Name: Transfecção escalável de protoplastos de mesofilo de milho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda a transfecção em larga escala de protoplastos de mesofilo de milho usando PEG. Este método de alta eficiência permite transformar milhões de células para pesquisa em biotecnologia vegetal.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 training grant no. HG000035 to J.T.) e pelo National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 to C.Q.) e pela National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 e PlantSynBio 2240888 to CQ). Agradecemos a Andrea Gallovatti, da Universidade Rutgers, pela doação das sementes de milho.

1. Crescimento do material vegetal
<ol><li>Lave os grãos de milho duas vezes com água da torneira. Mergulhe os grãos em água da torneira durante a noite à temperatura ambiente.</li>
	<li>No dia seguinte, encha uma bandeja inicial de sementes de 72 células com vermiculita 1:1 molhada:musgo de turfa. Enxágue os grãos uma vez e plante-os com tampa de ponta para baixo, um grão por célula.</li>
	<li>Crescer em condições de dias longos (16 h claro, 8 h escuro) a 25 °C durante 3 dias.</li>
	<li>Transfira para a escuridão constante a 25 °C e cresça por 9-11 dias.</li>
</ol>2. Isolamento de plasmídeos
<ol><li>Transformar E. coli comercialmente competente quimicamente com o(s) plasmídeo(s) de interesse de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Cultivar a E. coli transformada em 50 mL de meio LB líquido com antibióticos apropriados durante a noite a 37 °C com agitação.</li>
	<li>Pellet a E. coli por centrifugação por 10 min a 3.000 x g à temperatura ambiente. Extrair os plasmídeos usando um kit de isolamento de DNA plasmidial midiprep disponível comercialmente.</li>
	<li>Estimar a concentração de DNA plasmidial usando um espectrofotômetro de microvolume. NOTA: O material adequado para transfecção deve ter uma concentração de ≥800 ng/μL e um A260/A280 de ≥1.8.</li>
</ol>3. Isolamento de protoplastos
<ol><li>Preparar 20 ml de solução enzimática.<ol><li>Adicionar 2,18 g de manitol, 0,30 g de celulase R-10 e 0,06 g de macerozima R-10 a um tubo de centrífuga de 50 mL. Inverta para misturar os pós. Adicionar H2O deionizado a 15 mL. Adicionar 200 μL de 1 M MES, pH 5,7. Vórtice para misturar.</li>
		<li>Aquecer a solução a 55 °C durante 10 min. Arrefecer à temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Adicionar 20 μL de CaCl2 1 M, 0,02 g de albumina de soro bovino e 100 μL de 1 M β-mercaptoetanol.</li>
		<li>Encher até 20 mL com H2O. Deite num copo de 250 ml embrulhado em papel alumínio.</li>
	</ol></li>
	<li>Tire as mudas de milho do escuro. Corte-os alguns centímetros acima do solo usando uma nova lâmina de barbear. Coloque as pontas cortadas em água. Mantenha-os no escuro à temperatura ambiente enquanto não estiver em uso.</li>
	<li>Selecione a segunda e a terceira folhas de cada muda, tomando o cuidado de excluir folhas com áreas marrons ou danificadas. Selecione 12-16 folhas. Corte ~1 cm da ponta de cada folha e descarte. Em seguida, corte uma seção de 10 cm de cada folha. NOTA: Se for necessário mais tecido, utilize um volume adicional de 20 ml de solução enzimática num copo adicional de 250 ml. O excesso de material foliar em uma determinada quantidade de solução enzimática pode diminuir a viabilidade.</li>
	<li>Empilhe as seções foliares umas sobre as outras com as extremidades basais juntas. Aperte o feixe na extremidade basal usando um clipe aglutinante. Coloque o feixe de folhas em um pedaço de papel branco.</li>
	<li>Segure as folhas a ~1 cm da extremidade distal. Usando uma nova lâmina de barbear, corte as folhas da extremidade distal perpendicular às nervuras em fatias finas (0,5-1 mm). Evite cortar direto, mas faça fatias curtas e para frente através do tecido.<ol><li>Troque as lâminas de barbear sempre que o resíduo visível começar a ser depositado no papel. Resíduo visível indica esmagamento do tecido devido a uma lâmina opaca ou má técnica.</li>
	</ol></li>
