Name: Ensaio de Captação de Anticorpos para Rastreamento de Endocitose Notch/Delta Durante a Divisão Assimétrica de Progenitores da Glia Radial de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda um ensaio de captação de anticorpos para rastrear a endocitose Notch/Delta em progenitores de glia radial de zebrafish. Este método permite visualizar a sinalização celular durante o desenvolvimento do cérebro embrionário com alta eficiência.

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O projeto foi apoiado pelo NIH R01NS120218, pelo UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation e pelo Chan Zuckerberg Biohub.

Utilizamos a linhagem selvagem AB e a linhagem transgênica Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] para o estudo. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Califórnia, São Francisco, EUA (Número de aprovação: AN179000).
1. Preparação de embriões de peixe-zebra
<ol><li>Configure tanques de travessia de peixes à tarde antes das 17:00, com uma fêmea de peixe selvagem e um macho Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] usando divisórias para separá-los em cada tanque.</li>
	<li>Remova as divisórias antes das 11:00 de todos os tanques de travessia na manhã seguinte. Mantenha o silêncio e não perturbe os peixes enquanto eles estão acasalando. A desova normalmente ocorre dentro de 30 minutos após a remoção das divisórias. Os ovos fertilizados permanecem no fundo do tanque.<ol><li>Coletar ovos fertilizados dos tanques com um filtro de malha. Transfira os ovos lavando-os em uma placa de Petri cheia de água do ovo e examine os embriões sob um microscópio dissecante em um aumento de 10x a 20x.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferir os embriões fertilizados para uma placa de Petri limpa contendo aproximadamente 20 mL de meio embrionário (100 mL de solução-estoque de 1.000x contém 29,4 g de NaCl, 1,27 g de KCl, 4,85 g de CaCl 2,2H 2 O e 8,13 g de MgSO4,7H 2O) com pipetas de vidro Pasteur de grandecalibre. Manter os embriões a 28 °C. Manter 50 embriões fertilizados por placa de Petri com 30 mL de meio embrionário a 28,5 °C. NOTA: Um par de peixes normalmente produz 100-300 embriões, e a taxa de fertilização e sobrevivência de embriões saudáveis é superior a 95% para cada acasalamento.</li>
	<li>Na manhã seguinte, retire os embriões da incubadora às 8:00 da manhã, quando os embriões tiverem atingido o estágio de desenvolvimento de ~18-20 h pós-fertilização (hpf). Observá-los sob microscópio de epifluorescência com aumento de 20x, utilizando inicialmente luz branca. Nesse momento, os embriões do peixe-zebra estão no estágio de 20 somites.<ol><li>Descarte embriões mortos que estão turvos ou rompidos sob o microscópio usando uma pipeta de vidro.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligue a lâmpada fluorescente e escolha a configuração do filtro RFP do microscópio. Em seguida, selecione os embriões com fluorescência vermelha forte e transfira-os para um novo prato com água de ovo.<ol><li>Descorionar os embriões manualmente com duas pinças finas (as pontas das pinças devem estar afiadas e intactas) sob luz branca (Tabela de Materiais).</li>
		<li>Segure o córion com um par de pinças e faça uma ruptura no córion com o outro fórceps. Abra a lágrima cuidadosamente usando a pinça e torne-a grande o suficiente para o embrião passar, empurrando suavemente o embrião com as pontas das outras pinças.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira os embriões descorionados para uma nova placa de Petri com meio embrionário fresco para um rápido enxágue antes da microinjeção.</li>
</ol>2. Preparação da microinjeção
<ol><li>Use os capilares (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, com filamento) para puxar agulhas de injeção fina em um puxador. Projete e otimize o programa de tração de acordo com o manual.</li>
	<li>Abra a ponta da agulha com pinça sob um microscópio de estereodissecção. Faça o diâmetro da ponta em torno de 10 μm e o ângulo de conicidade em torno de 30°.</li>
	<li>Conjugar o anticorpo monoclonal anti-Dld de camundongo com o anti-IgG-Atto647N de camundongo antes da injeção.<ol><li>Para cada experimento de injeção, misturar 0,5 μL do anticorpo anti-Dld (0,5 mg/mL) com 2 μL do anticorpo anti-Mouse-IgG-Atto647N (1 mg/mL) pipetando 5-10 vezes. Em seguida, incubar à temperatura ambiente por pelo menos 30 min (ou no gelo por 2-3 h).</li>
