Name: Modelo Pós-Ressecção de Glioblastoma para Investigações de Hidrogel Terapêutico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de recidiva de glioblastoma pós-ressecção em camundongos usando hidrogel terapêutico injetável. Este método permite avaliar a eficácia do tratamento local e estudar mecanismos de recorrência tumoral in vivo.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas de projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82071767 e 82171781).

Todos os experimentos com animais foram aprovados e supervisionados pelo Comitê de Ética Institucional e pelo Comitê de Ética Animal da Nanjing Medical University (IACUC-1904004). Camundongos fêmeas C57BL/6J, com idade entre 6 e 8 semanas, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparo dos animais
<ol><li>Pesar os ratinhos e anestesiar-os com uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico (ver Tabela de Materiais). Administrar meloxicam (5mg/kg; i.p.) para analgesia perioperatória. Alojar os ratos numa gaiola sob um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, uma temperatura ambiente de 24 °C e uma humidade relativa de 50%. NOTA: Para o presente estudo, o peso inicial dos camundongos foi de cerca de 22 g.</li>
	<li>Remova o pelo na cabeça de um rato usando um barbeador de animais de laboratório e fixe a cabeça e os membros no aparelho estereotáxico (ver Tabela de Materiais). OBS: Esterilizar todos os equipamentos antes do uso.</li>
	<li>Desinfete a cabeça do rato com pelo menos três rondas alternadas de clorexidina ou esfoliação de iodopovidona, seguidas de álcool, e cubra o rato com um campo cirúrgico estéril. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.</li>
	<li>Corte o couro cabeludo do rato cerca de 1 cm ao longo da linha média no topo da testa direita com tesoura oftálmica. OBS: Confirmar o plano cirúrgico da anestesia pela ausência do reflexo pedioso antes de realizar a incisão.</li>
	<li>Ajuste o aparelho estereotáxico para garantir que a costura da espinha de arenque e o ponto da fontanela frontal estejam localizados no mesmo nível.</li>
</ol>2. Construção do modelo ortotópico intracraniano de GBM
<ol><li>Marque o ponto 1 mm para o lado frontal da fontanela frontal, 1,8 mm para o lado direito da fontanela frontal e 3 mm para baixo da fontanela frontal usando um cotonete mergulhado com violeta de genciana2 (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Perfure o ponto usando uma mini broca craniana de 1 mm de diâmetro (consulte Tabela de Materiais) para criar um tamanho de poro de cerca de 1 mm de diâmetro e 1 mm de profundidade.</li>
	<li>Retire o líquido cefalorraquidiano exsudado com um cotonete estéril.</li>
	<li>Aspirar 5 μL de suspensão de células tumorais (GL261-Luci, 5 × 10 5 células suspensas em5 μL de PBS) com uma microseringa. NOTA: O GL261-Luci foi obtido de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Alinhe verticalmente a ponta da agulha da microseringa com o orifício de perfuração do crânio, insira até que a ponta da agulha entre no plano do crânio por 3 mm e devolva a agulha em 0,5 mm7.</li>
	<li>Abra a microseringa e injete a uma velocidade de 1 μL/min.</li>
	<li>Retenha a agulha durante 10 minutos após a injeção.</li>
	<li>Retire a microseringa lentamente e pressione o ponto de injeção com uma bola de algodão seca estéril.</li>
	<li>Sutura do couro cabeludo com sutura cirúrgica inabsorvível (10-0, ver Tabela de Materiais) e desinfecção da incisão novamente.</li>
	<li>Monitore a saúde do animal e mantenha-o em condições quentes.</li>
	<li>Mova o mouse de volta para a gaiola da caixa depois que o mouse for ativado.</li>
	<li>Imagem do camundongo com um sistema de imagem bioluminescente in vivo (ver Tabela de Materiais) para detectar o tumor transplantado no 10º dia após a realização do tumor. NOTA: Luciferase carregada nas células GBM, GL261, foi usada para a imagem bioluminescente.<ol><li>Anestesiar o camundongo com isoflurano a 1,5% com fluxo de oxigênio de 0,6L/min. Após confirmar a profundidade da anestesia por meio da ausência do reflexo pedal, injetar o camundongo intraperitonealmente com fluoresceína de potássio (10 mg/mL, ver Tabela de Materiais) e, 11 s depois, realizar a imagem bioluminescente in vivo . Quando o valor de fluorescência atinge ~5 × 105, o procedimento é bem-sucedido. OBS: Anestesiar o animal antes da aquisição de imagens. Manter a anestesia através do cone nasal fornecido com isoflurano vaporizado.</li>
	</ol></li>
	<li>Selecione os camundongos com sucesso portador de tumor para construir o modelo pós-ressecção de recidiva de GBM.</li>
</ol>3. Construção do modelo pós-ressecção de recidiva do GBM
<ol><li>Quando o tamanho do tumor nos camundongos modelo GBM intracraniano ortotópico se tornar ~6,5 × 105, selecione os camundongos para o modelo de recidiva pós-operatória.</li>
	<li>Pesar os camundongos modelo GBM intracraniano ortotópico e anestesiar os camundongos com uma injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico. Administrar meloxicam (5mg/kg; i.p.) para analgesia perioperatória.</li>
	<li>Repita o processo das etapas 1.2 a 1.5.</li>
	<li>Separe o tecido do couro cabeludo e o crânio e verifique o orifício de perfuração usado para construir o modelo ortotópico intracraniano de GBM. Se o orifício tiver cicatrizado, identifique o orifício usando aparato estereotáxico e siga o procedimento mencionado nos passos 2.1-2.3.</li>
	<li>Expanda o diâmetro do orifício para 5 mm com uma broca de crânio e remova o líquido cefalorraquidiano exsudado com um cotonete estéril.</li>
	<li>Concentre o microscópio na cabeça do mouse e ajuste as configurações para garantir que o furo de perfuração esteja localizado no centro do campo de visão.</li>
	<li>Corte as meninges com microtesoura e remova parte do tecido tumoral com uma micro cureta e um microbisturi ao microscópio. OBS: Em relação às meninges, quando o crânio é aberto, a fina membrana próxima ao tecido cerebral são as meninges.</li>
	<li>Pare o sangramento com gaze estéril e lave a incisão com soro fisiológico estéril.</li>
	<li>Injetar o hidrogel comercialmente disponível (10 μL, ver Tabela de Materiais) na cavidade de ressecção com uma seringa de 1 mL, suturar o couro cabeludo com uma sutura cirúrgica inabsorvível (10-0) e desinfetar novamente a incisão (Figura 1).</li>
	<li>Monitore a saúde do animal e mantenha o rato aquecido.</li>
	<li>Mova o mouse de volta para a gaiola da caixa depois que o mouse for ativado.</li>
	<li>Realizar imagem bioluminescente in vivo para detectar o tumor transplantado 1 dia depois para quantificar o tamanho do tumor residual (Figura 2 e Figura 3).</li>
	<li>Pese os ratos a cada 2 dias até o ponto de extremidade terminal. NOTA: Para o presente estudo, o desfecho terminal foi o dia 30, e os camundongos foram eutanasiados por uma overdose de pentobarbital sódico com uma injeção intraperitoneal.</li>
</ol>

