Name: Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a avaliar níveis de autofagia em células pancreáticas utilizando imunofluorescência LC3. Este método quantifica pontos LC3 para estudar o efeito da gemcitabina e vias moleculares no câncer pancreático.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas da Universidade de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), do Conselho Nacional de Pesquisa Científica e Tecnologia (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; e PUE 22920170100033) e da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica (PICT 2019-01664).

1. Preparação celular
<ol><li>Mergulhe as tampas redondas de 12 mm em etanol absoluto e coloque-as verticalmente nos poços de uma placa de 24 poços.</li>
	<li>Retire a tampa e exponha a placa de poço múltiplo à radiação ultravioleta por 15 min.</li>
	<li>Posicione as tampas horizontalmente e lave-as com o DMEM (Modified Eagle Medium) da Dulbecco.</li>
	<li>Semear um baixo número de passagem de células pancreáticas. O valor deve ser ajustado para se obter 50%-75% de confluência no dia da fixação16. NOTA: Recomenda-se semear 2,5 × 10 4 células PANC-1 ou 4 ×10 4 células AR42J por poço para fixar as células após 3 dias.</li>
	<li>Cultivar as células em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina em estufa a 37 °C sob atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono (CO2). NOTA: Para células PANC-1, recomenda-se incubar as células por 2 dias entre a semeadura celular e as etapas seguintes. Após esse tempo, as células podem ser transfectadas, tratadas ou fixadas. Este protocolo exemplifica o tratamento com gemcitabina em células PANC-1 não transfectadas e a diferenciação e tratamento com PP242 para células AR42J não transfectadas.</li>
</ol>2. Tratamento das células
<ol><li>Tratamento com gencitabina para células PANC-1<ol><li>Preparar uma solução de 1 μg/μL de gemcitabina em DMEM 2 dias após a semeadura. Tratar cada poço com 2,6 μL da solução de gemcitabina de 1 μg/μL para obter uma diluição final de 20 μM.</li>
		<li>Incubar as células por 24 h na incubadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciação AR42J e tratamento PP242<ol><li>Preparar uma solução de 4 μg/ml de dexametasona em DMEM.</li>
		<li>Tratar cada poço com 4,9 μL de 4 μg/mL de solução de dexametasona para obter uma diluição final de 100 nM.</li>
		<li>Incubar as células por 48 h na incubadora.</li>
		<li>Retirar o meio e tratar cada poço com 0,5 μL de 1 mM PP242 para obter uma diluição final de 1 μM.</li>
		<li>Incubar as células por 2 h na incubadora.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fixação e permeabilização das células
<ol><li>Preparar uma placa de 24 poços com metanol frio e uma placa de 6 poços com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO4, 2 mM KH2PO4). Mantenha-os no gelo.</li>
	<li>Pegue cada tampa com uma pinça, lave-a duas vezes em PBS e incube por 6 min em metanol.</li>
</ol>4. Bloqueio das células
<ol><li>Lave cada lamínula duas vezes em PBS e incube por 1 h em soro fetal bovino a 10% em PBS (solução de bloqueio). Observação : nesta etapa, o protocolo pode ser pausado. As tampas podem ser armazenadas durante a noite na geladeira na solução de bloqueio, e o protocolo pode ser continuado no dia seguinte.</li>
</ol>5. Incubar as lamínulas com o anticorpo primário
<ol><li>Prepare uma solução 1:1.000 de anti-LC3 na solução de bloqueio e mantenha-a no gelo.</li>
	<li>Coloque um pedaço de filme de vedação de laboratório sobre a tampa de vários poços.</li>
	<li>Coloque uma gota (25 μL) por lamínula de solução anti-LC3 sobre a película de vedação.</li>
	<li>Pegue cada tampa com uma pinça e coloque-a sobre a gota primária de anticorpos, tomando cuidado para que o lado celular esteja em contato com a solução.</li>
	<li>Prepare uma câmara úmida colocando um pedaço de papel úmido em uma caixa de plástico de fundo plano.</li>
	<li>Coloque a placa de vários poços na câmara de umidade, cubra-a com papel alumínio e incube durante a noite na geladeira.</li>
</ol>6. Incubar as lamínulas com o anticorpo secundário
