Name: Neurônios Kisspeptin Hipotalâmicos como Alvo para Gravações de Patch-Clamp de Células Inteiras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a técnica de patch-clamp de célula inteira para registrar correntes iônicas em neurônios kisspeptin hipotalâmicos. Este método eletrofisiológico avança a compreensão da neuroendocrinologia reprodutiva.

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Este estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP número: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF) e pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código Financeiro 001" (HRV).

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo e foram realizados de acordo com as diretrizes éticas adotadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.
1. Preparação das soluções
<ol><li>Preparação da solução interna NOTA: A solução interna preenche a micropipeta patch-clamp e entrará em contato com o interior da célula (veja um exemplo na Figura 2). As soluções internas podem variar dependendo do tipo de atividade a ser medida33.<ol><li>Escolha a solução interna considerando sua finalidade experimental e o tipo de registro apropriado. Para registrar o potencial de membrana no modo de fixação de corrente, use a solução interna composta por 120 mM K-gluconato, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl e 4 mM (Mg)-ATP. Pesar todos os sais de acordo com o volume final desejado, conforme indicado na Tabela 1.</li>
		<li>Utilizar água deionizada suficiente para atingir 90% do volume final da solução. Esse volume garantirá espaço suficiente para ajustar o pH e a osmolaridade.</li>
		<li>Depois de adicionar e misturar todos os ingredientes completamente, ajuste o pH para 7,2-7,3 com 5 M KOH usando um medidor de pH. Use um osmômetro para verificar a osmolaridade, que deve estar em torno de 275-280 mOsm (ajuste, se necessário, apenas para baixo).</li>
		<li>Preparar a solução interna com antecedência e conservar a 8 °C. Adicione o ATP no dia do experimento. Conservar a solução interna contendo ATP a -20 °C (alíquotas de 1 ml) durante 3-4 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da solução de fatiamento<ol><li>Preparar solução de fatiamento contendo 238 mM de sacarose, 2,5 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1,0 mM de NaH 2 PO4, 10 mM de glicose, 1,0 mM de CaCl 2 e 5,0 mM de MgCl2. Pesar todos os sais de acordo com o volume final desejado, conforme mostra a Tabela 2. O volume exato desta solução a ser preparada dependerá do tamanho da câmara de corte.</li>
		<li>Ao misturar todos os sais em água deionizada, saturar constantemente com carbogênio (95% O 2 e 5% CO2). Conecte tubos de polietileno (1,57 mm de diâmetro externo [OD] x 1,14 mm de diâmetro interno [ID]) a um cilindro de carbogênio para fornecer carbogênio à solução de fatiamento. Segure a extremidade aberta do tubo dentro do copo que contém a solução de fatiamento.</li>
		<li>Depois de misturar bem todos os ingredientes, ajuste o pH para 7,3 com 10% de ácido nítrico usando um medidor de pH. Use um osmômetro para verificar a osmolaridade, que deve ser de 290-295 mOsm (ajuste, se necessário, apenas para baixo). Depois, arrefecer a solução a 0-2 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar solução aCSF para gravações<ol><li>Preparar solução artificial de líquido cefalorraquidiano (aCSF) para gravações contendo NaCl 124 mM, KCl 2,8 mM, NaHCO3 26 mM, NaH 2 PO 4 1,25 mM, MgSO4 mM, glicose 5 mM e CaCl 22,5mM. Pesar todos os sais de acordo com o volume final desejado, indicado na Tabela 3.</li>
		<li>Ao misturar todos os sais em água deionizada, saturar constantemente com carbogênio (95% O 2 e 5% CO 2), conforme descrito na etapa 1.2.2.</li>
		<li>Depois de adicionar e misturar todos os ingredientes, ajuste o pH para 7,3 (10% de ácido nítrico pode ser usado) usando um medidor de pH. Use um osmômetro para verificar a osmolaridade, que deve ser de 290-300 mOsm. Depois, despeje o aCSF em um copo e mantenha em banho-maria a 30 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dissecção e fatiamento cerebral
NOTA: Como diferentes estruturas cerebrais podem exigir cortes em diferentes planos (cortes coronais, sagitais ou horizontais), a abordagem exata para a obtenção dos cortes depende da região cerebral de interesse. Tipicamente, estudar as células que expressam Kiss1 no AVPV/PeN e ARH (aqui denominados como neurônios AVPV/PeNKisspeptin e neurônios ARHkisspeptin; Figura 2A,B), cortes cerebrais coronais (200-300 μm) são usualmente confeccionados 17,19,20,21,34. Os neurôniosKisspeptin AVPV/PeN estão localizados a aproximadamente 0,5 a -0,22 mm do bregma, enquanto os neurônios ARHkisspeptin estão em -1,22 a -2,70 mm. A localização dos núcleos pode ser determinada usando um atlas estereotáxico do cérebro de camundongo35 ou o Allen Mouse Brain Reference Atlas (http://mouse.brain-map.org/). Camundongos adultos Kiss1-Cre/GFP fêmeas (estádio diestro) e machos36 foram utilizados neste estudo.
<ol><li>Remoção do cérebro<ol><li>Prepare o local da dissecção e as ferramentas necessárias para extrair o cérebro: tesoura de decapitação, tesoura de íris, tesoura curva de Castroviejo, osteótomo, pinça, espátula, papel de filtro, placa de Petri, lâmina de barbear e cola de cianoacrilato.</li>