	<li>Após o corte de ~2 cm do comprimento do feixe foliar, transfira prontamente as fatias para o copo da solução enzimática. Não deixe o material secar, pois isso reduzirá o número de protoplastos obtidos. Agite suavemente a solução enzimática para molhar o material.<ol><li>Coloque uma tampa de papel alumínio sobre o copo para bloquear a luz. Repita o processo de fatiamento e transferência até que todo o pacote seja cortado próximo ao clipe do fichário.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira o copo da solução enzimática para um frasco de sino. Infiltrado de vácuo entre −50,8 kPa e −67,7 kPa em relação à pressão ambiente por 3 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira o copo para um agitador de mesa. Agitar a 40 RPM durante 2,5 h à temperatura ambiente. Gire suavemente o copo com a mão. Quando totalmente digerida, a solução enzimática aparecerá ligeiramente leitosa. Se a solução ainda estiver clara, continue agitando a 40 RPM por até mais uma hora. Não exceda 3,5 h.</li>
	<li>Durante a digestão, faça uma solução de manitol + MES + MgCl2 (MMG), uma solução de polietilenoglicol (PEG) e uma solução de incubação.<ol><li>MMG: Adicionar 5,47 g de manitol, 200 μL de 1 M MES, pH 5,7 e 750 μL de 1 M MgCl2 a um tubo de centrífuga de 50 mL. Encher até 50 mL com H2O. Vortex destilado para dissolver. Coloque no gelo.</li>
		<li>Solução de incubação: Adicionar 5,47 g de manitol, 200 μL de 1 M MES a pH 5,7 e 200 μL de 1 M KCl a um tubo centrífugo de 50 ml. Encher até 50 mL com H2O. Vortex destilado para dissolver. Coloque no gelo.</li>
		<li>Solução de PEG: Adicionar 0,44 g de manitol, 1,0 g de PEG e 400 μL de CaCl2 1 M a um tubo de centrífuga de 15 mL. Encher até 4 mL com H2O. Vortex destilado para misturar. Incubar a 37 °C com agitação durante 30 minutos até dissolver completamente. Manter à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Agitar a solução enzimática a 80 RPM durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque o copo com a solução enzimática sobre gelo. Não remova a cobertura de papel alumínio. Adicionar 20 ml de MMG gelado à solução enzimática. Filtrar através de um filtro celular de 40 μm para um tubo de centrífuga de 50 mL. NOTA: Mantenha todas as soluções no gelo para as etapas seguintes até a adição do PEG. Mantenha os protoplastos cobertos com papel alumínio para minimizar a exposição à luz.</li>
	<li>Dividir o filtrado em volumes iguais de 10 ml cada. Despeje cada volume em um tubo de centrífuga de vidro de fundo redondo e gire para baixo por 4 minutos a 100 x g à temperatura ambiente.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante e adicionar 1 ml de MMG gelado a cada tubo. Ressuspenda os pellets girando suavemente e batendo os tubos. Combine as amostras em um único tubo de centrífuga de vidro de fundo redondo. Adicionar MMG a um volume total de 5 mL. Gire para baixo por 3 min a 100 x g à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar com 5 mL de MMG e girar para baixo por 3 min a 100 x g à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repetir a lavagem com 5 mL de MMG e girar para baixo por 3 min a 100 x g à temperatura ambiente. Depois de girar a segunda lavagem, observe se o sobrenadante está claro. Se permanecer nublado, realize uma terceira lavagem.</li>
	<li>Ressuspender os protoplastos em 1 mL de MMG. Cubra frouxamente com papel alumínio e mantenha no gelo.</li>
	<li>Determinar o rendimento de protoplastos e verificar a viabilidade.<ol><li>Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, juntar 4 μL de protoplastos e 72 μL de MMG.</li>
		<li>Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicione 1 μL de solução estoque de diacetato de fluoresceína (FDA) a 0,5% a 49 μL de MMG para fazer uma solução funcional de 20x. Adicione 4 μL de solução de trabalho FDA ao tubo com os protoplastos diluídos. Incubar durante 5 minutos no escuro à temperatura ambiente.</li>
		<li>Carregar 11 μL da mistura de protoplastos em um hemocitômetro. Coloque sob um microscópio de luz de campo claro. Confirme visualmente que as células não possuem paredes celulares. Em seguida, conte o número de protoplastos. Use esta contagem para estimar o número total de protoplastos obtidos. Em seguida, conte o número de protoplastos que fluorescem verde sob luz UV quando corados com FDA. Isolamentos bem-sucedidos de protoplastos produzem uma viabilidade de 70%-90%.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Transfecção mediada por PEG
