Name: Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a mensurar a respiração mitocondrial de neutrófilos de camundongo e humanos, além de células HL60, usando o analisador de fluxo extracelular metabólico. Este método permite quantificar a função mitocondrial em condições normais e de doença.

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Agradecemos ao Dr. Anthony T. Vella e à Dra. Federica Aglianoin do Departamento de Imunologia da UConn Health por seu treinamento no uso do analisador de fluxo extracelular metabólico, e à Dra. Lynn Puddington no Departamento de Imunologia da UConn Health por seu apoio aos instrumentos. Agradecemos à Dra. Geneva Hargis, da UConn School of Medicine, por sua ajuda na redação científica e edição deste manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (R01HL145454), Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R35GM147713 e P20GM139763), um fundo de inicialização da UConn Health e uma bolsa de reentrada na carreira da Associação Americana de Imunologistas.

Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.

O procedimento padrão que mede a respiração mitocondrial de neutrófilos usando o analisador de fluxo extracelular metabólico é limitado por muitos fatores, incluindo número celular, crescimento celular e viabilidade. Cada concentração de composto varia entre o tipo e a fonte de células neste ensaio. Oligomicina e rotenona/antimicina A são usadas principalmente em uma concentração semelhante entre a maioria dos tipos celulares. No entanto, como a frequência respiratória máxima induzida pelo FCCP varia entre as diferentes ...

As mitocôndrias desempenham um papel importante na bioenergética celular, que gera trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilação oxidativa (OXPHOS). Além disso, o papel das mitocôndrias se estende à geração e desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, regulação do cálcio da matriz citoplasmática e mitocondrial, síntese celular, catabolismo e transporte de metabólitos dentro da célula1. A respiração mitocondrial é essencial em todas as células, pois sua disfunção pode resultar em problemas metabólicos 2, incluindo doenças cardiovasculares3 e uma grande variedade de doenças neurodegenerativas, como degeneração macular relacionada à idade4, Parkinson e Alzheimer5 e doença de Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.
Estudos de microscopia eletrônica em neutrófilos revelaram que há relativamente poucas mitocôndrias7, e elas dependem fortemente da glicólise para sua produção de energia, uma vez que as taxas de respiração mitocondrial são muito baixas8. Entretanto, as mitocôndrias são cruciais para as funções dos neutrófilos, como quimiotaxia9 e apoptose10,11,12. Um estudo anterior revelou uma complexa rede mitocondrial em neutrófilos humanos com alto potencial de membrana. A perda do potencial de membrana mitocondrial é um indicador precoce de apoptose neutrofílica10. O tratamento com o desacoplador mitocondrial carbonil cianeto m-clorofenil hidrazona (CCCP) mostrou inibição significativa da quimiotaxia, juntamente com alteração na morfologia mitocondrial 9,10.
Embora a principal fonte de energia para os neutrófilos seja a glicólise, as mitocôndrias fornecem o ATP que inicia a ativação dos neutrófilos alimentando a primeira fase da sinalização purinérgica, que aumenta a sinalização de Ca2+, amplifica a produção de ATP mitocondrial e inicia as respostas funcionais dos neutrófilos13. A disfunção da cadeia respiratória mitocondrial resulta na produção excessiva de espécies reativas tóxicas de oxigênio (EROs) e leva a danos patogênicos14,15,16. NETosis, que é o processo de formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), é uma propriedade crítica dos neutrófilos que os ajuda a lutar contra patógenos17 e contribui para muitas condições patológicas, incluindo câncer, trombose e doenças autoimunes18. As ERO derivadas da mitocôndria contribuem para a NETosis19, o DNA mitocondrial pode ser um componente das NETs18 e a homeostase mitocondrial alterada prejudica a NETosis 20,21,22,23,24. Além disso, durante a diferenciação ou maturação normal, a reprogramação metabólica dos neutrófilos é revertida pela limitação da atividade glicolítica, que se engaja na respiração mitocondrial e mobiliza lipídios intracelulares25,26.
O analisador de fluxo extracelular metabólico pode monitorar e quantificar continuamente a respiração mitocondrial de células vivas e a glicólise. O analisador utiliza um cartucho sensor em formato de placa de 96 poços e dois fluoróforos para quantificar a concentração de oxigênio (O2) e as mudanças de pH. O cartucho do sensor está acima da monocamada da célula durante o ensaio e forma uma microcâmara de ~200 nm de altura. Os feixes de fibras ópticas no analisador são usados para excitar os fluoróforos e detectar as mudanças de intensidade fluorescente. Mudanças em tempo real na concentração de O2 e pH são automaticamente calculadas e mostradas como taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR). Há quatro portas no cartucho do sensor que permitem carregar até quatro compostos em cada poço durante as medições de ensaio. Este protocolo concentra-se em quantificar a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos, bem como as células HL60 semelhantes a neutrófilos, usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