<ol><li>Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state+of+immunotherapy+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Current state of immunotherapy for glioblastoma.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (7), 422-442 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+targeting+nanoparticles-hydrogel+hybrid+system+for+combined+chemo-immunotherapy+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">In situ targeting nanoparticles-hydrogel hybrid system for combined chemo-immunotherapy of glioma.</a> Journal of Controlled Release. 345, 786-797 (2022).</li>
<li>Binder, Z. A., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%3A+The+current+state+of+biology+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma: The current state of biology and therapeutic strategies.</a> Cancer Research. 82 (5), 769-772 (2022).</li>
<li>Kauer, T. M., Figueiredo, J. L., Hingtgen, S., Shah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+therapeutic+stem+cells+implanted+in+the+tumor+resection+cavity+induce+cell+death+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas.</a> Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+engineered+TRAIL-overexpressing+adipose-derived+stem+cells+target+and+eradicate+glioblastoma+via+intracranial+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle engineered TRAIL-overexpressing adipose-derived stem cells target and eradicate glioblastoma via intracranial delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13857-13862 (2016).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironmental+landscape+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The microenvironmental landscape of brain tumors.</a> Cancer Cell. 31 (3), 326-341 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostimulant+hydrogel+for+the+inhibition+of+malignant+glioma+relapse+post-resection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Immunostimulant hydrogel for the inhibition of malignant glioma relapse post-resection.</a> Nature Nanotechnology. 16 (5), 538-548 (2021).</li>
<li>Ruan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual-bioresponsive+drug-delivery+depot+for+combination+of+epigenetic+modulation+and+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A dual-bioresponsive drug-delivery depot for combination of epigenetic modulation and immune checkpoint blockade.</a> Advanced Materials. 31 (17), 1806957(2019).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li>
<li>Sun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostimulant+in+situ+hydrogel+improves+synergetic+radioimmunotherapy+of+malignant+glioblastoma+relapse+post-resection%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Immunostimulant in situ hydrogel improves synergetic radioimmunotherapy of malignant glioblastoma relapse post-resection.</a> Advanced Functional Materials. 32 (43), 2205038(2022).</li>
<li>Liu, D. K., Sulman, E. P., Wen, P. Y., Kurz, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapies+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel therapies for glioblastoma.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 20 (7), 19(2020).</li>
<li>Mellinghoff, I. K., Cloughesy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+risk+and+efficiency+in+drug+development+for+rare+and+challenging+tumors%3A+A+new+paradigm+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Balancing risk and efficiency in drug development for rare and challenging tumors: A new paradigm for glioma.</a> Journal of Clinical Oncology. 40 (30), 3510-3519 (2022).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