<ol><li>Começando com a concentração estimada de protoplastos a partir do passo 3.17, ajuste para ~10.000 protoplastos/μL. Se a concentração for baixa, centrifugar por 3 min a 100 x g e ressuspender em MMG até uma concentração de ~10.000 protoplastos/μL.</li>
	<li>Misture ~1.000.000 protoplastos com 15 μg de DNA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Completar a mistura com MMG para 114,4 μL e incubar no gelo por 30 min.</li>
	<li>Ressuspenda os protoplastos batendo na lateral do tubo. Adicionar 105,6 μL de solução de PEG a 25% aos protoplastos para atingir um peso/volume final de 12% de PEG. Misture suavemente invertendo 5-10 vezes. Os protoplastos em solução de PEG são frágeis; Não agite o tubo. Incubar durante 10 minutos no escuro à temperatura ambiente. NOTA: A transfecção pode ser ampliada em múltiplos dos volumes dados nas etapas 4.2 e 4.3. Por exemplo, 10 milhões de protoplastos e 150 μg de DNA podem ser suspensos em 1.444 μL de MMG e tratados com 1.056 μL de solução de PEG em um tubo centrífugo de 50 mL.</li>
	<li>Diluir com 5 volumes de solução de incubação. Misture delicadamente por inversão. Gire para baixo por 4 min a 100 x g à temperatura ambiente. NOTA: Se aumentar a escala, divida os protoplastos em vários tubos de vidro de fundo redondo contendo no máximo 10 mL cada para garantir a peletização completa. Aumentar proporcionalmente o volume da solução de incubação utilizada para lavagem.</li>
	<li>Remova o sobrenadante por pipetagem. Lavar com 1-5 ml de solução de incubação e girar para baixo durante 3 minutos a 100 x g à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ressuspender os protoplastos na solução de incubação até uma concentração de 500-1.000 células/μL.</li>
	<li>Incubar os protoplastos no escuro durante a noite (~16 h) à temperatura ambiente.</li>
</ol>5. Recuperação de protoplastos e verificação de expressão
<ol><li>Gire os protoplastos por 4 min a 100 x g à temperatura ambiente. NOTA: Se aumentar a escala, divida os protoplastos em vários tubos de vidro de fundo redondo contendo no máximo 10 mL cada.</li>
	<li>Lavar com 1-5 ml de solução de incubação e girar para baixo durante 3 minutos a 100 x g à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ressuspenda e combine em 1-5 mL de solução de incubação.</li>
	<li>Se os protoplastos forem transfectados com um gene repórter fluorescente (por exemplo, GFP), tome uma alíquota para verificar a eficiência da transfecção. Usando um hemocitômetro, primeiro conte o número total de protoplastos usando microscopia de luz de campo claro. Em seguida, conte a fração de protoplastos fluorescentes sob luz UV.</li>
	<li>Centrifugar os protoplastos durante 3 min a 100 x g à temperatura ambiente. NOTA: Os protoplastos estão agora prontos para aplicações a jusante, tais como a extracção de ARN com fenol e isotiocianato de guanidina.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasts%3A+A+useful+research+system+for+plant+cell+biology%2C+especially+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation.</a> Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).</li>
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<li>Ren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+leaf+base+protoplast+isolation+and+transient+expression+systems+for+orchids+and+other+important+monocot+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 626015(2021).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Como relatado anteriormente, a qualidade do material vegetal utilizado para protoplastos é essencial para a obtenção de protoplastos de alta qualidade16,17,18. É crucial selecionar folhas saudáveis e imaculadas. Este trabalho utilizou a cultivar de milho de pesquisa popular B73. Não testamos outras cultivares. As mudas de milho utilizadas para este protocolo foram cultivadas no escuro, pois as folhas etioladas produzem protoplastos com maior viabilidade 16 h após a transfecção em comparação com os protoplastos de folhas verdes. Para aplicações que não requerem incubação durante a noite, o uso de material de folhas verdes ou esverdeadas seria possível.