<ol><li>Remova a placa de vários poços da câmara de umidade e coloque as lamínulas de volta na placa de vários poços.</li>
	<li>Realizar três lavagens com PBS.</li>
	<li>Preparar uma solução de anticoelho fluorescentemente marcado com uma diluição de 1:800 na solução de bloqueio e mantê-la no gelo protegido da luz.</li>
	<li>Coloque uma peça de película de vedação sobre a tampa de vários poços.</li>
	<li>Colocar uma gota (25 μL) por lamínula de solução anticoelho sobre a película de vedação.</li>
	<li>Pegue cada tampa com uma pinça e coloque-a sobre a gota primária de anticorpos, tomando cuidado para que o lado celular esteja em contato com a solução.</li>
	<li>Incubar a placa de poço múltiplo na câmara de umidade por 2 h à temperatura ambiente (TR) protegida da luz.</li>
</ol>7. Coloração das células com 4′ ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)
<ol><li>Remova a placa de vários poços da câmara de umidade e coloque as lamínulas de volta na placa de vários poços.</li>
	<li>Realizar três lavagens com PBS.</li>
	<li>Preparar uma solução de 300 nM de DAPI em PBS (protegido da luz).</li>
	<li>Incubar cada lamínula com a solução DAPI durante 10 min.</li>
	<li>Realizar três lavagens com PBS. Mantenha a placa de vários poços protegida da luz.</li>
</ol>8. Montagem
<ol><li>Prepare dois copos com água e um pedaço de papel.</li>
	<li>Colocar uma gota (10 μL) por lamínula de uma solução de aduto de poliálcool vinílico-bis(trimetilalumínio)-1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (PVA-DABCO) numa lâmina. NOTA: PVA-DABCO é preparado combinando 0,25 M DABCO, 10% P/V PVA, 20% glicerol e 50% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) em água ultrapura.</li>
	<li>Pegue cada tampa com uma pinça, lave-a em cada copo de água, seque-a no papel e coloque-a sobre a gota de PVA-DABCO (com as células em contato com a solução).</li>
	<li>Deixe secar durante a noite, protegido da luz.</li>
</ol>9. Visualização em microscopia confocal e captura de imagens
<ol><li>Visualize as lamínulas em um microscópio confocal invertido usando uma objetiva de cerca de 63x17.</li>
	<li>Capture imagens representativas das células marcadas.</li>
</ol>10. Quantificação dos pontos da CL3
<ol><li>Arraste e solte cada arquivo de imagem contendo os canais capturados, como ".czi", na tela do ImageJ (FIJI) para abrir. Clique em Ok na caixa de diálogo e feche a janela Console .</li>
	<li>Na guia Imagem , selecione Cor &gt; Canais divididos.</li>
	<li>Feche as imagens correspondentes aos canais diferentes da imagem LC3.</li>
	<li>Na guia Imagem , selecione Ajustar &gt; Equilíbrio de Cores</li>
	<li>Mova o controle deslizante Máximo para a esquerda até que a imagem esteja saturada para visualizar os contornos da célula.</li>
	<li>Desenhe o contorno da célula com a ferramenta Seleção à mão livre .</li>
	<li>Clique no botão Redefinir para redefinir o ajuste de cor.</li>
	<li>Na guia Editar , selecione Recortar para cortar o item selecionado.</li>
	<li>Feche a imagem sem salvá-la.</li>
	<li>Na guia Editar , selecione Colar.</li>
	<li>No menu Analisar , escolha a ferramenta Contador de objetos 3D.</li>
	<li>Defina o limite. No exemplo fornecido neste estudo, o limite é definido em 2.000.</li>
	<li>Defina o filtro de tamanho. Neste estudo, situa-se entre 50 e 500.</li>
	<li>Certifique-se de que as caixas Objetos e Resumo estejam marcadas.</li>
	<li>Clique em Ok. O número de pontos será descrito como Objetos Detectados no Resumo.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65005/65005fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático do protocolo de imunofluorescência da CL3. Diagrama esquemático que representa o protocolo geral fornecido para a imunofluorescência da CL3. Figura criada com BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65005/65005fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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<li>Grasso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+selective+autophagy+pathway+mediated+by+VMP1-USP9x-p62%2C+prevents+pancreatic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).</li>
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</ol>

