Name: Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprenda a criar modelos de doenças genéticas em zebrafish usando zSpRY-ABE8e para edição de bases sem restrições PAM. Este método permite conversão eficiente de adenina para guanina com baixa mutação.

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Agradecemos a Barbara Garbers, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) pela edição do texto em inglês de um rascunho deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento da Área-Chave da Província de Guangdong (2019B030335001), pelo Programa Nacional de P&&D da China (2019YFE0106700), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32070819, 31970782) e pelo Programa de Fundo de Pesquisa do Laboratório Chave Provincial de Biologia Patogênica e Epidemiologia para Animais Aquáticos (PBEA2020YB05).

Este estudo foi conduzido em estrita conformidade com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso da Universidade Normal do Sul da China.
1. Preparação de gRNA sinteticamente modificado e mRNA zSpRY-ABE8e
<ol><li>Projetar o gRNA de acordo com publicações anteriores37,38.<ol><li>Selecione preferencialmente NRN como a sequência PAM, pois zSpRY-ABE8e mostra uma preferência maior por NRN PAM do que NYN PAM (onde R é A ou G, e Y é C ou T)18. Certifique-se de que o nucleotídeo de adenina alvo esteja na janela de edição altamente ativa (terceiro ao nono nucleotídeo ao longo do protoespaçador).</li>
	</ol></li>
	<li>Ordem EasyEdit sgRNA (EE gRNA) modificado com 2′-O-metil-3′-fosforotioato (MS) em ambas as extremidades (Figura 1). NOTA: O gRNA EE deve ser dissolvido em água livre de RNase e armazenado a −80 °C.</li>
	<li>Linearizar o plasmídeo zSpRY-ABE8e18.<ol><li>Linearizar 6 μg do plasmídeo com a enzima XbaI (Tabela de Materiais) em banho metálico a 37 °C por 3 h.</li>
		<li>Purificar o plasmídeo linearizado utilizando o kit de purificação de ADN (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Transcrever o RNAm utilizando o kit de transcrição in vitro (Tabela de Materiais).<ol><li>Transcreva o mRNA zSpRY-ABE8e com o plasmídeo linearizado como molde de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: Todas as operações envolvendo mRNA e gRNA requerem o uso de suprimentos laboratoriais livres de RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Use o kit de purificação de RNA (Tabela de Materiais) para purificar o mRNA de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: Antes da elusão, o etanol deve ser seco para evitar citotoxicidade, e o mRNA deve ser armazenado a -80 °C se não for usado imediatamente.</li>
</ol>2. Preparação de capilares de vidro de microinjeção
<ol><li>Configure o sistema extrator de micropipetas e pré-aqueça por pelo menos 30 min.</li>
	<li>Execute um teste em rampa para determinar o valor de calor necessário para derreter os capilares de vidro borossilicato (com 1 mm de diâmetro externo e 0,58 mm de diâmetro interno) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Selecione um programa e clique no número no teclado para inserir os valores dos parâmetros. Defina os seguintes parâmetros para puxar os capilares de vidro: calor = valor do teste em rampa, tração = 50, velocidade = 100, tempo = 50 e pressão = 30.</li>
	<li>Instale o tubo capilar, garantindo que ele esteja no sulco. Pressione PULL START/STOP para executar o programa.</li>
	<li>Preservar os capilares puxados, inserindo-os em espuma que contenha lacunas, mantendo a agulha suspensa.</li>
</ol>3. Microinjeção da mistura de mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA EE em embriões de zebrafish
<ol><li>Monte tanques de reprodução na noite anterior à injeção. Insira um divisor e coloque duas fêmeas e um peixe-zebra macho (3-18 meses de idade) em cada tanque e cubra com a tampa. Consulte publicações anteriores para distinções de gênero39. NOTA: Para obter mais embriões, selecione peixes que não estejam se reproduzindo há pelo menos 1 semana.</li>
	<li>Na manhã seguinte, antes da injeção, descongelar o mRNA zSpRY-ABE8e e o gRNA EE no gelo. Misturar o mRNA e o gRNA até concentrações finais de 400 ng/μL e 200 ng/μL, respectivamente.<ol><li>Realizar todo o procedimento no gelo usando pontas e tubos sem RNase, e manusear com luvas.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure o microinjetor pneumático. Feche a válvula de pressão parcial da bomba de ar e abra a válvula principal primeiro, desaparafuse o cilindro de gás e ajuste a pressão da válvula de pressão parcial para 0,2 MPa/29 psi.<ol><li>Ligue o microinjetor pneumático, ajuste o modo como TIMER e ajuste o valor de pressão do parâmetro inicial para 20,0 psi e o valor TIMER para 0,040 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Use pinças finas para quebrar cuidadosamente as agulhas dos capilares de vidro puxados sob um estereomicroscópio, certificando-se de que as agulhas sejam cortadas em um ângulo para facilitar a perfuração do córion e do ovo. NOTA: O ponto de ruptura da agulha precisa estar no lugar certo e ser forte o suficiente para perfurar o ovo, mas fino o suficiente para minimizar os danos ao ovo.</li>
	<li>Adicione a mistura de mRNA e gRNA zSpRY-ABE8e à ponta de um capilar de vidro usando uma ponta de pipeta microcarregadora, evitando bolhas no capilar. Conecte a agulha ao micromanipulador e configure a pressão e o valor TIMER do injetor para garantir que 2 nL de mistura sejam produzidos por injeção usando uma microtampa.</li>
	<li>Desconecte as divisórias dos tanques de reprodução e deixe os peixes se reproduzirem por 10-15 min. Colete os ovos usando um filtro e examine o estágio celular e a qualidade dos ovos sob um estereomicroscópio. Selecione os ovos no estado de célula única para injeção para melhorar a eficiência da edição.</li>
	<li>Forre os ovos em uma placa de injeção de agarose a 1,5% e injete 2 nL da mistura na célula, não na gema, dos embriões sob um microscópio para melhorar a eficiência da edição. Reter pelo menos 15 ovos como grupo controle.</li>
	<li>Use 1x tampão E3 para coletar os ovos em placas de Petri e coloque-os em uma incubadora a 28 °C. Retirar os ovos mortos e trocar o tampão de cultura a cada 12 h até 48 horas pós-fertilização (hpf).</li>