A cirurgia continua sendo a primeira escolha para a maioria dos pacientes com GBM11. Devido à característica de crescimento invasivo do GBM, um pequeno número de células tumorais ainda permanece após técnicas microneurocirúrgicas, resultando em eventual recidivatumoral12. Como inibir a recorrência do GBM após a cirurgia tornou-se o foco da pesquisa relacionada ao GBM. No entanto, devido à complexa estrutura anatômica do tecido cerebral, a construção de um modelo adequado de GBM pós-operatório tornou-se o principal problema a ser resolvido neste campo.
Este estudo desenvolveu um modelo de recidiva pós-ressecção de GBM. No processo de construção desse modelo, a construção do modelo ortotópico intracraniano de GBM é fundamental. Após esse modelo ter sido desenvolvido com sucesso, a ressecção precisa ser realizada no momento certo. O tempo recomendado é quando o valor de fluorescência do tamanho do tumor é de cerca de 6,5 × 105. Para reduzir a mortalidade dos camundongos, a ressecção sob anestesia foi realizada com 40 mg/kg de pentobarbital sódico a 1% por injeção intraperitoneal. No entanto, a ressecção foi difícil de realizar, e os camundongos muitas vezes se moviam devido à pequena dose do anestésico. Com base nisso, a dose do anestésico foi aumentada para 50 mg/kg. Após o aumento da dose anestésica, as respostas intraoperatórias dos camundongos desapareceram, e a ressecção foi realizada com sucesso. O gás isoflurano também pode ser utilizado neste protocolo.
Neste estudo, células GL261-Luci foram usadas para desenvolver o modelo; portanto, mais linhagens celulares GBM devem ser usadas para validar o protocolo no futuro. Para tornar o protocolo mais convincente, vários modelos de camundongos GBM, como modelos de camundongos GBM geneticamente modificados, precisam ser usados. Além disso, a RM pode ser o melhor meio para detectar a recorrência de tumores após a cirurgia.
Em resumo, neste trabalho, um modelo de recidiva pós-ressecção de GBM foi desenvolvido. Nesse modelo, a recidiva tumoral é monitorada avaliando-se o crescimento residual do tumor após a ressecção. Embora esse modelo não possa ser considerado para mimetizar completamente a recidiva tumoral, o estilo de ressecção nesse modelo é semelhante ao padrão de cirurgia maximamente segura no tratamento clínico de pacientes com GBM. Este trabalho fornece um método conveniente e viável de construção do modelo pós-ressecção de recidiva de GBM e representa um avanço no campo da pesquisa sobre recidiva de GBM pós-ressecção.

