
		<li>Para obter imagens de neuritos no cordão nervoso ventral, enrole o verme na orientação mostrada na Figura 1B,C deslizando levemente a lamínula. NOTA. Para visualizar o cordão nervoso ventral, posicione o verme com a cabeça para cima e role o verme até que o intestino fique do lado direito da porção proximal e o esquerdo para a porção distal do verme (da perspectiva do observador). Inverter essa orientação (Figura 1C) para obtenção de imagens de neuritos no cordão nervoso dorsal.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagem do verme em um microscópio<ol><li>Coloque uma gota de óleo de imersão na tampa antes de montá-la no palco do microscópio.</li>
		<li>Encontre o worm usando uma objetiva de baixa ampliação (10x) no campo brilhante.</li>
		<li>Mude para a objetiva de 100x e ajuste o foco.</li>
		<li>Localize o neurito AVA usando a iluminação do GCaMP ou mitoGCaMP com o laser de imagem de 488 nm. NOTA: Use pequenos ajustes para evitar esmagar o verme ou puxar a tampa.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Aquisição de fluxos de imagens de alta resolução
<ol><li>In vivo Imagem do GCaMP<ol><li>Defina o tempo de exposição para 20 ms.</li>
		<li>Ajuste as configurações de aquisição e laser de imagem até que a fluorescência basal do GCaMP esteja na faixa intermediária da faixa dinâmica da câmera14. Consulte a discussão para obter sugestões sobre como otimizar os parâmetros de imagem usando outras configurações de microscopia. NOTA. Para o arranjo óptico utilizado neste estudo, ajuste o laser de imagem de 488 nm para as seguintes configurações de saída: potência do laser = 50% e atenuação = 1. Modifique as configurações de aquisição adicionais da seguinte forma: ganho de EM = 200 e ganho pré-amplificador = 1.</li>
		<li>Depois que o neurito AVA for localizado usando a fluorescência GCaMP em aumento de 100x, ajuste o ZDC (consulte Tabela de Materiais) para uma faixa de ±30 μm e inicie o foco automático contínuo. Corrija manualmente o plano focal conforme necessário antes da geração de imagens.</li>
		<li>Adquira um fluxo de imagens com ampliação de 100x. Durações de até 10 min podem ser alcançadas com o setup utilizado neste estudo.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem in vivo do mitoGCaMP<ol><li>Siga as etapas 4.1.1-4.1.2 conforme necessário para adquirir a fluorescência mitoGCaMP basal na faixa intermediária para a faixa dinâmica da câmera14. NOTA. Para o set-up óptico utilizado neste estudo, ajuste o laser de imagem de 488 nm para as seguintes configurações de saída: potência do laser = 20% e atenuação = 10. Modifique as configurações de aquisição para o seguinte: ganho de EM = 100 e ganho pré-amplificador = 2.</li>
		<li>Depois que as mitocôndrias no neurito AVA forem localizadas usando a fluorescência mitoGCaMP, defina o ZDC como descrito acima na etapa 3.3.</li>
		<li>Adquira um fluxo de imagens com ampliação de 100x.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise do fluxo de imagens
<ol><li>Abra o fluxo de imagens em um software de imagem apropriado para analisar os valores de pixel em uma série de imagens (consulte Tabela de materiais).</li>
	<li>Usando a ferramenta Polygon Selection , defina a região subcelular de interesse (ROI) contendo GCaMP ou mitoGCaMP.</li>
	<li>Clique em Analisar > Ferramentas > ROI Manager. No Gerenciador de ROI, clique em Adicionar e, em seguida, em Mais > Multimedida. Na janela Multimedida, clique em OK para coletar automaticamente as intensidades média, mínima e máxima de pixels do ROI definido acima para cada quadro do fluxo de imagem para análise adicional. NOTA. Recomenda-se que a intensidade média dos pixels (F méd) seja normalizada para a intensidade mínima (F min) para cada ROI usando a razão Fméd/Fmin para explicar as diferenças de fluorescência devido ao posicionamento no plano z. Descarte os fluxos de imagem com movimento de verme durante a imagem, pois isso também afetaria as medições de fluorescência.</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).</li>
<li>Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%3A+Function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li>
<li>Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+homeostasis+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Metal+Ions+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium homeostasis and signaling.</a> Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inositol+trisphosphate%2Fcalcium+signaling+pathway+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease.</a> Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).</li>
<li>Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-handling+defects+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium-handling defects and neurodegenerative disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212(2020).</li>
<li>Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+molecular+mechanisms+underlying+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.</a> Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).</li>