</ol>4. Análise de eficiência da edição de base com EditR
<ol><li>A 48 hpf, coletar três pools de seis embriões injetados selecionados aleatoriamente e seis embriões controles selecionados aleatoriamente em tubos de PCR, respectivamente. Use uma pipeta para aspirar o tampão E3 residual.</li>
	<li>Adicionar 40 μL de NaOH 50 mM nos tubos de PCR. Coloque os tubos em um banho de metal a 95 °C por 20 min e, em seguida, vórtice por 15 s.</li>
	<li>Adicionar 4 μL de 1 M Tris· HCl (pH 8,0) em cada tubo para neutralizar o NaOH. Centrifugar brevemente a 2.000 x g por 10 s à temperatura ambiente para remover gotículas da parede do tubo. Recolher o sobrenadante em novos tubos de PCR e armazená-los a -20 °C.</li>
	<li>Projetar primers apropriados a montante e a jusante dos locais de destino do gRNA. Use 1 μL do sobrenadante acima como molde para as reações de PCR de 50 μL de volume. Os primers utilizados para a PCR neste estudo estão listados na Tabela Suplementar 1.</li>
	<li>Realizar eletroforese em gel de DNA agarose para garantir bandas corretas e específicas, seguida de sequenciamento de Sanger conforme descrito anteriormente40.</li>
	<li>Analise os dados de sequenciamento do Sanger com o programa EditR (1.0.10)41.<ol><li>Carregue o arquivo de sequenciamento (formato ab1) na caixa "Carregar arquivo .ab1".</li>
		<li>Digite a sequência de gRNA de 20 pb na orientação 5′-3′ na caixa "Enter gRNA sequence".</li>
		<li>Abra o arquivo de sequenciamento (formato ab1) e confirme as posições de base onde a sequência de gRNA de 20 pb começa e termina. Digite a posição base correspondente nas caixas "5′ start" e "3′ end".</li>
		<li>Clique em Edição prevista para obter a eficiência de edição base. Verifique a qualidade dos dados de sequenciamento perto da sequência alvo do gRNA para evitar picos ou indéis desordenados. NOTA: Em geral, os picos desordenados podem ser efetivamente removidos ajustando a temperatura de recozimento da PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completing+the+map+of+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li>
<li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
<li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717(2018).</li>
<li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain%2C+liver%2C+retina%2C+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338(2018).</li>
<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+A%E2%80%A2T+to+G%E2%80%A2C+base+editing+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139(2018).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423(2018).</li>
<li>Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C%3AG+to+T%3AA+base+pairs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118(2017).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552(2021).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421(2022).</li>
<li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+CRISPR%2FCas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099(2021).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li>
<li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpRY+greatly+expands+the+genome+editing+scope+in+rice+with+highly+flexible+PAM+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition.</a> Genome Biology. 22 (1), 6(2021).</li>
<li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. 368 (6488), 290-296 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+mediated+by+SpCas9+variants+with+broad+non-canonical+PAM+compatibility+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants.</a> Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).</li>
<li>Vicencio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+animals+with+minimal+PAM+CRISPR-Cas9+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes.</a> Nature Communications. 13, 2601(2022).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435(2022).</li>
<li>Cornean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in+vivo+functional+analysis+of+DNA+variants+with+base+editing+using+ACEofBASEs+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction.</a> eLife. 11, 72124(2022).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+silencing+by+adenine+base+editor-mediated+start+codon+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation.</a> Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li>
<li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EditR%3A+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li>
<li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous%2C+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR%2FCas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este protocolo descreve a construção de um modelo de doença do zebrafish usando o editor base zSpRY-ABE8e. Em comparação com o caminho HDR tradicional para substituição de base, este protocolo pode alcançar uma edição de base mais eficiente e reduzir a ocorrência de indels. Ao mesmo tempo, este protocolo envolve a implementação da estratégia recentemente proposta de nocaute genético i-Silence em peixes-zebra. Em conjunto, o zSpRY-ABE8e aumentará a aplicação de modelos de peixe-zebra na pesquisa de doenças.
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Variantes de nucleotídeo único (SNVs) que causam mutações missense ou nonsense são a fonte mais comum de mutações no genoma humano1. Para determinar se um determinado SNV é patogênico e esclarecer sua patogênese, modelos animais precisos são necessários2. Os peixes-zebra são bons modelos de doenças humanas, exibindo um alto grau de homologia fisiológica e genética com humanos, um ciclo de desenvolvimento curto e forte capacidade reprodutiva, o que é vantajoso para pesquisas de características e mecanismos patogênicos, bem como triagem de drogas3.