		<li>Antes de fazer os cortes, prepare a bancada na qual será realizada a dissecção, pois todos os procedimentos subsequentes devem ser realizados rapidamente. Certifique-se de ter acesso a um dispositivo de fatiamento, como um vibratome.</li>
		<li>Prepare uma câmara de gravação para manter as fatias cerebrais antes de cortar o tecido. Adquira uma câmara de gravação, dimensões de banho de 24 mm x 15 mm x 2 mm (L x W x H), de uma marca comercial (Tabela de Materiais) ou faça uma in-house. NOTA: Uma câmara de recuperação interna pode ser fabricada da seguinte forma: corte uma placa de 24 poços para que nove poços estejam disponíveis. Cole uma tela de nylon na base dos nove poços. Com o restante da placa do poço, faça uma base para que a parte inferior do nylon fique livre. Essa base adaptada pode ser colocada dentro de um copo de 500 mL contendo o aCSF (Figura 1 Suplementar).</li>
		<li>Após o preparo tudo, anestesiar o animal com anestésico inalatório com isoflurano a 4%-5%. A anestesia deve estar de acordo com um protocolo aprovado pelo comitê de ética. Logo após o animal ficar imóvel, realize testes de pinça da cauda e da pata para garantir que o animal esteja profundamente anestesiado.</li>
		<li>Decapite rapidamente os ratos enquanto o coração ainda está ativo para aumentar a viabilidade celular. Colha o cérebro rapidamente após a decapitação.</li>
		<li>Com a tesoura cirúrgica, faça uma incisão na pele na parte superior do crânio do animal, de caudal a rostral, e retire o couro cabeludo da cabeça do animal. Em seguida, cortar a placa interparietal ao longo da sutura sagital com a tesoura da íris e remover o osso occipital. Deslize o osteótomo sob o osso parietal e retire-o suavemente até que o cérebro fique exposto.</li>
		<li>Depois de expor o cérebro, vire a cabeça de cabeça para baixo, abaixe suavemente o cérebro para visualizar o nervo trigêmeo de cada lado e, em seguida, corte o nervo trigêmeo usando uma tesoura curva de Castroviejo. Depois de visualizar o hipotálamo, identifique o nervo óptico e corte-o suavemente. NOTA: Tenha cuidado ao cortar o nervo óptico, pois puxá-lo rasgará a área hipotalâmica adjacente que contém o núcleo da VPV/PeN.</li>
		<li>Corte a porção mais anterior do lobo frontal e remova o cérebro completamente. Mergulhe imediatamente o cérebro na solução de fatiamento até adquirir as fatias.</li>
	</ol></li>
	<li>Fatiamento de amostras cerebrais<ol><li>Coloque o cérebro em papel filtro (apoiado em uma placa de Petri) para secar o excesso de solução. Em seguida, com uma lâmina de barbear cortante afiada, execute um corte coronal separando o tronco cerebral com o cerebelo do resto do tecido.</li>
		<li>Em seguida, cole a porção caudal do cérebro na base do vibratomo e preencha a câmara do dispositivo de fatiamento com a solução de fatiamento/aCSF resfriada a 0-2 °C. Durante o procedimento, coloque gelo seco ao redor da câmara vibratória para manter a solução de fatiamento fria.</li>
		<li>Insira a lâmina de barbear no vibratomo e defina os parâmetros de corte apropriados do dispositivo: velocidade = 3, frequência = 9 e alimentação = 250 μm. Utilizar uma pipeta de transferência acrílica (pipeta de vidro Pasteur invertida acoplada a um teto de silicone) para transferir os cortes para a câmara de recuperação (descrita no passo 2.1.3) durante o procedimento de fatiamento do tecido. Aguarde 60 min para recuperação do tecido após a aquisição do corte.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vedação de células para gravação
<ol><li>Certifique-se de que todos os equipamentos (microscópio, amplificador, digitalizador, micromanipulador e outros) estejam ligados antes de iniciar a gravação.</li>
	<li>Preencher a câmara de gravação, de marca comercial (Tabela de Materiais), acoplada ao microscópio com a solução de aCSF para gravações. Use uma bomba de perfusão para perfundir constantemente o aCSF a uma taxa de 2 mL/min.</li>
	<li>Transfira uma fatia cerebral de interesse (uma de cada vez) para a câmara de gravação. Use uma pipeta de transferência de acrílico (pipeta de vidro Pasteur invertida acoplada a um teto de silicone) para transferir as fatias hipotalâmicas para a câmara. Use uma âncora de corte (Tabela de Materiais) para segurar a fatia para que ela não se mova durante a perfusão do aCSF.</li>
	<li>Coloque uma fatia no centro da câmara de gravação conectada ao microscópio. A posição do corte é fundamental para permitir uma boa visualização da região desejada sob o microscópio e para um perfeito alcance da micropipeta de registro.</li>
	<li>Use a lente objetiva de baixa potência de um microscópio de imersão (10x ou 20x) para auxiliar no posicionamento do corte e na localização da região de interesse.</li>
	<li>Após localizar a região de interesse, alternar a lente objetiva para a lente de alta potência (63x) e focalizar o nível tecidual, observando a proteína fluorescente endógena e as formas das células na região alvo para localizar as células kisspeptina na superfície do corte cerebral20.</li>
	<li>Quando uma possível célula de destino estiver localizada, marque-a na tela do computador com o cursor do mouse ou desenhando um formato, como um quadrado, sobre a área de interesse. A marca de tela do computador ajuda a guiar a posição da micropipeta de gravação para a célula.</li>