<li>Jadiya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+calcium+efflux+contributes+to+disease+progression+in+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 10 (1), 3885(2019).</li>
<li>Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MosSCI+and+gateway+compatible+plasmid+toolkit+for+constitutive+and+inducible+expression+of+transgenes+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline.</a> PLoS One. 6 (5), 20082(2011).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-FusionTM+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+and+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Transformation and Microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%3A+Transferring+worms+grown+on+NGM+plates%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Ogama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+improving+image+acquisition+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemist%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy.</a> The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).</li>
<li>Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+contribute+to+neuronal+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+mechanisms+of+fast-decay+red-fluorescent+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).</li>
<li>de Juan-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+controls+release+probability+in+CNS+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals.</a> Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).</li>
<li>Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1">http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1</a> (2014).</li>
<li>Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+promoters+for+C.+elegans+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific promoters for C. elegans glia.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).</li>
<li>Ali, F., Kwan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+in+vivo+calcium+signals+from+neuronal+cell+bodies%2C+axons%2C+and+dendrites%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review.</a> Neurophotonics. 7 (1), 011402(2019).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+deep+two-photon+calcium+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Improved deep two-photon calcium imaging in vivo.</a> Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).</li>
<li>Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+mitochondrial+calcium+handling+due+to+presenilin+loss+disrupts+redox+homeostasis+and+promotes+neuronal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction.</a> Antioxidants. 11 (9), 1642(2022).</li>
<li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+imaging+of+voltage+and+calcium+signals+reveals+neural+processing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li>
<li>Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+cortical+dendrites+modulate+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Active cortical dendrites modulate perception.</a> Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).</li>
<li>Nicoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+modeling+of+C.+elegans+neurons%3A+Single+ion+currents+and+whole-cell+dynamics+of+AWCon+and+RMD%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD.</a> PLoS One. 14 (7), 0218738(2019).</li>
<li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+L-type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).</li>
<li>O'Hare, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+tuning+of+dendritic+feature+selectivity+by+intracellular+Ca+2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release.</a> Science. 375 (6586), (2022).</li>
<li>Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+GABA+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).</li>
<li>Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+modulate+activity-dependent+AMPA+receptor+transport+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+Stokes+shift+red+fluorescent+Ca2%2B+indicator+protein+for+two-photon+and+ratiometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging.</a> Nature Communications. 5, 5262(2014).</li>
<li>Cho, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+family+of+genetically+encoded+ratiometric+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light+sheet+fluorescence+microscopy+protocol+for+Caenorhabditis+elegans+larvae+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820(2022).</li>
<li>Müller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470(2018).</li>
<li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+in+aging+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200(2012).</li>
<li>Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+aging%3A+Learning+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14(2013).</li>
<li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li>
<li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