O glioblastoma (GBM) é o tumor maligno mais comum entre todos os cânceres do sistema nervosocentral1,2. A cirurgia é o tratamento de primeira linha para pacientes com GBM, e a quimiorradiação é o principal tratamento adjuvante após a cirurgia. No entanto, a recorrência tumoral geralmente se desenvolve dentro de 3-6 meses na maioria dos pacientes com GBM com váriostratamentos3,4,5. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias de tratamento mais eficazes para prevenir a recorrência do GBM.
Estudos recentes sobre GBM têm se concentrado principalmente em tumores primários em vez de tumoresrecorrentes6. No entanto, o problema mais comum que precisa ser resolvido na clínica é como inibir a recorrência do GBM após a cirurgia. Portanto, a pesquisa sobre a recorrência do GBM após a cirurgia necessita de maior atenção. Os hidrogéis terapêuticos bioresponsivos são o vetor mais comumente utilizado em estudos de recidiva tumoral apóscirurgia7,8. No entanto, devido à estrutura especial do sistema nervoso central, é difícil desenvolver um modelo adequado de recidiva pós-ressecção doGBM9, o que é crítico para o estudo da recidiva do GBM.
Este estudo gerou um modelo melhorado de recidiva do GBM pós-ressecção baseado no modelo de GBM intracraniano ortotópico usado em pesquisas sobre GBM primário. Nesse modelo, a maioria dos tumores é removida cirurgicamente com microscopia, e o tumor residual é detectado por bioluminescência in vivo e coloração pela hematoxilina e eosina (H&E). Esse modelo mimetiza o estado de ressecção de pacientes com tumor cerebral e pode ser usado em vários estudos sobre recidiva do GBM.

<table><tbody><tr><td>Biotecnologia violeta Co</td>. de <td>Sigma</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>GL261-Luci</td><td>Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou da genciana, Ltd.</td><td>ZQ0932</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem bioluminescente in vivo</td><td>Tanon</td><td>Tanon ABL X6</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador de animais de laboratório</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>FS600</td><td></td></tr><tr><td>Ratos</td><td>Pequim Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro cureta</td><td>Belevor Medical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro bisturi</td><td>Belevor Medical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd</td><td>JSZ5A / B</td><td></td></tr><tr><td>Microsseringa</td><td>Hamilton</td><td>87943</td><td></td></tr><tr><td>Mini broca craniana</td><td>RWD</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Sutura cirúrgica não absorvível</td><td>Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>ChemSrc</td><td>57-33-0</td><td></td></tr><tr><td>PVA-TSPBA hidrogel&nbsp;</td><td>Aladdin</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho estereotáxico</td><td>RWD</td><td>68043</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo pós-ressecção de glioblastoma para investigações de hidrogel terapêutico

Glioblastoma Relapse Post-Resection Model for Therapeutic Hydrogel Investigations