	<li>Depois de determinar a localização exata da célula alvo, levante a objetiva e introduza a micropipeta de gravação preenchida com a solução interna. Ao colocar a micropipeta no suporte do eletrodo, verifique se a solução interna está em contato com o eletrodo de prata. NOTA: Para a preparação, colocação e posicionamento da micropipeta no suporte do eletrodo, consulteo item 33.</li>
	<li>Aplicar pressão positiva antes de submergir a micropipeta na solução de aCSF, para evitar a entrada de detritos na micropipeta, utilizando uma seringa de 1-3 mL cheia de ar conectada ao suporte da micropipeta através de uma tubulação de polietileno (≈130 cm mais longa); aplicar cerca de 100-200 μL de ar.</li>
	<li>Usando o micromanipulador, guie a micropipeta abaixo do centro da objetiva. Mova os botões do micromanipulador para guiar a micropipeta no eixo X-Y-Z em direção à célula de interesse.</li>
	<li>Ajuste o foco para ver a ponta da micropipeta e aproxime o foco, mas não muito perto, da fatia. Reduza a velocidade do micromanipulador e abaixe lentamente a micropipeta para o plano de foco. Certifique-se de que a ponta da micropipeta não penetre abruptamente na fatia, mas desca lentamente até tocar a superfície da célula/região alvo.</li>
	<li>Aplicar pressão positiva leve (≈100 μL) com a seringa de 1-3 mL cheia de ar conectada ao suporte da micropipeta para remover quaisquer detritos do caminho de aproximação.</li>
	<li>Concentre-se na célula alvo e mova lentamente o micromanipulador no eixo X-Y-Z para aproximar a micropipeta da célula alvo. Ao tocar a micropipeta na célula, observa-se uma covinha causada pela pressão aplicada através da ponta da micropipeta (Figura 2C).</li>
	<li>Após a formação da fossa, devido à proximidade da micropipeta com a célula, aplicar sucção fraca e breve pela boca (1-2 s) através do tubo conectado ao suporte da micropipeta para gerar a vedação entre a micropipeta e a célula (selo gigaohm ou gigaseal >1 GΩ; Figura 2D). Para formar o selo, use o modo de fixação de tensão no software. Para detalhes sobre a formação do selo, consulte33.</li>
	<li>Se a vedação permanecer estável (a vedação gigaohm deve ser mecanicamente estável e sem interferência de ruído, determinada pela observação por cerca de 1 min), ajuste a tensão de retenção no potencial de repouso fisiológico mais próximo da célula de interesse. Para neurônios hipotalâmicos kisspeptin, -50 mV é recomendado.</li>
	<li>Aplicar breve sucção por via oral (pressão negativa) com a micropipeta selada à célula para romper a membrana plasmática (Figura 2E). A configuração adequada de célula inteira é alcançada quando a sucção é realizada com força suficiente para que a membrana rompida não obstrua a micropipeta e não atraia uma porção considerável da membrana ou mesmo da célula.</li>
	<li>Verifique o manual de configurações do sistema usado. Use o software (consulte Tabela de Materiais) para verificar e calcular digitalmente a resistência em série (SR) e a capacitância de célula inteira (wcc).</li>
	<li>No modo de fixação de tensão, depois de quebrar a membrana celular, ative a opção de célula inteira e clique no comando Auto referente à guia de célula inteira. O SR e o wcc da célula serão calculados automaticamente e exibidos instantaneamente pelo software. Esses parâmetros também podem ser verificados através da realização do teste de membrana com o amplificador mencionado na Tabela de Materiais33.</li>
	<li>Certifique-se de verificar os parâmetros de viabilidade celular. Para os neurônios da kisspeptina, verificar se as medidas eletrofisiológicas são: SR < 25 mΩ, resistência de entrada > 0,3 GΩ e mantendo o valor absoluto da corrente < 30 pA (observações pessoais e referência21). O valor médio do wcc dos neurônios AVPV/PeN kisspeptin ou ARHkisspeptin é ≈ 10-12 pF em camundongos gônadas intactos20.</li>
	<li>Monitorar o SR e a capacitância em estado estacionário da célula durante os experimentos. Certifique-se de que o SR não mude mais de 20% durante uma gravação e que a capacitância da membrana seja estável.</li>
	<li>Verifique as configurações do software. Criar protocolos específicos para as gravações de acordo com o tipo de experimento. Para registrar o potencial de membrana no modo corrente-pinça, com os equipamentos mencionados na Tabela de Materiais, filtre passa-baixa os sinais eletrofisiológicos em 2-4 kHz e analise os resultados off-line em um software (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre o software).</li>
	<li>Uma vez que a configuração de célula inteira esteja adequadamente alcançada, meça as correntes sinápticas no modo de pinça de tensão (Figura 2G). Registrar alterações no potencial de membrana de repouso (RMP) e variações induzidas de RMP no modo de pinça de corrente (Figura 2H). Alterações no PGR, como a despolarização da membrana celular, podem ser induzidas pela administração de um medicamento/neurotransmissor conhecido ao banho (descrito no passo 3.2), conforme ilustrado na Figura 1. NOTA: No modo de fixação de corrente, a corrente positiva ou negativa pode ser injetada para manter a tensão da membrana em uma tensão desejada. Para os neurônios de kisspeptina, geralmente definimos a injeção de corrente zero (I = 0) para registrar a variação espontânea do potencial de membrana.</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse a declarar.