A primeira consideração ao implementar o método descrito envolve a seleção de um indicador Ca2+ com características ideais para a pergunta de pesquisa dada. Os indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ tipicamente têm alta afinidade por Ca 2+, e a sensibilidade desses indicadores ao Ca2+ está inversamente relacionada à cinética (taxa liga/desliga)16,17. Isso significa que a sensibilidade ou a cinética do Ca2+ prec...

Os íons cálcio (Ca2+) são carreadores de informação altamente versáteis em muitos tipos celulares. Nos neurônios, o Ca2+ é responsável pela liberação de neurotransmissores atividade-dependente, pela regulação da motilidade citoesquelética, pelo ajuste fino dos processos metabólicos, bem como por muitos outros mecanismos necessários para a adequada manutenção e função neuronal 1,2. Para garantir uma sinalização intracelular eficaz, os neurônios devem manter baixos níveis basais de Ca2+ em seu citoplasma3. Isso é realizado por mecanismos cooperativos de manipulação de Ca 2+, incluindo a captação de Ca2+ em organelas como o retículo endoplasmático (RE) e mitocôndrias. Esses processos, além do arranjo de canais iônicos permeáveis ao Ca 2+ na membrana plasmática, resultam em níveis heterogêneos de Ca2+ citoplasmático em todo o neurônio.
A heterogeneidade do Ca 2+ durante o repouso e a ativação neuronal permitem a regulação diversa e local-específica dos mecanismos dependentes do Ca 2+ 1. Um exemplo dos efeitos concentração-específicos do Ca 2+ é a liberação de Ca 2+ do RE através dos receptores inositol 1,4,5-trisfosfato (InsP 3). Baixos níveis de Ca2+ em combinação com InsP3 são necessários para a abertura do poro permeável ao cálcio do receptor. Alternativamente, altos níveis de Ca2+ inibem direta e indiretamente o receptor4. A importância da homeostase do Ca 2+ para a função neuronal adequada é apoiada por evidências que sugerem que a interrupção da manipulação e sinalização intracelular do Ca2+ é um passo precoce na patogênese de doenças neurodegenerativas e envelhecimento natural 5,6. Especificamente, a captação e liberação anormais de Ca2+ pelo PS e mitocôndrias estão ligadas ao aparecimento de disfunção neuronal na doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington 6,7.
O estudo da dishomeostase de Ca 2+ durante o envelhecimento natural ou neurodegeneração requer a observação longitudinal dos níveis de Ca2+ com resolução subcelular em um organismo vivo e intacto, no qual a arquitetura celular nativa (isto é, o arranjo de sinapses e distribuição de canais iônicos) é mantida. Para este fim, este protocolo fornece orientação sobre o uso de dois sensores Ca2+ codificados geneticamente prontamente disponíveis para registro da dinâmica de Ca2+ in vivo com alta resolução espacial e temporal. Os resultados representativos obtidos usando o método descrito em C. elegans demonstram como a expressão de indicadores de Ca 2+ no citoplasma ou na matriz mitocondrial de neurônios individuais pode permitir a aquisição rápida de imagens fluorescentes (até 50 Hz) que ilustram a dinâmica do Ca 2+ com a capacidade adicional de discernir os níveis de Ca 2+ dentro de estruturas semelhantes à coluna vertebral e mitocôndrias individuais.