O sistema CRISPR/Cas9 tem sido amplamente aplicado na edição do genoma de várias espécies, incluindo zebrafish4. Com a orientação do gRNA, o sistema CRISPR/Cas9 pode gerar quebras de fita dupla de DNA (DSBs) no local alvo, o que permite a substituição de base única por meio da recombinação do local alvo com modelos de DNA do doador por meio da via de reparo direcionado por homologia (HDR). No entanto, a eficiência desse método de substituição de bases é bastante baixa, uma vez que o processo de reparo do DNA celular é realizado principalmente pela via de junção final não homóloga (NHEJ), que geralmente é acompanhada por mutações de inserção e deleção (indel)5. Felizmente, a tecnologia de edição de base única baseada em CRISPR/Cas9 alivia significativamente esse problema usando editores de base, que permitem uma edição de base única mais eficiente sem induzir DSBs. Duas classes principais de editores de base, editores de base de adenina (ABEs) e editores de base de citosina (CBEs), foram desenvolvidas para implementar a edição de substituição de base para A· T a G· C e C·G para T· A, respectivamente 6,7,8,9,10,11. Esses quatro tipos de substituições de base cobrem 30% das variantes patogênicas humanas12. Ambas as classes de editores base, incluindo PmCDA1, sistema BE, CBE4max, ABE7.10 e ABE8e, têm sido relatadas para trabalhar em peixe-zebra, com BE4max e ABE8e especialmente relatados para atingir alta atividade de edição 13,14,15,16,17,18,19.
Proteínas Cas9 de diferentes espécies, incluindo Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e S. canis, têm sido implementadas na edição gênica de zebrafish, sendo o Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) o maisutilizado20,21,22,23. No entanto, SpCas9 só pode reconhecer sítios alvo com um motivo adjacente (PAM) do protoespaçador NGG, o que limita sua distribuição editável e pode resultar em nenhuma sequência adequada sendo encontrada perto do sítio patogênico deinteresse24. Para expandir a faixa de destino, uma variedade de variantes SpCas9 foram projetadas para reconhecer diferentes PAMs por meio de evolução direcionada e design guiado por estrutura. No entanto, poucas variantes são eficazes em animais, especialmente em zebrafish, o que limita a aplicação de zebrafish na pesquisa de doenças relacionadas ao SNV25,26,27,28. Recentemente, duas variantes de SpCas9, SpG e SpRY, com restrições menos rigorosas de PAM (NGN para SpG e NNN para SpRY, com maior preferência por NRN do que NYN) foram relatadas exibindo alta atividade de edição em células e plantas humanas 29,30,31,32. Posteriormente, SpG e SpRY, bem como vários de seus editores de base mediada, tais como CBEs mediados por SpRY e ABEs mediados por SpRY, também foram relatados como trabalhando em zebrafish, o que aumentará a aplicação de modelos de zebrafish no estudo mecanístico e triagem de drogas de doenças relacionadas ao SNV 18,33,34,35. Além disso, o i-Silence foi proposto como uma estratégia de nocaute genético eficaz e precisa através da conversão do códon inicial mediada por ABE de ATG para GTG ou ACG36. A combinação da estratégia i-Silence e do editor base mediado por SpRY zSpRY-ABE8e fornece um novo método para modelagem de doenças18. Este protocolo demonstra como realizar a edição gênica usando zSpRY-ABE8e em zebrafish para construir um modelo tsr2 (M1V) usando a estratégia i-Silence. A eficiência de edição e os fenótipos que aparecem nos modelos de zebrafish foram avaliados e analisados.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>1.5% Agarose usado para fazer uma placa de injeção</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borosilicato&nbsp;</td>Placas de cultura de células <td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Kit</td> de Clonagem Ultra One Step <td>Falcon 351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress</td><td>Kit Vazyme</td><td>C115</td><td>para clone de infusão&nbsp;</td></tr><tr><td>Serviço de otimização de códons</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>Comprimento:32 mm, capacidade:0,5 &mu; L</td></tr><tr><td>EasyEdit serviço de gRNA</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Scientific Instrument</td><td>11254-20</td><td>Usado para quebrar meedle</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipeta Extracter&nbsp;</td><td>Instrumento de gagueira</td><td>P-97</td><td>Usado para puxar os capilares de vidro</td></tr><tr><td>HotStart Taq PCR StarMix</td><td>Genstar</td><td>A033-101</td><td>Usado para reação de PCR</td></tr><tr><td>Caixa de clima artificial inteligente</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td><td>Usado para cultivar embriões de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>Usado para fixar peixe-zebra ao fotografar</td></tr><tr><td>pontas de pipeta Microloader& nbsp;</td><td>Kit Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>mMACHINE&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Mutagênese Rápida Mut Express II V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>Kit para microinjetor pneumático de mutagênese dirigida ao local</td></tr><tr><td></td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE kit&nbsp;</td><td>Kit Qiagen</td><td>73504</td><td>para purificação de RNA</td></tr><tr><td>Serviço de sequenciamento Sanger</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio, granulado</td><td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>NaOH usado para extração de genoma</td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX10</td><td>Usado para fotografia do fenótipo</td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo Zoom da Série SZ</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3 mMESSAGE</td><td>Kit Ambion</td><td>AM1348</td><td>para transcrição in vitro&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Plasmídeo TIANprep Mini</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>Kit para kit de extração de plasmídeo</td></tr><tr><td>Kit de Purificação Mini TIANquick Kit de Purificação TIANGEN</td><td></td><td>DP203-02</td><td>para purificação de plasmídeo linearizado</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Usado para anestesiar peixe-zebra</td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano</td><td>Sangon</td><td>A600194-0500</td><td>Componente de Tris&middot; HCl usado para extração do genoma</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Endonuclease de restrição usada para linearização de plasmídeo</td></tr></tbody></table>