O desenvolvimento da técnica de patch-clamp de células inteiras teve um impacto significativo na comunidade científica, sendo considerada de suma importância para o desenvolvimento de pesquisas científicas e possibilitando diversas descobertas. Seu impacto na ciência foi suficiente para culminar com o Prêmio Nobel de Medicina em 1991, pois essa descoberta abriu as portas para uma melhor compreensão do funcionamento dos canais iônicos em condições fisiológicas e patológicas, bem como a identificação de potenciais<sup clas...

Hodgkin e Huxley fizeram o primeiro registro intracelular de um potencial de ação descrito em vários estudos científicos. Este registro foi realizado no axônio da lula, que tem um grande diâmetro (~500 μm), permitindo que um microeletrodo seja colocado dentro do axônio. Este trabalho proporcionou grandes possibilidades para a pesquisa científica, culminando posteriormente com a criação do modo tensão-pinça, que foi utilizado para estudar a base iônica da geração do potencial de ação 1,2,3,4,5,6,7,8. Com o passar dos anos, a técnica foi se aprimorando, tornando-se amplamente aplicada em pesquisascientíficas6,9. A invenção da técnica patch-clamp, ocorrida no final da década de 1970 por meio de estudos iniciados por Erwin Neher e Bert Sakmann, permitiu aos pesquisadores registrar canais iônicos únicos e potenciais ou correntes de membrana intracelular em praticamente todos os tipos celulares utilizando apenas um eletrodo 9,10,11,12. Os registos de patch-clamp podem ser feitos numa variedade de preparações de tecidos, tais como células cultivadas ou cortes de tecido, quer em modo voltage-clamp (mantendo a membrana celular a uma tensão definida que permite o registo, por exemplo, de correntes dependentes de voltagem e correntes sinápticas) quer em modo corrente-clamp (permitindo o registo de, por exemplo, alterações no potencial de membrana de repouso induzidas por correntes iónicas, potenciais de ação e frequência potencial pós-sináptico).
O uso da técnica patch-clamp possibilitou várias descobertas notáveis. De fato, os achados seminais sobre as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios kisspeptina hipotalâmico localizados nos núcleos periventricular anteroventral e periventricular rostral (VPVV/PeN Kisspeptina), também conhecidos como área periventricular rostral do terceiro ventrículo (RP3V), e núcleo arqueado do hipotálamo (ARHkisspeptina)13,14,15 são de particular interesse. Em 2010, Ducret e colaboradores realizaram os primeiros registros de neurônios deKisspeptinAVPV/PeN em camundongos usando outra ferramenta eletrofisiológica, a técnica de patch-clamp de células soltas. Esses estudos forneceram uma descrição elétrica dos neurôniosKisspeptin AVPV/PeN e demonstraram que seus padrões de disparo são dependentes do ciclo estral16. Em 2011, Qiu e col. utilizaram a técnica de patch-clamp de células inteiras para demonstrar que os neurônios dakisspeptina ARH expressam correntes endógenas de marcapasso17. Posteriormente, Gottsch e col. mostraram que os neurônios kisspeptin exibem atividade espontânea e expressam correntes de cálcio do tipo h (marca-passo) e do tipo T, sugerindo que os neurônios dakisspeptina ARH compartilham propriedades eletrofisiológicas com outros neurônios marca-passo do sistema nervosocentral18. Além disso, foi demonstrado que os neurônios da kisspeptina ARH exibem taxas de disparo sexualmente dimórficas e que os neurônios daKisspeptina AVPV/PeN exibem um potencial de membrana de repouso (RMP) bimodal influenciado por canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP)19,20. Além disso, foi estabelecido que os esteroides gonadais afetam positivamente a atividade elétrica espontânea dos neurônios kisspeptin em camundongos 19,20,21. São citados os primeiros trabalhos que estudam as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios kisspeptina 16,17,18,19,20. Desde então, muitos estudos têm utilizado a técnica de patch-clamp de células inteiras para demonstrar quais fatores/neuromoduladores são suficientes para modular a atividade elétrica dos neurônios kisspeptin (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
Dada a importância dessa técnica para o estudo dos neurônios necessários para a reprodução, entre outros tipos celulares não abordados aqui, este artigo descreve os passos básicos para o desenvolvimento da técnica de patch-clamp de células inteiras, como preparar as soluções, dissecar e fatiar o cérebro e realizar o selamento da membrana celular para registros. Além disso, questões relevantes sobre a técnica são discutidas, como suas vantagens, limitações técnicas e variáveis importantes que devem ser controladas para um ótimo desempenho experimental.