<table><tbody><tr><td>37 &graus; C não-CO2&nbsp; incubadora</td><td>Precision</td><td>Economy Model 2EG</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Biorender</td><td></td><td></td><td>Software Application</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Adesivo de Células e Tecidos Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>102416-100</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Ímã EasySep STEMCELL</td><td></td><td>18000</td><td>Ímã</td></tr><tr><td>EasySepMouse Kit de enriquecimento de neutrófilos</td><td>STEMCELL</td><td>19762A</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 9</td><td></td><td></td><td>Aplicativo de software</td></tr><tr><td>Solução de albumina de soro humano (25%)</td><td>Reagentes</td><td></td><td></td> GeminiBio 800-120</tr><tr><td>Cetamina (VetaKet)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-114-10</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes Baldes de placa</td><td>Acessório Eppendorf</td><td>UL155</td><td></td></tr><tr><td>PolymorphPrep</td><td>PROGEN</td><td>1895 (1114683 anterior)</td> <td>solução de polissacarídeo</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD18 humano de camundongo purificado</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td>Clone TS1/18</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Analisador de fluxo extracelular metabólico Seahorse</td><td>Instrumento Agilent</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Cell Mito Kit de teste de estresse</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>kit de teste de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>rotor de balde Eppendorf</td><td></td><td>A-4-62</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Vactrap 2 Vacum Trap</td><td>Fox Lifesciences</td><td>3052101-FLS</td><td>Aplicação</td></tr><tr><td>de Software</td>de<td>Onda</td> de Instrumento <td></td><td></td></tr><tr><td>XF 1.0 M Solução de Glicose</td><td>Agilent</td><td>103577-100</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>XF 100 mM Solução de Piruvato</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>XF 200 mM Solução de Glutamina</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>XF DMEM médio</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td></td></tr> material Xylazine do reagente <tr><td>XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td></td></tr> (<tr><td>injeção de AnaSed)</td> <td>ANESTESICO</td> <td>de DAILYMED</td><td>NDC 59399-110-20</td></tr></tbody></table>

mensuração em tempo real do perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Os neutrófilos são a primeira linha de defesa e os leucócitos mais abundantes em humanos. Essas células efetoras desempenham funções como fagocitose e explosão oxidativa, e criam armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) para depuração microbiana. Novos conhecimentos sobre as atividades metabólicas dos neutrófilos desafiam o conceito inicial de que eles dependem principalmente da glicólise. A medição precisa das atividades metabólicas pode desdobrar diferentes exigências metabólicas dos neutrófilos, incluindo o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (também conhecido como ciclo de Krebs), fosforilação oxidativa (OXPHOS), via das pentoses fosfato (PPP) e oxidação de ácidos graxos (FAO) sob condições fisiológicas e em estados patológicos. Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo e pré-requisitos para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) como um indicador da respiração mitocondrial em neutrófilos derivados da medula óssea de camundongos, neutrófilos derivados do sangue humano e a linhagem celular HL60 semelhante a neutrófilos, usando análise de fluxo metabólico em um analisador de fluxo extracelular metabólico. Este método pode ser usado para quantificar as funções mitocondriais de neutrófilos em condições normais e de doença.

Dinâmica representativa de OCR é mostrada indicando as alterações da respiração mitocondrial em resposta à oligomicina, FCCP e mistura de rotenona/antimicina A de neutrófilos de camundongos (Figura 3A), neutrófilos humanos (Figura 3B) e células HL60 indiferenciadas e diferenciadas (Figura 3C). Em todas as células, o tratamento com oligomicina diminui o valor de OCR inibindo o canal de prótons da ATP sintase; O tratamento com FCCP re...