		<li>Após a incubação, adicionar 2,5 μL de tampão de bloqueio (10 mg/mL de IgG de camundongo) e 0,5 μL de vermelho de fenol a 0,5% à mistura de anticorpos, e pipetar 10x para misturar completamente, para bloquear quaisquer anticorpos não conjugados remanescentes na mistura. NOTA: Para cada ensaio, prepare uma mistura extra sem o anticorpo anti-Dld e use-o como controle.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar 1% de agarose de baixo ponto de fusão no meio embrionário. Aqueça a mistura contida em agarose a 70 °C até que a mistura fique transparente.<ol><li>Alíquota da solução de agarose em tubos de microcentrífuga de 2 mL. Mantenha as alíquotas em um bloco de calor a ~40 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Enxaguar o embrião no tubo contendo 1% de agarose de baixo ponto de fusão por 3 s.</li>
	<li>Coloque o embrião em uma tampa de placa de Petri de plástico invertida juntamente com gotas individuais de agarose (~30-40 μL) para montar cada embrião separadamente na tampa, como mostrado na Figura 1. Coloque os embriões lateralmente na agarose e mantenha esta posição até que a agarose se solidifique à temperatura ambiente.</li>
	<li>Monte 12 embriões em três fileiras, um a um, como acima. Cubra todos os embriões montados na agarose com meio de ovo.</li>
</ol>3. Microinjeção
<ol><li>Coloque os embriões embutidos sob o estereomicroscópio e cubra a agarose com água de ovo.</li>
	<li>Ajuste o injetor de pressão de ar juntamente com os micromanipuladores, colocando-os próximos aos microscópios como mostra a Figura 1. Utilizar como recurso ar o cilindro de gás de aço contendo nitrogênio gasoso (N2) sob alta pressão.<ol><li>Abra a válvula de gás somente depois que os embriões tiverem sido montados na agarose. Em seguida, carregar frontalmente a agulha de vidro preparada com 2 μL de mistura de anticorpos no micromanipulador, como mostra a Figura 1, ao usar o módulo de enchimento frontal do microinjetor.</li>
		<li>Ajuste a pressão de entrada para ~80-90 psi e a pressão de injeção para ~20 psi.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrar o volume de injeção utilizando um micrômetro ao microscópio, conforme descrito anteriormente15. Defina a duração do tempo de sintonia para ser de 10 ms a 120 ms, de acordo com o tamanho da abertura da agulha. Aplique cada pulso de injeção tocando no remo. Ajuste o volume de injeção de cada entrega para ~4-5 nL.</li>
	<li>Cutuque a ponta da agulha de microinjeção através da placa do teto dorsal do rombencéfalo posterior ao ponto de dobradiça r0/r1 e injete cerca de 10 nL (dois ou três pulsos) de mistura de anticorpos sem atingir o tecido cerebral. Observe o fluxo de fluidos vermelhos no ventrículo cerebral. NOTA: O ventrículo do rombencéfalo é posterior ao limite do mesencéfalo. A mistura de anticorpos contendo vermelho fenol injetado preenche o ventrículo cerebral do rombencéfalo para o prosencéfalo imediatamente, difundindo-se com líquido cefalorraquidiano.</li>
	<li>Após a injeção, remova a ponta da agulha do embrião rapidamente girando o botão do micromanipulador. Para uma injeção bem-sucedida, o corante vermelho da mistura injetada permanece no ventrículo cerebral de forma estável sem vazar para a agarose cercada.</li>
	<li>Mova a placa de montagem sob o microscópio para localizar outro embrião montado em uma posição adequada para repetições.<ol><li>Depois de injetar seis a oito embriões, descasque a agarose com uma faca microcirúrgica para liberar os embriões da agarose incorporada. Transfira os embriões microinjetados para uma placa fresca com 30 mL de meio embrionário e coloque-os em temperatura ambiente para as próximas etapas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Montagem e time-lapse de imagens ao vivo
<ol><li>Após 30 min, transferir os embriões selecionados para 10 mL de meio embrionário. Adicionar 420 μL de estoque de tricaína (4 mg/mL) a 10 mL de meio embrionário para anestesiar os embriões.</li>
	<li>Para montar os embriões, preparar agarose de baixo ponto de fusão a 0,8% contendo a mesma concentração de tricaína na trompa. Mantenha as alíquotas em um bloco de calor a ~40 °C.</li>
	<li>Use uma pipeta de vidro para imergir os embriões injetados na agarose quente por 3 s. Em seguida, remova imediatamente os embriões da agarose com a mesma pipeta de vidro e coloque os embriões no centro de placas de cultura de fundo de vidro de 35 mm com uma gota de agarose do tubo. Coloque apenas um embrião por gota no copo.</li>
	<li>Orientar os embriões suavemente com uma sonda de fibra ou ponta de carga para manter o lado dorsal do cérebro embrionário o mais próximo possível do fundo de vidro. Ajuste a posição do embrião suavemente para estender o embrião sem enrolar à medida que a agarose se solidifica gradualmente.</li>
	<li>Depois, verifique a posição do embrião virando o prato de fundo de vidro. Certifique-se de que todo o prosencéfalo dorsal com os embriões corretamente montados possa ser visto ao microscópio.</li>
