Name: Análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a analisar calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo com aortas de camundongos. Este método permite investigar mecanismos moleculares e desenvolver abordagens terapêuticas para doenças cardiovasculares.

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Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (1R01HL160740 e 5 T32GM132054-04) e da Fundação de Pesquisa do Coração da Flórida. Gostaríamos de agradecer a Kassandra Gomez por sua ajuda na síntese e imagem dos hidrogéis.

O trabalho in vivo foi aprovado e supervisionado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Internacional da Flórida e em conformidade com as diretrizes atuais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Para este protocolo, o procedimento não difere dependendo da tensão, peso, idade e sexo do rato. O tipo de calcificação que está sendo estudada, dietas e tratamentos podem alterar a duração do estudo e o peso do camundongo usado e podem ser dependentes de uma cepa específica e do sexo do camundongo usado no estudo. Para este protocolo, foram utilizados camundongos C57BL/6J machos e fêmeas, que foram alimentados com uma dieta de calcificação. Os ratos foram sacrificados entre 20 semanas e 24 semanas de idade.
1. Isolamento e excisão da aorta
<ol><li>Marcadores fluorescentes<ol><li>Quarenta e oito horas antes da eutanásia, injetar os ratos com 20 μM OsteoSense 680, um agente de imagem fluorescente, na dose recomendada de 100 μL por 25 g através de uma injeção intravenosa.</li>
		<li>Sob o exaustor, coloque uma placa de isopor com quatro pinos-t, um balde forrado com uma toalha de papel, um tubo de 50 mL recheado com uma toalha de papel, um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, ferramentas de dissecação (consulte a Tabela de Materiais) e etanol em um frasco de spray. Coloque copos com PBS no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de sangue<ol><li>Adicione 2 mL de isoflurano em um tubo cônico de 50 mL recheado com o papel toalha. Coloque o tubo no balde e feche-o com a tampa. CUIDADO: O isoflurano deve ser manuseado em um espaço bem ventilado sem recirculação do ar de exaustão devido à toxicidade da exposição a curto prazo.</li>
		<li>Transfira um mouse para o bucket de cada vez. Uma vez sedado, coloque o rato sobre o papel toalha na posição dorsal. Segurando o mouse com a palma da mão não dominante, coloque as orelhas para trás usando o polegar e o dedo indicador.</li>
		<li>Usando a pinça, extirpe um dos olhos. Segure o rato acima do tubo de 1,5 ml para iniciar a colheita de sangue, durante o qual 1 ml de sangue deve ser recolhido. Quando o sangue parar de escorrer, coloque o rato de volta no balde para uma sedação adicional.</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanásia<ol><li>Coloque uma toalha de papel no tapete de dissecação. Uma vez que o rato esteja sedado, coloque-o no tapete em posição supina. Prenda o rato na posição supina usando um pino t para segurar cada membro.</li>
		<li>Pulverize o abdômen do rato com álcool. Usando a pinça, levante a pele na região do peito. Com a tesoura, corte a linha medial na cavidade torácica. Uma vez que o esterno tenha sido cortado no centro, corte o diafragma em ambos os lados da caixa torácica.</li>
		<li>Se necessário, corte a porção frontal da caixa torácica para expor o coração e os pulmões.</li>
	</ol></li>
	<li>Remoção de órgãos<ol><li>Usando pinças, levante a pele e faça uma incisão na linha média. Remova qualquer excesso de pele ou gordura. Remova os órgãos reprodutivos e a bexiga, bem como qualquer gordura fora da linha média.</li>
		<li>Mova os órgãos gastrointestinais (GI) para o lado direito e siga os intestinos na linha média. Uma vez encontrado, levante a linha média e excise o trato gastrointestinal até o estômago.</li>
		<li>Excise os rins, levantando-os para longe da linha média. Corte o mais próximo possível do rim.</li>
		<li>Em seguida, comece a remoção do fígado, levantando os lóbulos e cortando a linha média.</li>
		<li>Perfundir o coração e a aorta. Usando uma seringa de 10 mL, injete PBS frio no ventrículo direito. Espere os pulmões inflarem e ficarem brancos. Remova os pulmões, bem como qualquer excesso de diafragma ou caixa torácica.</li>
	</ol></li>
	<li>Remoção óssea<ol><li>Abra uma tesoura larga e coloque-a na região inferior do mouse acima da cauda. Corte para baixo e comece a levantar a coluna da pele. Remova a gordura dos lados da linha média. Uma vez que a pele é destacada, excise a coluna vertebral e os órgãos intactos, cortando logo acima do coração. Se estiver transportando para um estereoscópio, coloque a coluna vertebral e os órgãos intactos em um copo de PBS no balde de gelo.</li>
		<li>Mova a coluna vertebral e os órgãos para o prato de dissecação. Encha com PBS gelado. Prenda a coluna vertebral e a caixa torácica usando agulhas.</li>
		<li>Sob o microscópio de dissecção, use pinças para levantar o coração com cuidado e comece a cortar acima da coluna vertebral e abaixo da aorta. Continue até que o fundo da coluna vertebral seja atingido. Remova a coluna vertebral do prato dissecante e fixe o coração e qualquer gordura ou músculo estranho.</li>
	</ol></li>
	<li>Microdissecção<ol><li>A partir da área logo abaixo do coração, identifique as três estruturas tubulares: esôfago, veia cava e aorta. Remova o esôfago e a veia cava para ter um campo visual claro da aorta.</li>
		<li>Usando a pinça de microdissecção e a tesoura, comece a levantar o tecido adiposo e corte o mais próximo possível da aorta. Certifique-se de não cortar a aorta. Continue isso pela linha medial até que toda a aorta, bem como as artérias femorais estejam expostas.</li>
		<li>No coração, remova todo o tecido adiposo, expondo os três ramos no arco aórtico. Remova a raiz aórtica do ventrículo esquerdo inserindo a tesoura de microdissecção no ventrículo esquerdo e cortando o músculo ao redor da aorta.</li>
		<li>Uma vez que a aorta é isolada e limpa, a imagem da aorta usando um scanner infravermelho próximo para visualizar a calcificação vascular.</li>
		<li>Use o script MATLAB personalizado (Arquivo Suplementar 1) para quantificar o sinal total do marcador de cálcio, que é normalizado para a área total da aorta digitalizada. O script MATLAB funciona usando o suplemento Bioinformática toolbox. O MATLAB é primeiro direcionado para o local dos arquivos TIFF a partir da varredura de infravermelho próximo dos aortas, os arquivos individuais são abertos e os valores de intensidade de pixel são extraídos dos arquivos TIFF.<ol><li>Uma vez que a imagem é apresentada ao usuário com um mapa de cores, selecione a aorta com a maior calcificação como a escala máxima.</li>
			<li>Quando o MATLAB perguntar "Quantos espécimes estão na imagem?" na janela de comando, insira o número de aortas na imagem atual e selecione cada aorta uma a uma. Uma vez que uma aorta é selecionada, o MATLAB criará uma imagem binária com uma máscara da área total da aorta e outra imagem binária com uma máscara da área calcificada da aorta. Os valores dessas imagens mascaradas são então usados para determinar a área total calcificada, a área total da aorta, a porcentagem de área positiva para calcificação e a intensidade média da área calcificada.</li>