<table><tbody><tr><td><forte>Compostos para aCSF, soluções internas e de corte</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich/vário</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich/vário</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma Aldrich/vário</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich/vário</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/vário</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/vário</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich/vário</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>ácido nítrico</td><td>Sigma Aldrich/vário</td><td>225711</td><td></td></tr><tr><td>CUIDADO Sacarose</td><td>Sigma Aldrich/vário</td><td>S1888<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabela TMC</td><td></td><td>63-534 do ar</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Computador</td><td>vários-DIGIDATA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1440 SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE DADOS DE BAIXO RUÍDO</td> Bomba peristáltica digital <td>Molecular Devices</td><td>DD1440</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ismatec</td><td>ISM833C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>TMC</td><td>81-333-03</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de imagem</td><td>Leica</td><td>DFC 365 FX</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>Roe-200</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td>DM6000 FS</td><td></td></tr><tr><td>Osteótomo</td><td>Bonther equipamentos & </td><td>128</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de recuperação</td><td>Warner Instruments/Harvard</td> <td>apparatus-pode</td> <td>ser feita internamente</td></tr><tr><td>Câmara de gravação</td><td>Warner Instruments</td><td>640277</td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Fisher Scientific /various</td><td>FISH-14-375-10; FISH-21-401-20</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria&nbsp;</td><td>Fisher Scientific /various</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>Software e sistemas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 10</td><td>Software Molecular</td> <td>Devices-Commander</td> <td>LAS</td></tr><tr><td>X wide field system</td><td>Leica-Image</td><td></td> <td>aquisição e análise</td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>Commander Software</td></tr><tr><td>PCLAMP 10 SOFTWARE PARA WINDOWS</td><td>Molecular Devices</td><td>Pclamp 10 Padrão</td><td></td></tr><tr><td><forte>Ferramentas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr>Ag<tr><td>/AgCl eletrodo, pellet, 1.0 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td></td></tr><tr><td>Pinça hemostática curva</td><td></td> vários-cianoacrilato <td></td><td></td></tr><tr><td>cola</td><td>LOCTITE/vários</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de decapitação</td><td></td> <td>vários-Papel</td><td></td></tr> <tr><td>de filtro</td><td>vários-Capilares</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de vidro (micropipeta)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/various</td><td>65-66</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de vidro Pasteur</td><td>Sigma Aldrich/vários</td><td>CLS7095B9-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>vários-Tubulação</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de Polietileno&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0756</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear para dissecção cerebral</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-1</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear para vibratomo</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-9</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/vários</td><td>71-72, 48,49; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tetina de silicone</td><td>vários-Âncora</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de Fatias&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0246</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa</td><td>Merck Millipore Ltda</td><td>SLGVR13SL</td><td>Millex-GV 0.22 &mu; m</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/various</td><td>131, 1518</td><td></td></tr></tbody></table>

neurônios kisspeptin hipotalâmicos como alvo para gravações de patch-clamp de células inteiras