Descrevemos protocolos stepwise medindo a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos e células HL60 usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Este protocolo concentra-se na quantificação da respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e de camundongos, bem como de células HL60 semelhantes a neutrófilos usando o analisador de fluxo extracelular metabólico. Este método permite quantificar a função mitocondrial em neutrófilos em condições normais e de doença. Esta é uma técnica simples que pode fornecer informações sobre a função mitocondrial das células em resposta a drogas ou qualquer condição de doença.Uma vez que diferentes células têm diferentes eficiências respiratórias mitocondriais, a otimização da densidade de semeadura celular e da concentração de reagentes deve ser realizada com precisão para obter resultados de alta qualidade. Para iniciar o ensaio de fluxo extracelular metabólico, pegue um cartucho de sensor embalado sobre uma placa de 96 poços especialmente projetada e transfira 200 microlitros de meio de calibração para cada poço da placa subjacente. Levante cuidadosamente o cartucho e a placa com calibrador e coloque-o em uma incubadora não umidificada de dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite para hidratação.Em seguida, com base no tipo de célula, revestir a placa de 96 poços com um revestimento específico para garantir a adesão celular. Depois, lave as placas com 200 microlitros de PBS estéril duas vezes. Preparar o meio de ensaio em DMEM com um piruvato milimolar, glicose 10 milimolares e glutamina milimolar.Procure as células de camundongo e de neutrófilos humanos conforme descrito no manuscrito do texto. Para os neutrófilos obtidos do rato, ajuste a densidade celular para 1,1 vezes 10 à sexta célula por mililitro adicionando meio de ensaio. Em seguida, semeie 180 microlitros da suspensão de neutrófilos de camundongo por poço na placa preparada de 96 poços.Da mesma forma, ajustar a densidade de células de neutrófilos humanos para 2,2 vezes 10 para a sexta células por mililitro usando o meio de ensaio. No dia do ensaio, conte manualmente as células HL60 semelhantes a neutrófilos usando o hemocitômetro. Em seguida, centrifugar as células HL60 diferenciadas ou indiferenciadas a 300G à temperatura ambiente por cinco minutos.Lave as células com DMEM uma vez e suspenda-as novamente no meio de ensaio para atingir uma densidade celular de 1,39 vezes 10 a sexta células por mililitro. Em seguida, semeie 180 microlitros de células HL60 diferenciadas ou indiferenciadas na placa pré-preparada de 96 poços contendo amostras de neutrófilos de camundongos e humanos. Finalmente, adicione meio completo aos poços de canto da placa de cultura de células desprovida de células para correção de fundo durante a semeadura.Centrifugar a placa a 300G à temperatura ambiente durante três minutos sem pausa para garantir a aderência adequada das células no fundo da placa. Finalmente, incubar a placa por uma hora para pré-equilibrar as células com o meio de ensaio. Abra o kit de teste de estresse mitocondrial e prepare os reagentes de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, carregue o cartucho com reagentes, começando com a oligomicina preparada na porta A, FCCP na porta B e mistura de rotenona/antimicina A na porta C para injeções. Preencha as portas não utilizadas com 20 microlitros de meio de ensaio. Equilibre o sistema de ensaio a 37 graus Celsius pelo menos cinco horas antes do ensaio abrindo o software Wave e clicando na guia Heater On.Depois de atingir a temperatura, o canto inferior esquerdo do software Wave mostra-se pronto. Abra um modelo para o kit de ensaio de estresse mitocondrial no software. Selecione estratégias de injeção no lado esquerdo, clique em Adicionar e nomeie a condição de injeção como neutrófilos humanos ou neutrófilos de camundongo ou HL60.Selecione a porta A a D clicando em cada uma delas, clique em Adicionar composto e digite oligomicina ou FCCP ou rotenona/antimicina A com as respectivas concentrações. Selecione Pré-tratamento no lado esquerdo, clique em Adicionar e nomeie-os CD18 e Cell Tak separadamente. Selecione o Tipo de célula no lado esquerdo.Em seguida, clique em Adicionar e nomeie-os como neutrófilos humanos, neutrófilos de camundongo e HL60 ou DHL60 com uma densidade de alimentação, conforme aplicável. Defina os grupos clicando em Adicionar grupo. Em seguida, clique na definição sublinhada.Clique em Mapa de Placas no menu superior para observar todos os grupos com definições no lado esquerdo e o mapa de placas à direita. Arraste e solte para adicionar cada poço ao grupo, mantendo os quatro poços de canto como plano de fundo. Para configurar o protocolo, selecione a guia Protocolo no menu superior e defina três ciclos de mistura de linha de base, oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina A, definindo o tempo para misturar como três minutos, descanso como zero minutos e medição como sete minutos.Vá para a página Executar Ensaio, forneça as informações de resumo do projeto para referência e clique em Iniciar Execução. Forneça o local para salvar os arquivos para que todos os resultados sejam salvos após a conclusão do ensaio. Em seguida, clique em Iniciar execução novamente.Após o carregamento automático do ensaio, aguarde a abertura da bandeja para colocar o cartucho sensor e a placa com 200 microlitros de calibrador. Defina a direção do código de barras do cartucho voltada para a direita. Execute a calibração clicando em Estou Pronto, o que leva aproximadamente 20 minutos.Após a calibração, clique em Abrir Bandeja, substitua a placa pela placa semeada e clique em Estou Pronto para continuar o ensaio. Após a conclusão do ensaio, os dados são salvos automaticamente. Exporte os resultados para uma planilha ou outro arquivo de software de análise.Plote o gráfico e analise os dados. A dinâmica representativa da taxa de consumo de oxigênio ou OCR indicou alterações na respiração mitocondrial em neutrófilos humanos e de camundongos, bem como células HL60 indiferenciadas e diferenciadas em resposta à oligomicina, FCCP e à mistura de rotenona e antimicina A. Os valores de OCR diminuíram em todas as células após o tratamento com oligomicina devido à inibição do canal de prótons da ATP sintase. O tratamento com FCCP aumentou o fluxo de elétrons e o consumo de oxigênio para restaurar o valor de OCR e alcançar a respiração máxima.Uma mistura de rotenona e antimicina A bloqueou os complexos 1 e 3 da cadeia de transporte de elétrons, levando à eliminação da respiração mitocondrial. Diminuição da respiração mitocondrial foi observada em células HL60 após diferenciação dirigida por neutrófilos. Células HL60 diferenciadas apresentaram respiração mitocondrial basal significativamente menor, respiração ligada a vazamento de prótons, respiração ligada a ATP e respiração não mitocondrial.O aumento da respiração máxima das células HL60 diferenciadas não foi substancial, enquanto a capacidade respiratória sobressalente aumentou significativamente. Certifique-se de que as células estejam na parte inferior da placa, pois o cartucho do sensor não deve ter obstáculos devido às células flutuantes durante a leitura do valor de OCR. Essa técnica ajudaria os pesquisadores a estudar o efeito de drogas ou disfunção mitocondrial em estudos associados a neutrófilos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A descrição de um método para caracterização da função mitocondrial em células é fornecido. O perfil mitocondrial gerado fornece quatro parâmetros da função mitocondrial, que pode ser medido em um experimento: taxa de respiração basal, ATP-linked respiração, vazamento de prótons, e capacidade de reserva.