<table><tbody><tr><td>Objetiva de óleo 100x/1.40 &nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp; Objetivo UPlanSApo</td></tr><tr><td>10x/0.40</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp; UPlanSApo</td></tr><tr><td>22 mm x 22 mm Tampa de vidro&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>48366-227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose SFR&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>J234-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de vigas</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>Borealis atualiza para a mesa de laboratório CSU-X1</td></tr><tr><td>CleanBench&nbsp;</td><td>TMC&nbsp;</td><td></td><td>Com controle de vibração</td></tr><tr><td>Tubos de cultura descartáveis</td><td>VWR&nbsp;</td><td>47729-572</td><td>&nbsp; 13 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Câmara ambiental</td><td>Thermo Scientific</td><td>3940</td><td>Definido para 20 &graus; C</td></tr><tr><td>Roda de filtro ou controle deslizante</td><td>ASI</td><td></td><td>Para filtros de 25 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>FJH 185</td><td>Caenorhabditis Genetics Center&nbsp;</td><td>FJH 185</td><td>Cepa de verme</td></tr><tr><td>FJH 597</td><td>Centro de Genética Caenorhabditis</td><td>FJH 597</td><td>Cepa de verme</td></tr><tr><td>GFP filtro de emissão passa-banda&nbsp;</td><td>Croma&nbsp;</td><td></td><td>525 &plusmn; 50 nm&nbsp;( 25 mm de diâmetro)</td></tr><tr><td>Combinador a laser ILE&nbsp;</td><td>Andor Technologies&nbsp;</td><td></td><td>4 linhas de laser&nbsp;</td></tr><tr><td>Laser de estado sólido ILE 488 nm</td><td>Andor Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr> Microscópio confocal de disco giratório <tr><td>ImageJ</td> National <td>Institutes of Health</td><td></td><td>Versão 1.52a</td></tr> IX83 de 50 mW<tr><td>&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td>Com disco giratório Yokogawa CSU-X1</td></tr><tr><td>câmera iXon Ultra EMCCD&nbsp;</td><td>Andor Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão de baixa autofluorescência</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Z-81226</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp;</td><td>Dispositivos Moleculares&nbsp;</td><td></td><td>Versão 7.10.1&nbsp;</td></tr><tr><td>Caixa de controle de microscópio</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX3-CBH</td></tr><tr><td>Muscimol&nbsp;</td><td>MP Biomedical&nbsp;/ Sigma</td><td>02195336-CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pAS1</td><td>AddGene</td><td>194970</td><td>Plasmídeo</td></tr><tr><td>pBSKS</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCT61</td><td></td><td></td><td>Plasmídeo disponível no laboratório Hoerndli/Maricq mediante solicitação</td></tr><tr><td>Plasmídeo pJM23</td><td></td><td></td><td>disponível no laboratório Hoerndli/Maricq mediante solicitação</td></tr><tr><td>pKK1&nbsp;</td><td>AddGene&nbsp;</td><td>194969</td> Microesferas de Poliesferas <td>de Plasmídeo</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>00876-15</td><td>&nbsp; 0,094 &micro; m</td></tr><tr><td>Câmara de estabilidade</td><td>Norlake Scientific</td><td>NSRI241WSW/8H</td><td>Definido para 15 > Controlador</td></tr> de <tr><td>palco</td><td>C ASI</td><td></td><td>Com controle de roda de filtro</td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio padrão</td><td>Premiere</td><td>9108W-E</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Controlador de painel de toque</td><td>Olympus</td><td></td><td>I3-TPC</td></tr><tr><td>Corretor Z-drift&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td>IX3-ZDC2</td></tr></tbody></table>

imagem subcelular da manipulação neuronal de cálcio in vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

A imagem com cálcio (Ca 2+) tem sido amplamente utilizada para examinar a atividade neuronal, mas está ficando cada vez mais claro que a manipulação subcelular de Ca2+ é um componente crucial da sinalização intracelular. A visualização da dinâmica subcelular de Ca2+ in vivo, onde os neurônios podem ser estudados em seus circuitos nativos e intactos, tem se mostrado tecnicamente desafiadora em sistemas nervosos complexos. A transparência e o sistema nervoso relativamente simples do nematoide Caenorhabditis elegans permitem a expressão célula-específica e a visualização in vivo de marcadores e marcadores fluorescentes. Entre eles estão indicadores fluorescentes que foram modificados para uso no citoplasma, bem como em vários compartimentos subcelulares, como as mitocôndrias. Este protocolo permite a obtenção de imagens não ratiométricas de Ca 2+ in vivo com uma resolução subcelular que permite a análise da dinâmica de Ca2+ até o nível de espinhas dendríticas individuais e mitocôndrias. Aqui, dois indicadores geneticamente codificados disponíveis com diferentes afinidades de Ca 2+ são usados para demonstrar o uso deste protocolo para medir os níveis relativos de Ca2+ dentro do citoplasma ou matriz mitocondrial em um único par de interneurônios excitatórios (AVA). Juntamente com as manipulações genéticas e observações longitudinais possíveis em C. elegans, este protocolo de imagem pode ser útil para responder a perguntas sobre como o manuseio de Ca2+ regula a função neuronal e a plasticidade.