			<li>Para selecionar uma aorta, faça uma caixa ao redor da aorta de interesse na figura mais recente na tela, selecionando quatro cantos com um clique esquerdo e criando uma caixa ao redor da imagem. Para fechar a caixa, clique duas vezes no primeiro canto. NOTA: O limiar pode ser diferente dependendo do modelo de calcificação utilizado. Cabe ao usuário determinar qual valor determina um sinal positivo para a calcificação vascular. Uma vez que o limite é definido para um experimento, ele deve permanecer o mesmo durante toda a duração do experimento.</li>
		</ol></li>
		<li>Uma vez extraídos os dados quantitativos, realize-se uma ANOVA one-way com o teste post-hoc de Tukey para mostrar significância entre os grupos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolar e extrair EVs das aortas
NOTA: Uma vez que as aortas tenham sido isoladas e removidas, os EVs podem ser extraídos do tecido. Usando uma solução digestiva e múltiplos ciclos de centrífuga, os EVs podem ser coletados e utilizados para muitas técnicas diferentes, incluindo ensaios de calcificação, eletroforese em gel e immunoblotting13. O protocolo para isolar e extrair EVs é o seguinte:
<ol><li>Imediatamente após a varredura das aortas, agrupe duas a três aortas para produzir uma concentração suficiente de proteína.</li>
	<li>Preparar uma solução digestiva contendo 0,25 M de sacarose, 0,12 M de cloreto de sódio (NaCl), 0,01 M de cloreto de potássio (KCl), 0,02 M de cloridrato de Tris e 600 U/mL de colagenase13.</li>
	<li>Incubar duas a três aortas agrupadas em 1,5 mL de solução digestiva por 2 h a 37 °C. Colete a solução. Centrifugar a solução a 1.000 × g durante 15 minutos para remover os detritos celulares.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante por mais 30 min a 33.000 × g para remover microvesículas. Recolher e avaliar o sobrenadante para o potencial de calcificação (ver secção 3). NOTA: Siga os passos subsequentes se a eletroforese em gel e a imunoblotting proteica dos EVs devem ser realizadas.</li>
	<li>Ultracentrífuga do sobrenadante a 100.000 × g por 1 h para isolar os EVs de interesse.</li>
	<li>Enquanto o sobrenadante estiver em fase de ultracentrifugação, prepare a lise do RIPA e o tampão de extração (consulte a Tabela de Materiais) adicionando o inibidor da protease e o vórtice até dissolver.</li>
	<li>Uma vez que a ultracentrifugação esteja completa, aspirar o sobrenadante, deixando o pellet, que contém os EVs. Suspender o pellet na mistura preparada de lise RIPA e inibidor de protease. As amostras estão prontas para eletroforese em gel e western blotting.</li>
</ol>3. Avaliação do potencial de calcificação de vesículas extracelulares com absorbância de dispersão de luz
NOTA: Para medir a formação mineral em tempo real de EVs, utilizamos um ensaio originalmente desenvolvido para estudar a formação mineral a partir de EVs de cartilagem de placa de crescimento a partir de cultura celular14. Como a deposição de fosfato de cálcio é a marca registrada da calcificação, um aumento na absorvância de dispersão de luz como resultado da formação de compostos de fosfato de cálcio é indicativo do potencial de calcificação14. In vitro Os modelos VSMC são convenientes para medir o potencial de calcificação dos VEs. Nesta técnica, um leitor de placas com um filtro de comprimento de onda curto pode quantificar a calcificação in vitro de EVs. A leitura da absorvência é registrada a 340 nm, e uma maior absorvância é indicativa de mais formação mineral de fosfato de cálcio. O protocolo para o ensaio de absorbância de dispersão de luz é o seguinte:
<ol><li>Centrifugar o meio condicionado coletado de VSMCs a 1.000 × g por 5 min para remover detritos celulares14.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante a 33.000 × g por 30 min, coletar o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo. NOTA: A presença de EVs no sobrenadante coletado pode ser confirmada através de espalhamento dinâmico de luz (DLS) ou análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)</li>
	<li>Preparar uma solução estéril de fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4) a 300 mM. Filtre a solução para garantir condições estéreis, se necessário.</li>
	<li>Adicione 1% (v/v) de 300 mM de NaH2PO4 às amostras de EV e pipete suavemente a solução para misturar bem. Transferir 200 μL da solução de mistura para uma placa de 96 poços. Incubar a placa de 96 poços no leitor de microplacas a 37 °C.</li>
	<li>Ajuste o leitor de placas para registrar a absorvância em um comprimento de onda de 340 nm a cada 1 min.</li>
</ol>4. Avaliação da formação mineral de calcificação de vesículas extracelulares com hidrogéis de colágeno
NOTA: A agregação de EVs e a formação de microcalcificações são observadas através de hidrogéis de colágeno. Esses hidrogéis atuam como um andaime que imita a densidade de colágeno observada in vivo15. Isso demonstra o efeito do colágeno no crescimento da calcificação. O protocolo para avaliar a formação mineral de EVs em hidrogéis é o seguinte:
<ol><li>Dia 1<ol><li>Preparar uma solução de colagénio de 2,5 mg/ml em DMEM. Adicione lentamente hidróxido de sódio 5 M à mistura de colagénio/DMEM até que a cor mude para vermelho. Verifique se o pH da solução é de aproximadamente 7. Observação : se a solução ficar roxa e se tornar muito básica, reinicie o processo.</li>
		<li>Pipetar 300 μL da solução de colagénio de 2,5 mg/ml com um pH de 7 para cada poço de um vidro de câmara de 8 poços. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 de humidade controlada durante 72 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 4<ol><li>Adicione 300 μL de DMEM como controle nos poços.</li>
		<li>Adicionar 300 μL das amostras médias EV coletadas previamente aos poços restantes.</li>
		<li>Incubar a 37 °C e 5% de CO2 de humidade controlada durante 6 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 10<ol><li>Preparar 2,5 μL de Osteosense 680EX com 22,5 μL de DMEM.</li>
		<li>Pipeta de 2,5 μL da mistura de Osteosense e DMEM em cada poço. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 de humidade controlada durante 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 11<ol><li>Imagem dos hidrogéis com filtros apropriados para fluorescência Osteosense. Imagine-os através da parte inferior de uma câmara de vidro de cobertura usando um microscópio invertido ou do topo com uma objetiva de longa distância de trabalho.</li>
		<li>Avalie o número de calcificações e o tamanho da calcificação nas imagens coletadas usando as opções de Análise de Partículas disponíveis no ImageJ.<ol><li>Use a imagem | Ajustar | Comando de limiar para binariz as imagens de tal forma que apenas o sinal Osteosense apareça branco. Use o botão Analisar | Analise o comando de partículas para obter informações para cada calcificação na imagem. Certifique-se de usar os mesmos parâmetros de limite para cada imagem analisada quanto à consistência.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+mediators+of+cardiovascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78(2017).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Ao executar o protocolo, é importante observar as etapas críticas para a obtenção de resultados bem-sucedidos. Durante o isolamento da aorta murina, é vital que a perfusão seja realizada adequadamente. Ao injetar o PBS, deve-se tomar cuidado para não perfurar o ventrículo direito. Isso faria com que o líquido vazasse diretamente para fora do ventrículo e não circulasse pelos pulmões, deixando sangue dentro da aorta. Uma vez que a perfusão tenha sido conduzida adequadamente e a microdissecção tenha começado, todo o tecido...