A recorrência tumoral é um importante fator indicativo de mau prognóstico no glioblastoma (GBM). Muitos estudos estão tentando identificar estratégias terapêuticas eficazes para prevenir a recorrência do GBM após a cirurgia. Hidrogéis terapêuticos biorresponsivos capazes de sustentar fármacos liberados localmente são frequentemente utilizados para o tratamento local do GBM após a cirurgia. No entanto, a pesquisa é limitada devido à falta de um modelo adequado de recidiva pós-ressecção de GBM. Aqui, um modelo de recidiva pós-ressecção de GBM foi desenvolvido e aplicado em investigações terapêuticas com hidrogel. Esse modelo foi construído com base no modelo ortotópico intracraniano do GBM, amplamente utilizado em estudos sobre GBM. A ressecção subtotal foi realizada em camundongo modelo GBM intracraniano ortotópico para mimetizar o tratamento clínico. O tumor residual foi utilizado para indicar o tamanho do crescimento tumoral. Esse modelo é de fácil construção, pode mimetizar melhor a situação de ressecção cirúrgica do GBM e pode ser aplicado em vários estudos sobre o tratamento local da recidiva do GBM pós-ressecção. Como resultado, o modelo de recidiva de GBM pós-ressecção fornece um modelo único de recidiva de GBM para estudos eficazes de tratamento local de recidiva pós-ressecção.

O processo de construção do modelo pós-ressecção de recidiva do GBM é mostrado na Figura 1. A cavidade de ressecção após a remoção parcial do tumor sob a microscopia é mostrada. O hidrogel foi injetado na cavidade de ressecção com uma seringa para demonstrar o efeito terapêutico. O cronograma do planejamento experimental é mostrado na Figura 2A. Depois que as células GBM foram implantadas no cérebro dos camundongos, o crescimento do tumor foi testado por imagem bioluminescente in vivo no dia 10. A ressecção foi realizada no 11º dia, e o hidrogel foi então injetado na cavidade de ressecção. O exame de imagem bioluminescente in vivo foi realizado no dia 15, dia 20, dia 25 e dia 30 para monitorar o crescimento residual do tumor. Como mostrado na Figura 2B,C, o tamanho dos tumores no modelo de recidiva pós-ressecção de GBM foi significativamente menor do que no modelo de GBM intracraniano ortotópico, como mostrado pelo exame de imagem bioluminescente in vivo. No 25º dia, houve recidiva significativa dos tumores após a ressecção (Figura 2D). A coloração H&amp;E confirmou que o modelo de recidiva do GBM pós-ressecção foi construído com sucesso e que os tumores residuais recorreram significativamente após a ressecção (Figura 3A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65026/65026fig01.jpg"> Figura 1: Visão intraoperatória da ressecção do tumor e injeção do hidrogel. Parte do tecido tumoral foi removida com microcureta e microbisturi ao microscópio, e hidrogel foi injetado na cavidade de ressecção. Barras de escala: 50 μm. Esse valor foi modificado de Sun et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65026/65026fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65026/65026fig02.jpg"> Figura 2: Cronograma do desenho experimental e das imagens bioluminescentes in vivo de camundongos no modelo GBM intracraniano e pós-ressecção. (A) O cronograma do delineamento experimental mostrando que a ressecção foi realizada no dia 11 e que a imagem bioluminescente (IV) in vivo foi realizada no dia 10, dia 15, dia 20, dia 25 e dia 30. (B) Os camundongos modelo GBM intracraniano mostraram um grande tamanho do tumor no dia 10, (C) o tamanho do tumor foi significativamente reduzido após a ressecção no dia 11, e (D) o tamanho do tumor aumentou após a ressecção no dia 25 no modelo GBM pós-ressecção. O grupo controle incluiu camundongos modelo GBM recidiva pós-ressecção sem tratamento. Um total de 42 camundongos foi utilizado neste estudo. Barras de escala: 100 μm. Esse valor foi modificado de Sun et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65026/65026fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65026/65026fig03.jpg"> Figura 3: Imagem de H&amp;E do tecido cerebral do modelo GBM pós-ressecção. (A) Imagem corada por H&amp;E demonstrando a cavidade de ressecção, tumor residual e tecido cerebral normal. O tecido cerebral foi coletado 1 dia após a ressecção. (B) Imagem de H&amp;E demonstrando o tumor recorrente e o tecido cerebral normal. O tecido cerebral foi coletado no 12º dia após a ressecção. Barras de escala: 100 μm. Esse valor foi modificado de Sun et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65026/65026fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O presente protocolo estabelece um modelo pós-ressecção de glioblastoma (GBM) usando microscopia para investigar o efeito terapêutico de um hidrogel injetável bioresponsivo in vivo.