Estes dois protocolos permitem a rápida aquisição de níveis diferenciais de Ca2+ dentro das regiões subcelulares e organelas de neuritos individuais in vivo com alta resolução espacial. O primeiro protocolo permite a dosagem citoplasmática de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial. Isso é demonstrado aqui usando a expressão célula-específica de GCaMP6f nos interneurônios de comando glutamatérgico AVA15, cujos neuritos percorrem toda a extensão do cordão nervoso ...

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Esta técnica pode ser usada para avançar nossa compreensão da manipulação de cálcio em neurônios, e como o cálcio compartimentalizado pode regular diferentes mecanismos importantes para a função neuronal in vivo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite imagens in vivo rápidas de maior resolução em condições fisiológicas em C.elegans que podem ser combinadas com outras ferramentas fluorescentes. Esta técnica poderia fornecer informações sobre o mecanismo de regulação da sinalização de cálcio em neurônios em muitos contextos diferentes.Por exemplo, durante o envelhecimento, lesão neuronal e neurodegeneração. Quem demonstrará esse procedimento será Ennis Deihl, técnico de pesquisa. Kaz Knight, doutorando, e Rachel Doser, pesquisadora de pós-doutorado do meu laboratório.Comece clonando vetores de expressão que contêm um promotor seguido por um indicador de cálcio e três UTR principais de escolha. Criar cepas transgênicas de C.elegans por microinjeção de uma mistura de DNA contendo o DNA de resgate Lin-15 plus no transgene indicador de cálcio na gônada de um dia de idade adulta C.elegans. Manter os vermes pais injetados a 20 graus Celsius até que a progênie F1 atinja a idad

subcellular-imaging-of-neuronal-calcium-handling-in-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Atividade espontânea de desenvolvimento de redes neuronais podem ser medidos utilizando-AM éster formas de corantes de cálcio sensível indicador. Alterações de cálcio intracelular, o que indica a ativação neuronal, são detectados como alterações transitórias na fluorescência indicador com um ou dois fótons de imagem. Este protocolo pode ser adaptada para uma série de developmentally dependentes de redes...

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

Fonte: Doser, R., et al. Imagem subcelular do manuseio de cálcio neuronal in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra imagens in vivo do fluxo de cálcio subcelular nos neurônios do cordão nervoso ventral de cepas transgênicas de Caenorhabditis elegans. Dois indicadores distintos de cálcio são empregados: um indicador citoplasmático em uma cepa e um indicador mitocondrial em outra. Os neurônios são observados sob um microscópio de fluorescência para monitorar mudanças em tempo real na...

Imagem da dinâmica do cálcio subcelular em neurônios de Caenorhabditis elegans

Com o seu pequeno corpo transparente, neuroanatomia bem documentado e uma série de técnicas genéticas passíveis e...

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede de neurônios e glia localizada na parede intestinal que controla os reflexos intestinais. Este protocolo descreve métodos para registrar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações vivas de ENS usando imagens de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca2+ mediados por IP3 usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca2+, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

A imagem celular de cálcio é uma metodologia versátil para estudar a sinalização dinâmica de células individuais, em populações mistas na cultura ou mesmo em animais despertados, com base na expressão de canais/receptores permeáveis de cálcio que dão assinaturas funcionais únicas.

Visualizando mudanças no Circuito Neuron-Glia com a Técnica de Imagem de Cálcio

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Aprenda a realizar imagem subcelular de cálcio em neurônios de Caenorhabditis elegans com alta resolução in vivo. Este método permite estudar dinâmicas de cálcio em compartimentos neuronais específicos.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Explorar mais vídeos