A calcificação é o preditor mais significativo de mortalidade e morbidade por doenças cardiovasculares1. A calcificação altera a mecânica da parede arterial devido ao acúmulo de minerais cálcio e fosfato2. Na aterosclerose, a calcificação pode exacerbar o estresse local e resultar em ruptura da placa, que é a principal causa de ataques cardíacos. A calcificação medial, muitas vezes decorrente de doença renal crônica, é mais difundida e leva a enrijecimento arterial significativo, disfunção e sobrecarga cardíaca 2,3. Atualmente, não existem opções terapêuticas para o tratamento ou prevenção da calcificação vascular.
As células musculares lisas vasculares (CMVS) adotam um fenótipo semelhante ao osteoblasto e liberam vesículas extracelulares calcificantes (EVs) que nucleam minerais nascentes, impulsionando a calcificação 4,5,6. Esse processo se assemelha à mineralização fisiológica dos osteoblastos no osso7. Embora o desfecho da mineralização seja semelhante na parede vascular e na matriz óssea, os mecanismos pelos quais os EVs calcificantes se originam diferem nos dois tecidos8. Existem muitos tipos de modelos que são usados para estudar a calcificação vascular. In vitro, os modelos de cultura celular imitam a transição osteogênica dos VSMCs e a subsequente formação mineral com meios especializados.
Ao estudar a calcificação in vivo, o modelo utilizado depende do tipo de calcificação que está sendo estudada. Modelos hiperlipidêmicos de camundongos são frequentemente utilizados para estudar a calcificação aterosclerótica, que parece mais focal dentro de placas ricas em lipídios9. Em contraste, a calcificação medial é mais difundida em toda a vasculatura e é frequentemente estudada usando modelos de doença renal crônica que empregam um regime de dieta rica em adenina para induzir insuficiência renal ou técnicas cirúrgicas para remover porções significativas dos rins10,11. Modelos agressivos de calcificação vascular têm utilizado uma combinação de modelos de doença renal hiperlipidêmica e crônica12. Este protocolo fornece um método para avaliar a calcificação vascular em aortas murinas para calcificação medial e aterosclerótica, extrair EVs da parede aórtica e observar o potencial de mineralização nos EVs obtidos a partir de modelos de cultura celular in vitro. Estudos futuros podem utilizar esses procedimentos em análises mecanicistas de calcificação vascular e para avaliar potenciais intervenções terapêuticas.