Modelo Pós-Ressecção de Glioblastoma para Investigações de Hidrogel Terapêutico

Tumor recurrence is an important factor indicative of a poor prognosis in glioblastoma (GBM). Many studies are attempting to identify effective ...

A recorrência tumoral é uma das principais causas de falha do esquema de ressecção cirúrgica do GBM. Nosso protocolo fornece um modelo único de recorrência de GBM para estudos eficazes de tratamento local de recidiva, pós-pesquisa. Esta técnica fornece um método conveniente e viável para construir o modelo pós-ressecção de recidiva de GBM, e pode ser usada em vários estudos sobre recidiva de GBM.Comece preparando o animal. Corte o couro cabeludo do rato cerca de um centímetro ao longo da linha média na testa direita com tesoura oftálmica. Ajuste o aparelho estereotáxico para garantir que a costura da espinha de arenque e o ponto da fontanela frontal estejam localizados no mesmo nível.Usando um cotonete mergulhado em violeta geniana, marque um ponto em um milímetro para a frente, 1,8 milímetros para a direita e três milímetros para baixo da fontanela frontal. Perfure o ponto usando uma minibroca craniana de um milímetro de diâmetro. Crie um poro de cerca de um milímetro de diâmetro e um milímetro de profundidade.Remova o líquido cefalorraquidiano exsudado com um cotonete estéril. Em seguida, aspirar cinco microlitros de suspensão de células tumorais com uma microseringa. Alinhe a ponta da agulha da microseringa verticalmente com o orifício de perfuração do crânio e insira até que a ponta da agulha entre no plano do crânio por três milímetros.Em seguida, retraia a agulha em 0,5 milímetros. Abra a microseringa e injete a solução a uma velocidade de um microlitro por minuto. Retenha a agulha durante 10 minutos após a injeção.Em seguida, retire a microseringa lentamente e pressione o ponto de injeção com uma bola de algodão estéril e seca. Sutura do couro cabeludo com sutura cirúrgica inabsorvível 10-0 e desinfecção da incisão. Monitorar a saúde do animal e mantê-lo em condições quentes.Depois que o rato acordar, mova-o de volta para a gaiola da caixa. 10 dias após a realização do tumor, detectar o tumor transplantado. Para isso, injete o camundongo intraperitonealmente com fluoresceína de potássio e, 11 segundos depois, faça uma imagem do camundongo com um sistema de imagem bioluminescente in vivo.Separe o tecido do couro cabeludo e o crânio e verifique o orifício de perfuração usado para construir o modelo ortotópico intracraniano de GBM. Se o orifício tiver cicatrizado, identifique o orifício usando aparato estereotáxico e faça o furo como mostrado anteriormente. Expanda todo o diâmetro para cinco milímetros com uma broca de crânio e remova o líquido cefalorraquidiano exsudado com um cotonete estéril.Concentre o microscópio na cabeça do mouse e ajuste as configurações para garantir que o furo de perfuração esteja localizado no centro do campo de visão. Corte as meninges com microtesoura. Em seguida, remova parte do tecido tumoral com uma microcureta e microbisturi sob o microscópio.Pare o sangramento com gaze estéril e lave a injeção com soro fisiológico estéril. Usando uma seringa de um mililitro, injete 10 microlitros do hidrogel comercialmente disponível na cavidade de ressecção. Usando este protocolo, as células GBM foram implantadas no cérebro dos camundongos e o crescimento do tumor foi testado por imagem bioluminescente in vivo no dia 10.A ressecção e injeção de hidrogel foram realizadas no 11º dia. O tamanho dos tumores no modelo de recidiva pós-ressecção do GBM foi significativamente menor do que no modelo do GBM intracraniano ortotópico. O monitoramento do crescimento tumoral residual no 25º dia mostrou recidiva dos tumores.A coloração H&E confirmou que o modelo de recidiva pós-ressecção do GBM foi construído com sucesso e que os tumores residuais recorreram significativamente após a ressecção. A coisa mais importante a lembrar neste procedimento é cortar as meninges e remover parte do tecido tumoral sob o microscópio.