edição de base eficiente sem pam para modelagem de zebrafish de doenças genéticas humanas com zspry-abe8e

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

A tecnologia CRISPR/Cas9 aumentou o valor do peixe-zebra para modelar doenças genéticas humanas, estudar a patogênese de doenças e triagem de drogas, mas as limitações do motivo adjacente do protoespaçador (PAM) são um grande obstáculo para a criação de modelos animais precisos de doenças genéticas humanas causadas por variantes de nucleotídeo único (SNVs). Até agora, algumas variantes SpCas9 com ampla compatibilidade PAM mostraram eficiência em peixes-zebra. A aplicação do editor de base de adenina (ABE) otimizado mediado por SpRY, zSpRY-ABE8e, e gRNA modificado sinteticamente em zebrafish permitiu uma conversão eficiente da base adenina-guanina sem restrição de PAM. Descrito aqui é um protocolo para edição eficiente de base de adenina sem limitação de PAM em zebrafish usando zSpRY-ABE8e. Injetando uma mistura de mRNA zSpRY-ABE8e e gRNA sinteticamente modificado em embriões de zebrafish, um modelo de doença do peixe-zebra foi construído com uma mutação precisa que simulou um sítio patogênico do fator de maturação do ribossomo TSR2 (tsr2). Este método fornece uma ferramenta valiosa para o estabelecimento de modelos de doença precisos para o estudo de mecanismos e tratamentos de doenças.