<table><tbody><tr><td>Tampa de vidro com câmara de 8 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409PK</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>20 G Agulha de 1 polegada</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno, Alta Concentração,</td><td>Corning</td><td>de Cauda de</td> Rato 354249 <td></td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Pinça Curva Bioquímica LS004174</td><td></td><td></td>Curva</tr><tr><td>Worthington</td><td>Prato de Dissecção de Instrumentos Cirúrgicos Roboz</td><td>RS-8254</td><td></td></tr> Sistemas <tr><td>de</td><td>Audição Bandeja</td> de Dissecção <td>DD-90-S</td><td></td></tr> e <tr><td>Cera</td><td>United Scientific Supplies</td><td>DSPA01-W</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cytiva</td><td>SH30022. </td><td></td>FS</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey</td><td>LI-COR</td><td>DLx</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Curvada Micro Dissecante (Lâmina de 24 mm)&nbsp;</td><td>Instrumento Cirúrgico Roboz</td><td>RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Micro Dissecante (Lâmina de 13 mm)</td><td>Instrumento Cirúrgico Roboz</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Micro Dissecante (Lâmina de 5 mm)</td>Pinça Micro Dissecadora <td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>(Ponta de 0,10 x 0,06 mm)</td><td>Instrumento Cirúrgico Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>B11229</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680EX</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Protease</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Fischer Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lise e Tampão de Extração</td><td>G Biosciences</td><td>786-489</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fischer Chemical</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Thermo Scientific</td><td>A4782602</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Leitor multimodo</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos, 96 poços</td><td>Thermo Fisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins</td><td>United Scientific Supplies</td><td>TPIN02-PK/100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>Fischer Chemical</td><td>BP153</td><td></td></tr></tbody></table>

análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

A doença cardiovascular é a principal causa de morte no mundo, e a calcificação vascular é o preditor mais significativo de eventos cardiovasculares; no entanto, atualmente não existem opções terapêuticas ou de tratamento para a calcificação vascular. A calcificação começa dentro de vesículas extracelulares especializadas (EVs), que servem como focos de nucleação pela agregação de íons cálcio e fosfato. Este protocolo descreve métodos para obtenção e avaliação da calcificação em aortas murinas e análise dos EVs extraídos associados. Primeiro, a dissecção macroscópica do rato é realizada para coletar quaisquer órgãos relevantes, como os rins, fígado e pulmões. Em seguida, a aorta murina é isolada e excisada da raiz aórtica para a artéria femoral. Duas a três aortas são então agrupadas e incubadas em uma solução digestiva antes de serem submetidas à ultracentrifugação para isolar os EVs de interesse. Em seguida, o potencial de mineralização dos EVs é determinado através da incubação em uma solução de alto teor de fosfato e medindo a absorvância da luz a um comprimento de onda de 340 nm. Finalmente, os hidrogéis de colágeno são usados para observar a formação mineral calcificada e a maturação produzida pelos EVs in vitro.

Uma vez extraídas as aortas, a imagem por meio de um scanner óptico infravermelho próximo mostra uma representação visual da aorta, bem como da calcificação vascular (Figura 1). Os valores de intensidade de pixel dentro da imagem fluorescente digitalizada representam a distribuição da calcificação e são mostrados aqui usando um mapa de calor colorido. Os métodos de quantificação incluem identificar um limiar positivo e relatar a área percentual da aorta com valores maiores que esse valor lim...

Este trabalho apresenta a metodologia para obtenção e avaliação da calcificação vascular pelo isolamento de aortas murinas seguidas da extração de vesículas extracelulares calcificadas para observação do potencial de mineralização.

Análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Este protocolo fornece um método que pode ser usado para ajudar a avaliar e, no futuro, ajudar a desenvolver tratamentos para a calcificação vascular, que é o preditor mais significativo de doença cardiovascular. A capacidade de isolar EVs nos permite estudar mais profundamente os mecanismos que levam à calcificação vascular e à mudança fenotípica das células musculares lisas vasculares. Esta técnica fornece informações sobre os mecanismos moleculares iniciais da calcificação mediada por células musculares lisas vasculares.Entender isso permite que as opções terapêuticas sejam estudadas para o mecanismo compreendido. Quaisquer EVs de interesse podem ser estudados usando este método. Não é exclusivo das células musculares lisas vasculares, osteoblastos ou calcificação vascular.Depois de eutanasiar o rato, levante a pele usando uma pinça e faça uma incisão na linha média. Remova qualquer excesso de pele ou gordura. Em seguida, remova os órgãos reprodutivos, bexiga e gordura fora da linha média.Em seguida, mova os órgãos gastrointestinais para o lado direito e siga os intestinos na linha média. Uma vez encontrado, levante a linha média e excise o trato gastrointestinal até o estômago. Excise os rins, levantando-os para longe da linha média.Corte o mais próximo possível do rim. Remova o fígado levantando os lóbulos e cortando a linha média. Em seguida, perfundir o coração e a aorta injetando PBS frio no ventrículo direito usando uma seringa de 10 mililitros.Espere os pulmões inflarem e fique branco. Remova os pulmões e qualquer excesso de diafragma, ou caixa torácica. Para remover o osso, abra uma tesoura e coloque-a na região inferior do mouse acima da cauda.Corte para baixo, levante a coluna da pele e remova a gordura dos lados da linha média. Uma vez que a pele é destacada, excise a coluna vertebral e os órgãos intactos, cortando logo acima do coração. Coloque a coluna vertebral e os órgãos intactos em um copo de PBS no balde de gelo se transportar para um estereoscópio.Depois de mover a coluna vertebral e os órgãos para o prato de dissecação, preencha-o com PBS gelado e prenda a coluna vertebral e a caixa torácica usando agulhas. Sob o microscópio de dissecção, levante o coração cuidadosamente usando uma pinça e comece a cortar acima da coluna vertebral e abaixo da aorta. Continue até que o fundo da coluna vertebral seja atingido.Remova a coluna vertebral do prato dissecante e fixe o coração e qualquer gordura ou músculo estranho. Começando pela área logo abaixo do coração, identifique o esôfago, a veia cava e a aorta. Remova o esôfago e a veia cava para ter um campo visual claro da aorta.Usando a pinça de micro-dissecção e tesoura, comece a levantar o tecido adiposo e corte o mais próximo possível da aorta. Continue isso pela linha medial até que toda a aorta e as artérias femorais estejam expostas. No coração, remova todo o tecido adiposo expondo os três ramos no arco aórtico.Remova a raiz da aorta do ventrículo esquerdo inserindo a tesoura de microdissecção no ventrículo esquerdo e cortando o músculo ao redor da aorta. Uma vez que a aorta é isolada e limpa, a imagem da aorta usando um scanner infravermelho próximo para visualizar a calcificação vascular. Usando o script MATLAB personalizado, quantifique o sinal total do marcador de cálcio normalizado para a área total da aorta digitalizada.Direcione o MATLAB para o local dos arquivos TIF a partir da varredura de infravermelho próximo dos aortas, abra os arquivos individuais e extraia os valores de intensidade de pixel dos arquivos TIF. Selecione a aorta com a maior calcificação como a escala máxima na imagem mapeada a cores. Quando o comando, Quantos espécimes estão na imagem, aparecer na janela, insira o número de aortas na imagem atual e selecione cada aorta uma a uma.Uma vez que uma aorta é selecionada, o MATLAB criará imagens binárias com uma máscara da área total e da área calcificada da aorta. Os valores dessas imagens mascaradas são então usados para determinar a área total calcificada, a área total da aorta, a porcentagem de área positiva para calcificação e a intensidade média da área calcificada. Imediatamente após a varredura das aortas, agrupe duas a três aortas para produzir uma concentração suficiente de proteína.Incubar duas a três aortas agrupadas em 1,5 mililitros de solução digestiva por duas horas a 37 graus Celsius. Recolher a solução e centrifugar a 1 000 g durante 15 minutos para remover os detritos celulares. Em seguida, para remover as microvesículas, centrifugar o sobrenadante novamente por 30 minutos a 33.000 g.Coletar e avaliar o sobrenadante para o potencial de calcificação. Após a remoção dos detritos celulares do meio condicionado coletado por centrifugação, girar o sobrenadante coletado a 33.000 g por 30 minutos. Colete o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo.Em seguida, adicione 1% de 300 milimolares de dihidrogenofosfato de sódio às amostras de vesículas extracelulares e misture a solução por pipetagem. Transfira 200 microlitros da solução de mistura para uma placa de 96 poços e incube a placa de 96 poços no leitor de microplacas a 37 graus Celsius. Configure o leitor de placas para registrar a absorvância em um comprimento de onda de 340 nanômetros a cada um minuto.Pipetar 300 microlitros da solução de colágeno em cada poço de um vidro de câmara de oito poços e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Após a incubação, adicione 300 microlitros de DMEM como controle nos poços. Adicionar 300 microlitros das amostras de meio vesicular extracelular coletadas previamente aos poços restantes e incubar por seis dias, como demonstrado anteriormente.No 10º dia, pipetar 2,5 microlitros da mistura OsteoSense e DMEM em cada poço e incubar por 24 horas. No final da incubação, imagine os hidrogéis com filtros para fluorescência OsteoSense através da parte inferior de uma câmara de vidro de cobertura usando um microscópio invertido, ou do topo com uma objetiva de longa distância de trabalho. Avalie o número de calcificações e o tamanho da calcificação e as imagens coletadas usando as opções de análise de partículas disponíveis no ImageJ.Em seguida, navegue até Imagem, selecione Ajustar e clique em Limiar para binarizizar as imagens, de modo que apenas o sinal OsteoSense apareça branco. Em seguida, use o comando Analisar e clique em Analisar partículas para obter informações para cada calcificação na imagem. Use os mesmos parâmetros de limite para consistência para cada imagem analisada.A imagem do scanner óptico infravermelho próximo das aortas dissecadas mostrou um sinal OsteoSense maior em toda a aorta de um rato com doença renal crônica do que as duas aortas de camundongos controle. O meio condicionado obtido a partir de células musculares lisas vasculares cultivadas em meio pró-calcifico apresentou maior absorvância a 340 nanômetros que o meio controle. O aumento da absorbância ocorreu 1,5 vezes mais rápido na amostra pró-calcífica em comparação com uma amostra controle.O meio condicionado de células cultivadas em condições pró-calcificas continha depósitos minerais. Ao micro-dissecar a aorta, é importante cortar a gordura ao redor da aorta com cuidado. Você quer o máximo possível da aorta para analisar, mas isso pode ser bastante tedioso.Uma vez que os EVs são isolados, testes adicionais, como um ensaio de atividade de fosfatase alcalina, ou imunocorpo podem ser concluídos. Esses testes mostrariam ainda mais os mecanismos e proteínas presentes nos VEs.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica de coloração para avaliar a calcificação arterial medial das células musculares lisas vasculares in vitro. O método von Kossa emprega uma reação fotoquímica para depositar prata metálica nos locais de calcificação e conferir uma coloração preta.