Uma etapa crítica é cortar corretamente o material foliar em fatias finas antes da digestão enzimática. Esse processo aumenta a área superficial para que as células do mesofilo sejam expostas à solução enzimática, o que aumenta o número de protoplastos recuperados. As pontas distais das folhas são descartadas, e fatias finas (≤1 mm) são cortadas com novas lâminas de barbear, que são trocadas imediatamente quando começam a embotar. Para uma determinada quantidade de tecido, cortes mais finos produzem mais protoplastos, desde que a técnica correta seja empregada para minimizar o esmagamento das folhas.
Lavar corretamente os protoplastos também é importante, pois eles são bastante delicados após passarem pela remoção da parede celular. Após a digestão, todas as soluções são mantidas no gelo, e os protoplastos cultivados no escuro são protegidos da luz. A osmolaridade e o pH são tamponados, realizando-se as lavagens em solução de MMG. Para isolar os protoplastos dos debris celulares menos densos, a centrifugação ocorre a 100 x g. Protoplastos centrifugados a 200 x g apresentam viabilidade semelhante após o isolamento, mas menor viabilidade no dia seguinte, e transformam aproximadamente metade também. Recomenda-se verificar a viabilidade dos protolastos pela coloração com FDA (diacetato de fluoresceína) imediatamente após o isolamento; A viabilidade normal varia entre 70%-90%. Protoplastos com viabilidade inferior a 40% após o isolamento produzem poucos transformantes.

A peletização e a lavagem são mais fáceis quando se trabalha com muitos protoplastos porque um pellet claramente visível é obtido após a transfecção. Por esse motivo, a transfecção é realizada com 1 milhão ou mais de protoplastos. Ao escalar o protocolo, um recipiente de tamanho adequado deve ser selecionado para as etapas de incubação (tubo de centrífuga de 1,5 mL, 15 mL ou 50 mL), e o volume de solução usado para as etapas de lavagem deve ser dimensionado de acordo. Em qualquer caso, é benéfico centrifugar em alíquotas de ≤10 mL para garantir que os protoplastos não permaneçam no sobrenadante. Uma inovação desse protocolo é a retirada da etapa de incubação e lavagem de 1 h em solução W5 que está listada em outros protocolos14,19, que se mostrou desnecessária em nossas mãos.
Como visto em outros estudos, a quantidade e a qualidade do DNA são críticas para o sucesso da transfecção19. Para plasmídeos na faixa de 4-6 kb, são utilizados 15 μg de DNA por 1 milhão de protoplastos. Preparações de DNA de baixa qualidade podem resultar em viabilidade reduzida após a transfecção, por isso recomendamos o uso de um kit comercial de extração de DNA ao isolar plasmídeos de bactérias. A incubação dos protoplastos durante a noite é feita à temperatura ambiente no escuro para permitir a transcrição da biblioteca de plasmídeos ou plasmídeos, minimizando o estresse. Após a incubação durante a noite, aproximadamente metade do número de protoplastos originalmente transfectados é recuperado. Os protoplastos são diluídos a uma concentração de 500-1.000 células/μL para incubação noturna. Os protoplastos deixados para incubar durante a noite em concentrações superiores a 1.000 células/μL têm menores taxas de recuperação e menor viabilidade. Em concentrações mais elevadas, detritos de protoplastos danificados e mortos podem contribuir para a morte de protoplastos vizinhos. Lavar os protoplastos após a incubação durante a noite serve tanto para remover esses detritos quanto para remover o excesso de plasmídeo.
Protocolos como esses têm a limitação de que nem todas as espécies de plantas ou tipos de tecidos são passíveis de protoplastação. Além disso, diferenças na expressão gênica podem ser induzidas pelo processo de protoplastagem.
Em resumo, detalhamos um protocolo simples e escalável para isolar e transfectar milhões de protoplastos viáveis da cultura agrícola básica Z. mays. Este método pode transfectar muito mais protoplastos usando PEG, com uma eficiência de transformação quase tão alta quanto os métodos baseados em eletroporação15. O maior número líquido de transformantes permite testar centenas ou milhares de construtos em experimentos de larga escala, como ensaios de repórteres massivamente paralelos12,13. Futuros experimentos em escala genômica em milho permitirão aos cientistas entender melhor a expressão gênica e a regulação gênica do milho.