Não foram declarados conflitos de interesse.

O método descrito neste protocolo permite visualizar a distribuição endógena da CL3 na célula e quantificar os níveis autofágicos sob diferentes condições. Outro método semelhante utilizado para analisar a distribuição da CL3 e determinar a ativação da autofagia envolve a transfecção de LC3 marcada com fluorescência (como RFP-LC3)19. A transfecção RFP-LC3 tem as vantagens de não necessitar de fixação (o que permite a aplicação deste método em imagens de célulasvivas20), ser...

A macroautofagia (comumente referida como autofagia) é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas 1,2. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular3. Durante a autofagia, uma dupla vesícula de membrana é formada: o autofagossomo. O autofagossomo contém as moléculas de carga e as conduz ao lisossomo para degradação 1,4.
Os autofagossomos são decorados pela proteína autofágica associada à proteína microtubular de cadeia leve 3 (CL3)5. Quando a autofagia não é induzida, a CL3 é difundida no citoplasma e no núcleo na conformação da LC3-I. Por outro lado, quando a autofagia é induzida, a CL3 é conjugada com uma fosfatidiletanolamina na membrana das estruturas autofágicas6. Essa nova conformação da LC3 é conhecida como LC3-II1. O desvio de conformação da CL3 provoca alterações em sua localização celular e sua migração por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE), que pode ser detectada por técnicas como imunofluorescência e western blot 5,7. Dessa forma, a conjugação da CL3 é um evento chave no processo autofágico que pode ser usado para medir a atividade autofágica.
A célula acinar pancreática é uma célula altamente diferenciada que, em condições saudáveis, apresenta baixa taxa de autofagia. Entretanto, em diferentes condições fisiológicas ou sob estimulação farmacológica, podem ativar a autofagia. Portanto, a determinação dos níveis autofágicos nessa linhagem celular é útil para estudar os potenciais efeitos diretos ou indiretos de diferentes agentes farmacológicos ou biológicos sobre aautofagia8,9.
O adenocarcinoma ductal de pâncreas é um dos tipos de câncer mais letais, dado seu diagnóstico tardio e sua alta resistência àquimioterapia10. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional de proteínas relacionadas à autofagia11. As células do câncer de pâncreas podem ajustar seus níveis de autofagia em resposta a condições desfavoráveis como hipóxia, privação de nutrientes ou dano induzido por quimioterapia11. Assim, analisar os níveis de autofagia em células de câncer de pâncreas pode ajudar a entender como elas se adaptam a diferentes ambientes e avaliar a eficácia de tratamentos moduladores da autofagia.
Este estudo mostra um método para realizar a imunofluorescência CL3 em dois modelos celulares pancreáticos distintos. O primeiro modelo, células PANC-1, serviu de modelo para adenocarcinoma ductal pancreático. Essas células foram tratadas com gemcitabina, um agente quimioterápico que já demonstrou induzir autofagia, especificamente em células de câncer de pâncreas portadoras do gene oncogênico Kirsten rat sarcoma virus (KRAS)12,13. O segundo modelo, células AR42J, serviu como um modelo mais fisiológico de células pancreáticas exócrinas. Essas células foram diferenciadas com dexametasona para se tornarem mais semelhantes às células pancreáticas acinares14. Nessas células, a autofagia foi induzida farmacologicamente pelo uso da PP242, que é um potente inibidor da mTOR15. Neste estudo, demonstramos a aplicabilidade do protocolo descrito com dois modelos pancreáticos diferentes e sua capacidade de discriminar estados de baixa e alta autofagia.

<table><tbody><tr><td>10x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 mm lamínulas redondas</td><td>HDA</td><td>CBR_OBJ_6467</td><td></td></tr><tr><td>24 Well- Placa de cultura de células</td><td>Sorfa</td><td>220300</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Biopack</td><td>2207.10.00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 IgG anti-coelho de burro (H + L)</td> <td>Invitrogen</td><td>R37119</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Varredura a Laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEN</td><td>Sartorius</td><td>01-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal</td><td>Bovino NATOCOR&nbsp;</td><td>Lintc-634</td><td></td></tr><tr><td>Gemcitabina</td><td>Eli Lilly</td><td>VL7502</td><td></td></tr><tr><td>LC3B (D11) XP Tecnologia</td><td>de Sinalização de Células</td> mAb de Coelho <td>3868S</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Anedra</td><td>6197</td><td></td></tr><tr><td>Parafilme "M" (Filme de Vedação de Laboratório)</td> <td>Bemis/Curwood</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Solução Pen-Strep</td><td>Sartorius</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PP242</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>SC-301606</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Gibco</td><td>11570626</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação dos níveis de autofagia em dois diferentes modelos de células pancreáticas utilizando imunofluorescência lc3