Coloração de Von Kossa de células musculares lisas vasculares da aorta: uma técnica in vitro para avaliação da calcificação da camada medial arterial

Fonte: Hakim, M. A. et al., Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Parênquima Cerebral de Camundongo. J. Vis. Exp. (2022). Este vídeo demonstra a análise funcional de um tubo endotelial arteriolar isolado de um cérebro de camundongo. Ele descreve as etapas para medir os níveis de cálcio intracelular e o potencial de membrana, tanto na linha de base quanto em resposta à estimulação farmacológica.

Análise da dinâmica do cálcio e alterações do potencial de membrana em um endotélio arteriolar de camundongo

Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED) suporta a análise da dinâmica intracelular de cálcio loja por imagens de fluorescência. O método baseia-se na segmentação de uma carboxilesterase recombinante para o retículo endoplasmático (ER), onde se melhora o desmascaramento do local sintético de baixa afinidade...

Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

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Calcificação das células do músculo vascular liso e de imagem da aorta calcificação e inflamação

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

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Este protocolo descreve o isolamento, cultura e calcificação de células intersticiais do rato-derivado da válvula, um modelo altamente fisiológica em vitro da doença valvar aórtica calcífica (CAVD). Exploração deste modelo de rato facilita a pesquisa CAVD em explorar a célula e os mecanismos moleculares que estão subjacentes a este complexo processo patológico.

Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

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Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária

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Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

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Um método semi-automatizado e reprodutível de base biológica para quantificar a deposição de cálcio in vitro

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Caracterização da secreção de vesículas extracelulares derivadas de adipócitos usando um modelo de camundongo repórter CD63-GFP In Vivo e In Vitro

Aprenda a analisar calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo com aortas de camundongos. Este método permite investigar mecanismos moleculares e desenvolver abordagens terapêuticas para doenças cardiovasculares.

Análise da calcificação vascular mediada por vesículas extracelulares utilizando modelos in vitro e in vivo

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