A expressão gênica transitória é uma ferramenta poderosa na biologia vegetal. No entanto, as células vegetais são difíceis de transfectar porque estão rodeadas por uma parede celular. Essa barreira à entrada do DNA não está presente em outros tipos celulares comumente estudados, como células de mamíferos ou insetos. Pesquisas anteriores abordaram esse desafio empregando protoplastos: células vegetais cujas paredes celulares foram digeridas e removidas. Ao contrário do tecido foliar não processado, os protoplastos vegetais são fáceis de trabalhar em suspensão e passíveis de técnicas de transfecção mediadas por eletroporação ou polietilenoglicol (PEG)1. As células vegetais mantêm grande parte de sua funcionalidade mesmo após a remoção da parede celular. Assim, os protoplastos são utilizados em uma variedade de plantas para estudar a função gênica e proteica2,3, entender a transdução de sinal4 e identificar possíveis alvos para o melhoramento de plantas5. Os protoplastos também são um veículo conveniente para a triagem de construções de edição do genoma em diversas espécies de culturas, incluindo trigo e batata 6,7. Em suma, ensaios transitórios em protoplastos são indispensáveis para a biotecnologia agrícola.
O milho (Zea mays L.) é a principal cultura mundial de cereais em tonelagem; como tal, é um dos principais focos de pesquisa básica e aplicada em fitotecnia8. No entanto, ao contrário de plantas-modelo como Nicotiana tabacum9, a expressão transgênica transitória em folhas intactas de milho não é realizada rotineiramente. A protoplastificação tem sido utilizada na obtenção e transfecção de células do mesofilo foliar de milho10,11. Métodos anteriores alcançaram eficiências de transfecção de até 75% usando eletroporação e produziram protoplastos transfectados na escala de dezenas de milhares10,15.
Este protocolo detalha como protoplastar milhões de células do mesofilo de milho e transfectá-las com uma eficiência comparável aos métodos anteriores. As principais etapas são o cultivo de mudas de milho etioladas, a colheita do tecido foliar, a digestão da parede celular da planta e a entrega de DNA plasmidial nas células usando PEG. A principal contribuição deste protocolo é a capacidade de aumentar a transfecção de protoplastos, mantendo a viabilidade celular necessária para ensaios funcionais. Isso permite o uso de experimentos em escala genômica, como ensaios paralelos massivos, que podem testar a função de centenas de milhares de regiões em todo o genoma do milho. Este método tem sido recentemente utilizado para investigar grandes bibliotecas de elementos do DNA cis-regulatório, incluindo potencializadores e promotores12,13,14.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga graduados de 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>490004-444</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico Falcon de 15 mL</td><td>Corning</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Béquer de vidro Pyrex de 250 mL</td><td>Fisher</td><td>50-121-5005</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de célula de malha de nylon de 40 um</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo Falcon</td><td>Corning</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>72 bandeja de propagação de células</td><td>T.O. Plastics</td><td>725607C</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>VWR</td><td>89107-732</td><td></td></tr><tr><td>Campânula</td><td>Bel-Art</td><td>F42022-0000</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-250ML</td><td>Dissolva em H2O ultrapuro para fazer uma solução estoque 1M. Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2*2H2O)</td><td>PhytoTech Labs</td><td>C135</td><td>Dissolva em H2O ultrapuro para fazer uma solução estoque 1M. Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Celulase Onozuka R-10</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C8001.0010</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M562</td><td></td></tr><tr><td>Escopo de dissecação</td><td>Reichert</td><td>Microstar IV</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato de Fluoresceína (FDA)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>F1303</td><td>Dissolva em acetona a 0,5% peso/volume para fazer uma solução estoque 1000X. Proteger da luz e armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Sistemas de Iluminação de Fluorescência</td><td>Prior</td><td>Lumen200</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Leica</td><td>MDG36</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta capacidade</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M8002.0005</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M292-1KG</td><td>Dissolver em H2O ultrapuro para fazer um estoque de 1M solução. Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Sementes de milho</td><td>B73</td><td>USDA-ARS</td><td>https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473</td></tr><tr><td>Grampo aglutinante médio</td><td>Uline</td><td>S-24649</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5287-250G</td><td>Dissolva em H2O ultrapuro para fazer uma solução estoque 1M. Ajuste o pH para 5,7 usando KOH. Proteger da luz e guardar à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Micropipeta 20-200 uL</td><td>Gilson</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop microfotômetro de microvolume</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa competente E. coli New</td><td>England BioLabs</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro Neubauer</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>No. 9 Lâmina de barbear de borda única</td><td>Excel</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>VWR</td><td>89032-104</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etileno) glicol 4.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81240-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1KG</td><td>Dissolva em H2O ultrapuro para fazer uma solução estoque 1M. Armazene em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Vermiculita de nível profissional</td><td>NK Lawn & Tubo</td> de centrífuga de vidro de fundo redondo Garden <td>G208</td><td></td></tr><tr><td>30 mL</td><td>Kimble Chase</td><td>45500-30</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de borracha para tubos de centrífuga Corex</td><td>Corning</td><td>CLS8445AO</td><td></td></tr><tr><td>musgo de turfa Sphagnum</td><td>Premier Horticulture</td><td>0128P</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubo de vácuo</td><td>VWR</td><td>76336-844</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de vácuo</td><td>Wika</td><td>4269978</td><td></td></tr></tbody></table>

transfecção escalável de protoplastos de mesofilo de milho

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

A transfecção de células do mesofilo de milho geralmente envolve a digestão das paredes celulares das plantas para criar protoplastos e, em seguida, a inserção de DNA via eletroporação ou polietilenoglicol (PEG). Métodos anteriores foram desenvolvidos para produzir dezenas de milhares de protoplastos transfectados de uma só vez. Aqui, descrevemos um método simples para isolar e transfectar milhões de protoplastos de mesofilo foliar em milho (Zea mays L .). Esse processo simplificado remove certas etapas comuns de protoplast, como a lavagem em W5. Além disso, etapas como centrifugação, transfecção mediada por PEG e incubação foram modificadas para trabalhar com um maior número de protoplastos. A capacidade de expressar grandes bibliotecas de construções de plasmídeos permite experimentos em escala genômica, como ensaios de repórteres massivamente paralelos em milho.

O tecido mais indicado para o isolamento dos protoplastos é a segunda e a terceira folhas de plântulas com 10-11 dias de idade (Figura 1). Neste trabalho, obtivemos aproximadamente 10 milhões de protoplastos de 16 cortes foliares, cada um com 10 cm de comprimento. O número de protoplastos isolados é dependente da massa do material foliar e da largura dos cortes foliares que são digeridos na solução enzimática.
Sob um microscópio de luz de campo claro, protoplastos não danificados aparecem aproximadamente esféricos, com plastídios salpicando a superfície (Figura 2A). Antes de proceder à transfecção, a viabilidade pode ser verificada pela coloração de uma pequena alíquota de protoplastos com diacetato de fluoresceína (FDA). Protoplastos corados pelo FDA que fluorescem sob luz UV são considerados viáveis (Figura 2B,C). Nem todos os protoplastos que aparecem intactos ainda são viáveis, e alguns protoplastos viáveis podem estar em processo de morte por evacuação (Figura 2C). Nessas células, o vacúolo está inchando e acabará sendo ejetado da membrana celular.