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

As kisspeptinas são essenciais para a maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HPG) e fertilidade. Os neurônios kisspeptina hipotalâmicos, localizados no núcleo periventricular anteroventral e no núcleo periventricular rostral, bem como o núcleo arqueado do hipotálamo, projetam-se para neurônios do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), entre outras células. Estudos anteriores demonstraram que a sinalização da kisspeptina ocorre através do receptor Kiss1 (Kiss1r), excitando a atividade do neurônio de GnRH. Em humanos e modelos animais experimentais, as kisspeptinas são suficientes para induzir a secreção de GnRH e, consequentemente, a liberação de hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH). Uma vez que as kisspeptinas desempenham um papel essencial nas funções reprodutivas, os pesquisadores estão trabalhando para avaliar como a atividade intrínseca dos neurônios hipotalâmicos da kisspeptina contribui para ações relacionadas à reprodução e identificar os neurotransmissores/neuromoduladores primários capazes de alterar essas propriedades. A técnica de patch-clamp de células inteiras tornou-se uma ferramenta valiosa para investigar a atividade de neurônios de kisspeptina em células de roedores. Esta técnica experimental permite aos pesquisadores registrar e medir correntes iônicas excitatórias e inibitórias espontâneas, potencial de membrana de repouso, disparo de potencial de ação e outras propriedades eletrofisiológicas das membranas celulares. No presente estudo, aspectos cruciais da técnica de patch-clamp de células inteiras, conhecida como medidas eletrofisiológicas que definem os neurônios hipotalâmicos da kisspeptina, e uma discussão de questões relevantes sobre a técnica são revistos.

Para estudar os possíveis efeitos do hormônio de crescimento recombinante humano (hGH) sobre a atividade dos neurônios hipotalâmicos kisspeptina, realizamos registros de patch-clamp de células inteiras em fatias cerebrais e avaliamos se esse hormônio causa alterações agudas na atividade dos neurônios dekisspeptina AVPV/PeN e ARHkisspeptina. Camundongos adultos Kiss1-Cre/GFP fêmeas (estádio diestro) e machos36 foram utilizados neste estudo. Animais gônadas intactos foram selec...

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um patch-clamp de células inteiras em fatias cerebrais contendo neurônios de kisspeptina, o principal modulador das células do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH). Ao agregar conhecimento sobre a atividade neuronal da kisspeptina, essa ferramenta eletrofisiológica tem servido de base para avanços significativos no campo da neuroendocrinologia nos últimos 20 anos.

Neurônios Kisspeptin Hipotalâmicos como Alvo para Gravações de Patch-Clamp de Células Inteiras