Experimento Perfil bioenergética usando células C2C12 mioblastos

Este vídeo demonstra o método para analisar o metabolismo energético em células NK humanas ativadas usando um analisador de fluxo extracelular. Diferentes inibidores dos complexos da cadeia de transporte de elétrons afetam a síntese de ATP, que é medida por meio da taxa de consumo de oxigênio ou OCR, fornecendo informações sobre o metabolismo celular e a bioenergética.

Monitoramento em tempo real do metabolismo energético em células NK humanas usando um analisador de fluxo extracelular

Leucócitos e plaquetas do sangue pode ser usado como um marcador de saúde bioenergética geral de um indivíduo e assim têm potencial para controlar processos patológicos e o impacto de tratamentos. Aqui nós descrevemos um método para isolar e medir a função mitocondrial e do burst oxidativo nestas células.

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo prático para avaliar disfunção mitocondrial associada a fadiga em pacientes com câncer. Este protocolo inovador é otimizado para uso clínico envolvendo flebotomia só padrão e os procedimentos básicos de laboratório.

Avaliando o papel da função mitocondrial em fadiga relacionadas ao câncer

Escherichia coli é a principal causa de meningite bacteriana gram-negativa neonatal. Durante a infecção bacteriana, espécies reativas de oxigênio produzidas por neutrófilos desempenham um papel bactericida importante. Aqui introduzimos um método para detectar as espécies reativas de oxigênio em neutrófilos em resposta à meningite E. coli.

Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli

A adaptação metabólica é fundamental para as células T, pois dita diferenciação, persistência e citotoxicidade. Aqui, é apresentado um protocolo otimizado para monitorar a respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas ex vivo .

Monitoramento em tempo real da respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas

O ensaio de fluxo metabólico celular em tempo real mede a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular, que corresponde à produção de triptosfato de adenosina mitocondrial e glicolítico, usando sensores de pH e oxigênio. O manuscrito explica um método para compreender o estado energético dos osteoblastos e a caracterização e interpretação do estado bioenergéstico celular.

Usando o analisador de fluxo metabólico de células em tempo real para monitorar bioenergetics osteoblast

A rede mitocondrial é extremamente complexa, tornando-a muito difícil de analisar. Uma nova ferramenta MATLAB analisa mitocôndrias confocais ao vivo em imagens de timelapse, mas resulta em um grande volume de saída que requer atenção manual individual. Para resolver esse problema, uma otimização de rotina foi desenvolvida, permitindo uma análise rápida dos arquivos.

Análise Automatizada Otimizada da Modulação da Homeostase das Mitocôndrias Neuronais Vivas por Receptores de Ácido Retinóico Isoform-Específicos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Os métodos para estudar a bioenergética mitocondrial sob concentrações de substrato fisiologicamente relevantes em células imunes são limitados. Fornecemos um protocolo detalhado que usa fluorespirometria de alta resolução para avaliar as mudanças na resposta do potencial da membrana mitocondrial à demanda de energia em células T humanas, monócitos e células mononucleares periféricas.

Fluorespirometria de alta resolução para avaliar mudanças dinâmicas no potencial da membrana mitocondrial em células imunes humanas

Aprenda a mensurar a respiração mitocondrial de neutrófilos de camundongo e humanos, além de células HL60, usando o analisador de fluxo extracelular metabólico. Este método permite quantificar a função mitocondrial em condições normais e de doença.

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

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