glioblastoma-relapse-post-resection-model-for-therapeutic-hydrogel

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra como as gliomasferas, derivadas de tumores cerebrais, são separadas em células únicas e encapsuladas em um hidrogel à base de ácido hialurônico. Esse processo promove interações célula-célula, formando um modelo de glioblastoma tridimensional estruturado.

Um hidrogel à base de ácido hialurônico para cultura tridimensional de células de glioblastoma

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Tumor-buscando terapêuticas tronco células mesenquimais (MSCs) mostram a promessa como um tratamento para glioblastoma invasiva. Transplante de ideal envolve entrega de MSCs na cavidade de ressecção do tumor em andaimes. Aqui, pré-clínicos técnicas para estudar o tratamento de MSC do glioblastoma são fornecidas incluindo: ressecção de tumor guiada por imagem; implantação do MSC-semeado andaimes; e terapia pós-operatória de rastreamento.

Ressecção guiada por imagem de Glioblastoma e intracraniana implantação de andaimes terapêuticos de células-tronco-semeado

Aqui, apresentamos um protocolo para cultura tridimensional de células de glioblastoma paciente-derivado dentro ortogonalmente sintonizáveis biomateriais projetados para imitar a matriz do cérebro. Essa abordagem fornece uma em vitro, plataforma experimental que mantém muitas características de na vivo glioblastoma células tipicamente perdidas na cultura.

Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente

Este trabalho descreve o desenvolvimento de eletrodos interdigitalizados flexíveis para implementação em modelos de tumores cerebrais 3D, a saber, cultura in vitro , modelo in ovo e modelo murino in vivo. O método proposto pode ser utilizado para avaliar os efeitos de campos elétricos pulsados em tumores em diferentes níveis de complexidade.

Dispositivos eletrônicos orgânicos flexíveis para terapia de campo elétrico pulsado de glioblastoma

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

Aqui, descrevemos um modelo ortotópico pré-clínico em camundongos para GBM, estabelecido por injeção intracraniana de células derivadas de tumores modelo de camundongos geneticamente modificados. Este modelo exibe as características da doença do GBM humano. Para estudos translacionais, o tumor cerebral de camundongo é rastreado por ressonância magnética in vivo e histopatologia.

Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme

Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.

Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

Apresentamos um método para replicar o microambiente tumoral de glioma na frente invasiva que incorpora fluxo de fluido intersticial. Este modelo é um hidrogel de hialuronano-colágeno I em um inserto de cultura de tecidos onde uma cabeça de pressão de fluido pode ser aplicada. A invasão pode ser quantificada e as células podem ser isoladas ou lisadas.

Um modelo fotopolimerizável de ácido hialurônico-colágeno do microambiente de glioma invasivo com fluxo intersticial

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Aprenda a estabelecer um modelo de recidiva de glioblastoma pós-ressecção em camundongos usando hidrogel terapêutico injetável. Este método permite avaliar a eficácia do tratamento local e estudar mecanismos de recorrência tumoral in vivo.

Modelo Pós-Ressecção de Glioblastoma para Investigações de Hidrogel Terapêutico

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