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

A autofagia é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular. As células cancerosas podem modular seus níveis de autofagia para se adaptar a condições adversas como hipóxia, deficiência de nutrientes ou danos causados pela quimioterapia. O adenocarcinoma ductal do pâncreas é um dos tipos mais mortais de câncer. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional das proteínas autofágicas.
Aqui, a linhagem celular PANC-1 foi usada como modelo de células cancerosas humanas pancreáticas, e a linhagem celular acinar pancreática AR42J foi usada como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudo utilizou a imunofluorescência da proteína de cadeia leve 3 associada a microtúbulos (CL3) como um indicador do estado de ativação da autofagia. A LC3 é uma proteína autofágica que, em condições basais, apresenta um padrão difuso de distribuição no citoplasma (conhecido como CL3-I nessa condição). A indução da autofagia desencadeia a conjugação da LC3 à fosfatidiletanolamina na superfície dos autofagossomos recém-formados para formar a LC3-II, uma proteína ligada à membrana que auxilia na formação e expansão dos autofagossomos. Para quantificar o número de estruturas autofágicas marcadas, utilizou-se o software de código aberto FIJI com o auxílio da ferramenta "3D Objects Counter".
A medida dos níveis autofágicos tanto em condições fisiológicas quanto em células cancerosas permite estudar a modulação da autofagia sob diversas condições, como hipóxia, tratamento quimioterápico ou knockdown de certas proteínas.

Este protocolo realiza a imunofluorescência da CL3 em linhagens celulares pancreáticas para determinar os níveis de autofagia em diferentes condições. O resultado deste experimento foi a obtenção de imagens celulares dos canais vermelho e azul, correspondentes a CL3 e DAPI. As imagens de CL3 indicam a distribuição celular dessa proteína, enquanto o DAPI mostra a localização nuclear. A Figura 2A mostra uma imagem representativa da imunofluorescência da CL3 e sua fusão com a coloração DAPI em ...

O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.

Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

A imunofluorescência da CL3 permite a determinação dos níveis de autofagia nas células pancreáticas. Permite o estudo dos potenciais efeitos de diferentes agentes sobre a autofagia das células pancreáticas. A imunofluorescência é uma técnica utilizada para detectar a proteína LC3 endógena, que evita problemas causados pela superexpressão da CL3, como a formação de agregados proteicos não relacionados à autofagia.Quem demonstrará o procedimento serão Felipe Renna, doutorando, e Malena Herrera Lopez, doutoranda do laboratório de Maria Inês Vaccaro. Para iniciar a preparação celular, mergulhe a tampa redonda de 12 milímetros em etanol absoluto. Depois de remover a tampa, coloque a tampa embebida verticalmente na placa de 24 poços.Expor a placa multipoço à radiação ultravioleta por 15 minutos. Em seguida, posicione a tampa na horizontal e lave-a com DMEM. Agora veja o baixo número de passagem de células pancreáticas, ressuspensas em DMEM, contendo 10% FBS, penicilina e estreptomicina, e incube as células por dois dias.Dois dias após a semeadura celular, preparar solução de gemcitabina em DMEM na concentração de um micrograma por microlitro. Em seguida, aspirar metade do volume de cada

evaluating-autophagy-levels-two-different-pancreatic-cell-models

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Autophagy é um processo ubíquo que permite que as células para se degradarem e reciclar proteínas e organelas. Aplicamos microscopia de fluorescência para visualizar avançada e quantificar o pequeno, mas, alterações físicas essenciais associados com a indução de autofagia, incluindo a formação e distribuição de autofagossomas e lisossomas, e sua fusão em autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Apresentados aqui são duas técnicas de pesquisa de interação da proteína-proteína baseada em anticorpos: imunofluorescência e imunoprecipitação. Estas técnicas são apropriadas para estudar interações físicas entre proteínas para a descoberta de novos componentes das vias de sinalização celulares e dinâmica de compreensão da proteína.<br...

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

Este protocolo descreve dois métodos para a análise quantitativa da mitofagia em células β pancreáticas: primeiro, uma combinação de corantes específicos para mitocôndrias permeáveis a células e, segundo, um repórter de mitofagia codificado geneticamente. Essas duas técnicas são complementares e podem ser empregadas com base em necessidades específicas, permitindo flexibilidade e precisão na abordagem quantitativa do controle de qualidade mitocondrial.

Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

Aqui, apresentamos a metodologia para avaliar de forma concisa os níveis de LC3-II do marcador autofagossomo em vesículas extracelulares (EVs) por immunoblotting. A análise dos níveis de LC3-II em EVs, formação de autolisossomos e formação de ômegassomos sugere o novo papel de STX6 na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Microscopia multifotônica permite o controle de fótons de baixa energia com penetração profunda e fototoxicidade óptica reduzida. Descrevemos a utilização desta tecnologia para a rotulagem de células vivas em embriões de peixe-zebra. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para foto-indução de várias moléculas sensíveis à luz.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Aprenda a avaliar níveis de autofagia em células pancreáticas utilizando imunofluorescência LC3. Este método quantifica pontos LC3 para estudar o efeito da gemcitabina e vias moleculares no câncer pancreático.

Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

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