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Através da medição das propriedades eletrofisiológicas das membranas celulares, a questão das principais provas de que modular a atividade elétrica de uma célula pode ser resolvida. O registro de patch clamp de células inteiras é uma técnica periférica para estudar correntes iônicas em células individuais e interrogar a resposta celular a diferentes estímulos. O melhor desempenho em pré-gravações de grampos de patch de célula inteira será alcançado depois de praticar e estudar muito.Para iniciar a dissecção cerebral, faça uma incisão usando tesoura cirúrgica na pele na parte superior do crânio do animal decapitado do caudle ao rostral e remova o couro cabeludo. Em seguida, cortar a placa interparietal ao longo da sutura sagital com a tesoura da íris e remover o osso occipital. Deslize o osteótomo sob o osso parietal e retire-o suavemente até que o cérebro fique exposto.Depois de expor o cérebro, vire a cabeça de cabeça para baixo. Abaixe suavemente o cérebro para visualizar o nervo trigêmeo de cada lado. Em seguida, corte o nervo trigêmeo com tesoura curva Castroviejo.Depois de visualizar o hipotálamo identificar o nervo óptico e cortá-lo suavemente. Em seguida, corte a porção anterior do lobo frontal. Retire o cérebro e mergulhe-o imediatamente na solução de fatiamento até adquirir as fatias.Para fatiar as amostras cerebrais, coloque o cérebro em um papel de filtro para secar o excesso de solução. Em seguida, com uma lâmina de barbear de corte afiado realizar um corte coronal separando o tronco cerebral com o cerebelo do resto do tecido. Em seguida, cole a porção do cérebro na base de um vibratótomo e preencha a câmara do dispositivo de fatiamento com a solução de fatiamento ou solução de aCSF resfriada a zero a dois graus Celsius.Embale gelo seco ao redor da câmara vibratória para manter a solução fatiada fria durante o procedimento. Insira a lâmina de barbear no vibratomo e defina os parâmetros de corte do dispositivo, como velocidade para três, frequência para nove e alimentação para 250 micrômetros. Durante o procedimento de fatiamento do tecido, transferir os cortes com pipeta de acrílico para a câmara de recuperação e aguardar 60 minutos para recuperação do tecido após a aquisição do corte.Antes de iniciar a selagem e gravação das células, ligue o microscópio, amplificador, digitalizador e micromanipulador. Construa a câmara de gravação conectada ao microscópio com a solução de aCSF. Use uma bomba de perfusão para perfundir constantemente o aCSF a dois mililitros por minuto.Verifique as configurações do software e crie protocolos específicos para as gravações de acordo com o tipo de experimento. Transfira uma fatia cerebral de interesse, uma de cada vez, para a câmara de gravação usando uma pipeta de transferência de acrílico. Segure o corte com uma âncora de corte para que ele não se mova durante a perfusão do aCSF.Posicione o corte no centro da câmara de gravação usando a lente objetiva de baixa potência do microscópio de imersão, 10X ou 20X. A posição do corte é fundamental para permitir uma boa visualização da região desejada sob o microscópio e para um alcance perfeito para a micropipeta de registro. Após localizar a região de interesse, mude a lente objetiva para a lente de alta potência, 63X e foque no nível do tecido observando a proteína fluorescente endógena e as formas das células na região alvo para localizar as células kisspeptina na superfície do corte cerebral.Quando uma possível célula de destino estiver localizada, marque-a na tela do computador com o cursor do mouse ou desenhando um formato como um quadrado sobre a área de interesse. A marca de tela do computador ajuda a orientar a posição da pipeta de gravação para a célula. Depois de determinar a localização exata da célula alvo, levante a objetiva e introduza a micropipeta de gravação preenchida com a solução interna no suporte do eletrodo, garantindo que a solução interna esteja em contato com o eletrodo de prata.Aplique uma pressão positiva antes de submergir a micropipeta na solução de aCSF usando uma seringa de um a três mililitros cheia de ar conectada ao suporte da micropipeta através de uma tubulação de polietileno para evitar que detritos entrem na micropipeta. Usando o micromanipulador guie a micropipeta abaixo do centro da objetiva. Mova os botões do micromanipulador para guiar o eixo XYZ da micropipeta em direção à célula de interesse.Ajuste o foco para ver a ponta da micropipeta e aproxime o foco, mas não muito perto da fatia. Reduza a velocidade do micromanipulador e abaixe lentamente a micropipeta para o plano de foco, garantindo que a ponta da micropipeta não penetre abruptamente na fatia, mas desça lentamente até tocar a superfície da célula ou a região alvo. Aplicar pressão positiva leve com uma seringa cheia de ar de um a três mililitros para limpar quaisquer detritos do caminho de aproximação.Mova lentamente o micromanipulador no eixo XYZ para aproximar a ponta da micropipeta e tocar a célula alvo, o que causa uma covinha pela pressão aplicada. Após o estabelecimento da covinha com a ajuda do modo de fixação de tensão no software, aplique uma sucção fraca breve por via oral por um a dois segundos através do tubo conectado ao suporte da micropipeta para gerar a vedação entre a micropipeta até a célula. Se a vedação permanecer mecanicamente estável sem interferência de ruído por cerca de um minuto, ajuste a tensão de retenção no potencial de repouso fisiológico mais próximo da célula de interesse.Para kisspeptina neurônios hipotalâmicos menos 50 milivolts é recomendado. Em seguida, aplique uma breve sucção por via oral para quebrar a membrana plasmática na ponta da micropipeta selada colocada na célula para que a membrana rompida não obstrua a micropipeta ou atraia uma porção considerável da membrana ou da célula. Uma configuração adequada de célula inteira pode ser alcançada realizando sucção com força suficiente.Verifique o manual de configurações do sistema usado. Depois de quebrar a membrana celular ativar a opção de célula inteira no modo de fixação de tensão e clique no comando automático referente a toda a guia da célula. A resistência em série da célula e a capacitância de toda a célula são calculadas automaticamente e exibidas instantaneamente pelo software.Em seguida, verifique os parâmetros de viabilidade celular no software, conforme descrito no manuscrito do texto. Monitorar a resistência em série e a capacitância em estado estacionário da célula durante os experimentos. Uma vez que toda a configuração da célula é adequadamente alcançada meça as correntes sinápticas no modo de fixação de tensão.Registrar as alterações no potencial de membrana de repouso e as variações induzidas do potencial de membrana de repouso no modo de pinça atual. Os possíveis efeitos do hormônio de crescimento humano recombinante sobre a atividade dos neurônios hipotalâmicos da kisspeptina foram estudados com a ajuda de registros de patch clamp de células inteiras. A administração de hormônio de crescimento humano recombinante, HGH em 20 microgramas por grama induziu uma hiperpolarização significativa do potencial de membrana de repouso em 5 de 12 neurônios de kisspeptina AVPV/PeN e 9 de 14 neurônios de kisspeptina ARH registrados.Os neurônios hiperpolarizados AVPV/PeN kisspeptin e ARH kisspeptin alteraram significativamente o potencial de membrana de repouso em comparação com as células não responsivas. Os efeitos sobre o potencial de membrana de repouso durante a aplicação de HGH seguiram uma redução significativa da resistência de entrada de células inteiras de aproximadamente 0,9 a 0,7 gigaohms nos neurônios de kisspeptina AVPV/PeN e 1,7 a 1,0 gigaohms nos neurônios de kisspeptina ARH. Durante as linhas cerebrais perfeitas realizadas através de gigaseal cuidadoso e a coisa da área na célula através de parâmetros de praia são necessários para alcançar os melhores registros de célula inteira.A solução de micropipeta da célula gravada pode ser coletada e utilizada para RTPCR de célula única, permitindo a caracterização molecular de uma célula isolada. A técnica de patch clamp de células inteiras combinada com o uso de animais geneticamente modificados representa um avanço no entendimento da reprodução permitindo a definição de propriedades aumentadas dos neurônios kisspeptin, sendo eles os principais moduladores.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve uma técnica chamada eletrofisiologia de patch clamp de célula inteira, que é um método para estudar propriedades elétricas de neurônios de Mauthner e outras células reticuloespinhais em embriões de peixe-zebra.

Eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar as propriedades elétricas dos neurônios

O vídeo demonstra um método para estudar a excitabilidade de células neuronais que expressam proteína fluorescente usando uma pinça de corrente de contato de célula inteira. No modo de pinça de corrente, potenciais de ação indicativos de excitabilidade neuronal são gerados.

Estudando a excitabilidade de neurônios fluorescentes usando um grampo de patch de célula inteira

O vídeo demonstra um protocolo para estudar interações sinápticas e respostas neuronais em uma fatia de cérebro de hipocampo de camundongo transfectado. Envolve iluminar neurônios sensoriais de longo alcance para desencadear potenciais de ação e registrar os potenciais pós-sinápticos excitatórios resultantes no neurônio registrado usando a técnica de patch-clamp de célula inteira.

Fotoestimulação e gravações de grampo de remendo de células inteiras de neurônios em fatias de hipocampo de camundongos

Este vídeo demonstra o uso da técnica de patch-clamp de células inteiras para medir as respostas em neurônios de kisspeptina de fatias hipotalâmicas de camundongos transfectados. O processo envolve alcançar a configuração de toda a célula e registrar as alterações do potencial da membrana induzidas pelo hormônio de teste usando o modo de pinça de corrente.

Determinando um efeito de teste do hormônio do crescimento nos neurônios da kisspeptina usando um grampo de remendo de células inteiras

Este vídeo demonstra o procedimento para realizar registros eletrofisiológicos em neurônios da substância gelatinosa (SG) de fatias da medula espinhal, usando técnicas de patch-clamp de células inteiras para analisar os padrões de disparo dos neurônios. Este método permite o estudo das respostas neurais a estímulos em neurônios SG da medula espinhal.

Registro de grampo de remendo de célula inteira em um neurônio da substância gelatinosa de uma fatia da medula espinhal

O vídeo do protocolo descreve o estabelecimento de um grampo de adesivo de célula inteira para registro eletrofisiológico dos neurônios sensoriais do órgão vomeronasal (VNO) em camundongos. Uma fatia coronal de VNO com neurônios sensoriais marcados com fluorescência é colocada em uma configuração de gravação. Um neurônio marcado é temendado com uma pipeta de registro em uma configuração de célula inteira para registro eletrofisiológico em resposta a estímulos químicos.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de neurônios sensoriais vomeronasalis

Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a multiplicidade sináptica funcional usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda.

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Aprenda a técnica de patch-clamp de célula inteira para registrar correntes iônicas em neurônios kisspeptin hipotalâmicos. Este método eletrofisiológico avança a compreensão da neuroendocrinologia reprodutiva.

Neurônios Kisspeptin Hipotalâmicos como Alvo para Gravações de Patch-Clamp de Células Inteiras

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