A Figura 3 mostra os protoplastos transformados com pJT01, um plasmídeo de expressão de milho de 4,3 kb derivado de CD3-911 (ABRC)15. A transfecção resulta na expressão de sGFP marcada com um sinal de localização nuclear C-terminal de c-Myc (Figura 3A). A proporção de protoplastos que expressam sGFP foi medida em múltiplos experimentos usando um hemocitômetro. A mediana da eficiência transfectiva alcançada por esse método foi de 40% após incubação noturna (n = 9, Figura 4, Tabela 1), comparável aos métodos publicadosanteriormente15. Dependendo da aplicação experimental, se a biblioteca de plasmídeos ou plasmídeos não tiver um repórter fluorescente, recomenda-se incluir um controle positivo para confirmar a transfecção.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig01.jpg"> Figura 1: Mudas representativas de milho cultivadas no escuro por 10 dias após a germinação. As setas indicam a segunda e a terceira folhas, que são mais adequadas para a protoplastagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig02.jpg"> Figura 2: Microscopia de fluorescência da viabilidade dos protoplastos após o isolamento. (A) Imagem de campo claro dos protoplastos imediatamente após o isolamento. (B) O sinal de fluorescência dos protoplastos corados pelo FDA. (C) Sobreposição de campo claro e fluorescência mostrando os protoplastos viáveis. A seta mostra um protoplasto passando por evacuação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig03.jpg"> Figura 3: Microscopia de fluorescência dos protoplastos transfectados com sGFP. (A) Imagem de campo claro dos protoplastos após a transfecção. (B) O sinal de fluorescência dos protoplastos transfectados no canal de GFP. (C) Sobreposição de campo claro e fluorescência mostrando os protoplastos transformados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64991/64991fig04.jpg"> Figura 4: Porcentagem de protoplastos mostrando fluorescência da GFP após 16 h de incubação. A eficiência da transfecção variou entre os ensaios independentes, sendo a menor em torno de 20% e a maior próxima a 50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/64991fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Julgamento</td>
			<td>Células GFP contadas</td>
			<td>Total de células contadas</td>
			<td>Porcentagem de GFP</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>104</td>
			<td>261</td>
			<td>39.8</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>148</td>
			<td>298</td>
			<td>49.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>84</td>
			<td>258</td>
			<td>32.6</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>137</td>
			<td>271</td>
			<td>50.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>127</td>
			<td>299</td>
			<td>42.5</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>107</td>
			<td>235</td>
			<td>45.5</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>83</td>
			<td>360</td>
			<td>23.1</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>134</td>
			<td>549</td>
			<td>24.4</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>61</td>
			<td>201</td>
			<td>30.3</td>
		</tr><tr><td>Significar</td>
			<td>109</td>
			<td>304</td>
			<td>36</td>
		</tr><tr><td>Desvio padrão</td>
			<td>29</td>
			<td>102</td>
			<td>10</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Eficiência representativa da transfecção de protoplastos. Dados de nove ensaios recentes de protoplasting em nosso laboratório.
Arquivo suplementar 1: arquivo de texto formatado pelo GenBank com a sequência de pJT01. Um plasmídeo de expressão de sGFP de 4,3 kb serve como controle positivo em protoplastos de milho transfectados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64991/pJT01_gfp_cmyc.gb.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo de alto rendimento para transfectar transitoriamente milhões de protoplastos de milho para testar grandes bibliotecas de plasmídeos em células do mesofilo do milho.

Transfecção escalável de protoplastos de mesofilo de milho

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

Hello.Today vamos mostrar-lhe um protocolo que protoplasta milhões de células do mesofilo de milho e as transforma em alta eficiência. As principais etapas do protocolo são, primeiramente, digerir e remover a parede celular vegetal, liberando os protoplastos, e depois transformar o protoplasto com PEG. A grande diferença entre esse protocolo e outros é a escala de transformação.A maioria dos protocolos termina com entre 1.000 e 10.000 protoplastos transformados. No entanto, nosso protocolo fornece milhões de protoplastos de milho transformados. Aqui temos mudas de milho cultivadas no escuro por nove a 11 dias pós-germinação.Corte as mudas logo acima do nível do solo e coloque na água. Mantenha as plantas no escuro quando não estiverem em uso. Selecione a segunda e a terceira folhas de cada muda, tomando o cuidado de excluir folhas com áreas marrons ou danificadas.Selecione de 12 a 16 folhas e corte um centímetro das pontas. Em seguida, corte uma seção de 10 centímetros de cada folha. Empilhar seções de folhas umas sobre as outras com as extremidades basais juntas.Aperte o feixe na extremidade basal usando um clipe aglutinante. Coloque o feixe de folhas em um pedaço de papel branco. Corte fatias de folhas com 0,5 a um milímetro de largura.