A mutação do TSR2 tem sido relatada como causadora da anemia de Diamond Blackfan (DBA)42. Aqui, um modelo de zebrafish DBA foi construído com uma mutação tsr2 (M1V) usando a estratégia i-Silence. A adenina do códon inicial do zebrafish tsr2 foi convertida com sucesso em guanina usando zSpRY-ABE8e (Figura 3).
A análise EditR dos resultados do sequenciamento de Sanger mostrou que havia uma sobreposição A/G na base d...

Este protocolo descreve como realizar uma edição eficiente da base de adenina sem limitação de PAM para construir um modelo preciso de doença do peixe-zebra usando zSpRY-ABE8e.

Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Este protocolo permite que os pesquisadores construam um número de modelos de zebrafish previamente indisponíveis de variantes de nucleotídeo único relevantes para a doença. As limitações da PAM são o principal obstáculo para a criação de modelos animais precisos, e o zSpRY-ABE8e permite a conversão eficiente da base de adenina em guanina com baixa intermutação e restrição relaxada da PAN. Esta ferramenta pode ser usada para construir modelos precisos de zebrafish para estudar as características patogênicas dos mecanismos da doença relacionados a fuzileiros navais de nucleotídeo único, bem como a triagem de drogas para esta doença.Para começar, configure o sistema extrator de micropipetas e pré-aqueça por pelo menos 30 minutos. Para puxar os capilares de vidro, selecione um programa, defina o valor do teste em rampa como calor, 50 como tração, a velocidade em 100, o tempo como 50 e a pressão como 30. Em seguida, instale o tubo capilar garantindo que ele esteja no sulco.Pressione pull start/stop" para executar o programa. Para preservar os capilares puxados, insira-os em espuma contendo lacunas mantendo a agulha suspensa. Para experimentação, use o mRNA zSpRY-ABE8e descrito no manuscrito e o sgRNA de fácil edição modificado com 2'O-metilfosforotioato em ambas as extremidades.Para o desenho de gRNA, selecione preferencialmente NRN como a sequência PAM, pois zSpRY-ABE8e mostra uma preferência maior por NRN PAM do que NYN PAM. Digite o nucleotídeo de adenina alvo está na janela de edição altamente ativa do terceiro ao nono nucleotídeo ao longo do protoespaçador. Monte tanques de reprodução na noite anterior à injeção.Insira uma divisória, colocando duas fêmeas e um macho de peixe-zebra em cada tanque. Coloque uma tampa sobre cada tanque. Na manhã seguinte, usando pontas, tubos e luvas sem RNase, misture o mRNA e o EEgRNA descongelados no gelo até uma concentração final de 400 e 200 nanogramas por microlitro, respectivamente.Para configurar o microinjetor pneumático, primeiro, feche a válvula de pressão parcial da bomba de ar. Em seguida, abra a válvula principal, desaparafuse o cilindro de gás e ajuste a pressão da válvula de pressão parcial para 0,2 Megapascals. Agora, ligue o microinjetor e defina o modo para temporizador.Ajuste a válvula de pressão do parâmetro para 20 libras por polegada quadrada e o valor do temporizador para 0,040 segundos. Usando pinças finas, quebre angularmente as agulhas dos capilares de vidro puxados sob um microscópio estéreo. Usando uma ponta de pipeta de microcarregador, adicione a mistura de mRNA/gRNA à ponta de um capilar de vidro e prenda a agulha ao micromanipulador.Configure o valor da pressão e do temporizador para produzir uma mistura de dois nanolitros por injeção usando uma microtampa. Após a reprodução dos peixes por 10 a 15 minutos, colete os ovos em um coador. Examine o estágio celular e a qualidade do ovo sob o microscópio estéreo.Selecione ovos unicelulares para injeção para melhorar a eficiência da edição. Forre os ovos em uma placa de injeção de agarose a 1,5% e injete dois nanolitros da mistura de RNA na célula dos embriões usando um microscópio. Recolha os ovos em placas de Petri com E3 Buffer e incube-os a 28 graus Celsius.Retire os ovos mortos e troque o tampão de cultura a cada 12 horas por 48 horas pós-fertilização. Após 48 horas pós-fecundação, coletar três pools de seis embriões injetados selecionados aleatoriamente em um tubo de PCR. Uma vez que seis embriões controles selecionados aleatoriamente são coletados, use uma pipeta para aspirar o tampão E3 residual.Adicionar 40 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolares aos embriões. Coloque os tubos em um banho de metal a 95 graus Celsius por 20 minutos e, em seguida, vórtice por 15 segundos. Adicionar quatro microlitros de cloridrato de Tris molar a pH oito em cada tubo.Centrifugar os tubos a 2000g durante 10 segundos à temperatura ambiente. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de PCR. Remova um microlitro do sobrenadante do tubo de PCR e use-o para o sequenciamento de Sanger.Em seguida, armazene o sobrenadante restante a 20 graus Celsius. Para analisar os dados de sequenciamento do Sanger, comece carregando o arquivo de sequenciamento na caixa "upload ab1 File". Digite a sequência de 20 pares de bases gRNA na orientação 5'a 3', na caixa de sequência de gRNA".Insira a posição base correspondente nas caixas 5'start e 3'ends. Obtenha a eficiência de edição de base clicando em edição preditiva e verificando a qualidade dos dados de sequenciamento. Um modelo de peixe-zebra de anemia de diamante blackfan foi construído convertendo a adenina do códon inicial de Tsr2 em guanina.A análise EditR dos dados de sequência demonstrou uma sobreposição de AG na base de adenina do códon inicial de Tsr2. O fenótipo dos dois embriões Tsr2 de um dia de idade mostrou olhos menores em comparação com os embriões controle. Um pericárdio inchado também foi observado nos embriões mutantes.A fim de obter uma edição de base eficiente, siga rigorosamente o princípio de design de diretriz mencionado anteriormente, que é um pré-requisito para o sucesso do experimento. Modelos precisos são essenciais para o estudo de doenças relacionadas a variantes de nucleotídeo único. O desenvolvimento do SprY-ABE8e fornece uma ferramenta eficaz para modelagem precisa, que ajuda a promover a pesquisa de mecanismos e tratamentos de doenças.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, apresentamos uma abordagem sistemática para o desenvolvimento fisiologicamente relevante, sensível e...