É importante cortar fatias finas e consistentes. Após o corte de parte do feixe foliar, transfira as fatias para a solução enzimática. Não deixe o material secar.Agite suavemente a solução enzimática para molhar o material. Coloque papel alumínio sobre o copo para bloquear a luz. Repita esse processo até que todo o pacote seja cortado perto do clipe do fichário.Após o corte, a solução deve ficar assim. Transfira o copo da solução enzimática para um frasco de sino. Infiltrar-se a vácuo durante três minutos à temperatura ambiente.Incubar num agitador de mesa a 40 RPM à temperatura ambiente durante duas horas e meia. Após a incubação, dê um redemoinho à solução. Deve parecer leitoso, indicando uma digestão bem-sucedida.Incubar no agitador de mesa a 80 RPM à temperatura ambiente durante mais 10 minutos. Coloque o copo com solução enzimática sobre gelo. Pare a digestão adicionando um volume de MMG gelado.Filtre através de um filtro de células de 40 mícrons para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Divida a solução em alíquotas de no máximo 10 mililitros cada. Despeje em tubos de vidro de fundo redondo refrigerado.Centrifugar os tubos a 100 G durante quatro minutos. Retire o sobrenadante, certificando-se de não perturbar o pellet. Ressuspenda novamente e, em seguida, reúna amostras para lavagens subsequentes.Lave os protoplastos duas vezes com cinco mililitros de MMG. Gire cada vez a 100 G por três minutos. O pellet deve ser uma cor verde amarela bonita e brilhante.Você poderá ressuspender o pellet girando suavemente o tubo. Ressuspenda em um mililitro de MMG e dilua uma pequena alíquota de 10 a 20x para contagem. É importante ressuspender bem antes do aliqout, pois os protoplastos se acomodarão rapidamente.Coloque os protoplastos diluídos no hemocitômetro. Conte os protoplastos sob um microscópio de luz. Uma boa preparação não terá muito excesso de detritos flutuando após a lavagem.Bons protoplastos são circulares com plastídios visíveis. Use a contagem de células para calcular o número total. Essa preparação resultou em pouco mais de 10 milhões de protoplastos.Recomendamos verificar a viabilidade usando o corante diacetato de fluoresceína. Isolamentos bem-sucedidos de protoplastos produzem a viabilidade entre 70 e 90%Misture os protoplastos com seu plasmídeo de interesse. Este exemplo usa 1 milhão de protoplastos e 15 microgramas de DNA.Incubar no gelo por 30 minutos. Ressuspenda tocando na lateral do tubo. Adicionar solução de PEG para atingir uma concentração final de 12%PEG.Misture delicadamente invertendo várias vezes. Os protoplastos e a solução de PEG são frágeis, por isso não agite o tubo. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 minutos.Diluir com cinco volumes de solução de incubação e misturar suavemente por inversão. Centrifugar os tubos a 100 G durante quatro minutos. Lave uma vez com um tampão de incubação de mililitros.Tenha cuidado para não perturbar o pellet. Gire a 100 G por três minutos. Ressuspender em tampão de incubação até uma concentração de 500 a 1000 células por microlitro.Incubar no escuro durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, gire para baixo a 100 G por quatro minutos. Lave duas vezes com solução de incubação resfriada.Gire cada vez por três minutos a 100 G à temperatura ambiente. Ressuspenda e, em seguida, carregue uma pequena alíquota no hemocitômetro para a verificação final. Primeiro, conte o número total de protoplastos sob campo claro.Agora, observe a fração de protoplastos que fluorescem sob UV para verificar a transfecção. Os protoplastos estão expressando nosso repórter GFP. Agora, vamos obter algumas métricas sobre a eficiência da transfecção.Nessa preparação, obtivemos 10 milhões de protoplastos totais, dos quais transfectamos 1 milhão. No dia seguinte, recuperamos 335 mil. Desses, tivemos uma taxa de transformação de 30,3%, o que nos deixa com nosso total de cerca de 100.000 protoplastos expressando GFP.A eficiência da transfecção pode variar. Como você pode ver no gráfico, vemos rotineiramente eficiências entre 20 e 50% entre preparações repetidas. Este protocolo permite a coleta e transformação de milhões de protoplastos de mesofilo de milho.Uma das melhores partes do protocolo é sua capacidade de escalar. Ao dimensionar a quantidade de volume, bem como o número de protoplastos usados na transformação, você pode aumentar sua transformação em mais de uma ordem de magnitude do que mostramos hoje. Até o momento, nosso maior experimento de tubo único começou com 20 milhões de protoplastos e 200 microgramas de DNA, e terminou com 3,1 milhões de protoplastos transformados no dia seguinte.Esse protocolo de alto rendimento é especialmente útil quando você precisa testar muitas construções de plasmídeos diferentes, mas os colaboradores usaram esse protocolo para fins que não exigem a capacidade de aumentar a escala, como projetar circuitos de genes sintéticos e milho. Obrigado por assistir ao nosso vídeo. Esperamos ter ajudado.

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Research

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Biology

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