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A mitose é crítica para todos os organismos vivos e os defeitos geralmente levam ao câncer e distúrbios do desenvolvimento. Usando este protocolo de imagem e o peixe-zebra como sistema modelo, os pesquisadores podem visualizar a mitose em um organismo vertebrado vivo e a infinidade de defeitos que surgem quando os processos mitóticos são defeituosos.

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Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Descrevemos abordagens para a manipulação de genes no sistema modelo evolucionista Astyanax mexicanus. São descritas três técnicas diferentes: transgênese mediada por Tol2, alvo de manipulação do genoma usando CRISPR/Cas9 e nocaute de expressão usando morpholinos. Essas ferramentas devem facilitar a investigação direta de genes subjacentes a variação entre as formas de superfície - e caverna-moradia.

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Este protocolo descreve uma abordagem para facilitar edições precisas em embriões de peixe-zebra usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Um pipeline de fenotipagem é apresentado para demonstrar a aplicabilidade dessas técnicas para modelar uma variante gênica associada à Síndrome do QT Longo.

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As tecnologias CRISPR-Cas revolucionaram o campo da edição do genoma. No entanto, encontrar e isolar a edição de linha germinal desejada continua sendo um grande gargalo. Portanto, este protocolo descreve um método robusto para rastrear rapidamente espermatozoides de peixe-zebra injetados com CRISPR F0 para edições germinativas usando técnicas padrão de PCR, digesto de restrição e eletroforese em gel.

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Aqui, apresentamos um protocolo para marcar proteínas com uma etiqueta de proteína de fluorescência em larvas de peixe-zebra, um sistema in vivo recém-desenvolvido e modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baixa abundância em peixe-zebra.

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Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Aprenda a criar modelos de doenças genéticas em zebrafish usando zSpRY-ABE8e para edição de bases sem restrições PAM. Este método permite conversão eficiente de adenina para guanina com baixa mutação.

Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e

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