	<li>Adicionar 2-3 mL de meio embrionário pré-aquecido a 28,5 °C contendo tricaína para cobrir o embrião. Coloque a placa adequadamente no estágio de temperatura controlada do microscópio confocal, como mostra a Figura 1. Ajuste a temperatura da câmara de imagem para 28,5 °C. O embrião já está pronto para exames de imagem.</li>
	<li>Execute imagens ao vivo com lapso de tempo com um intervalo de tempo fixo usando uma objetiva de imersão em água de 40x.<ol><li>Utilizar o software de controle de imagem e microscópio (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.</li>
		<li>Selecionar os canais de imagem de 564 nm e 647 nm para obter imagens da fluorescência da membrana do peixe-zebra transgênico MyR-Tdtomato e anti-Dld-Atto647N endossômico na célula (Figura 1).</li>
		<li>Ajuste a potência do laser em 30% para ambos os canais. Use um tempo de exposição por plano z de 200 ms para cada canal.</li>
		<li>Para cada embrião de peixe-zebra montado, use um passo z de varredura de 1 μm para 20 planos z no total, e um ciclo de varredura de 100 períodos de tempo.</li>
		<li>Defina o intervalo de tempo entre cada ciclo de varredura em 20 s e o modo de varredura como canal, fatia.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Baonza, A., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+directly+controls+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).</li>
<li>Chitnis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChitnis%2C+A+%22Developmental+Dynamics%22">Developmental Dynamics</a>. 235 (4), 886-894 (2006).</li>
<li>Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+trafficking+during+mitosis+and+notch-dependent+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+and+Subcellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).</li>
<li>Le Borgne, R., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+endocytosis+makes+delta+signal+better%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: endocytosis makes delta signal better.</a> Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).</li>
<li>Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+endocytosis+is+induced+by+ligand+and+is+required+for+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-1+signalling+requires+ligand-induced+proteolytic+release+of+intracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain.</a> Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).</li>
<li>Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Delta+and+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division.</a> Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).</li>
<li>Derivery, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+by+spindle+asymmetry+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division.</a> Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).</li>
<li>Matsuda, M., Chitnis, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Notch+determines+endocytosis+of+specific+Delta+ligands+in+zebrafish+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue.</a> Development. 136 (2), 197-206 (2009).</li>
<li>Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).</li>
<li>Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralineage+directional+Notch+signaling+regulates+self-renewal+and+differentiation+of+asymmetrically+dividing+radial+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia.</a> Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+engage+cytoplasmic+Par-3+that+recruits+dynein+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division.</a> Science Advances. 7 (24), (2021).</li>
<li>Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+analysis+for+cryosectioned+and+immunostained+tissue+samples+with+or+without+label+retention+expansion+microscopy+%28LR-ExM%29+by+JACoP%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP.</a> Bio-Protocol. 12 (5), 4336(2022).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1218(2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+the+injection+volume+for+microinjection+of+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+multicolor+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Desenvolvemos um ensaio de captação de anticorpos para marcação e obtenção de imagens endossômicas do tráfico de Notch/Delta em progenitores radiais da glia de peixe-zebra com alta eficiência. Em comparação com métodos anteriores usados para rastrear anticorpos marcados anti-DeltaD em células Drosophila SOP7,8, nosso método usou microinjeção em vez de incubação de amostras no anticorpo conjugado. Anticorpos anti-Dld conjugados fluorescentemente foram microinjetad...

A sinalização Notch controla a decisão e padronização do destino celular durante o desenvolvimento em metazoários1, e estudos recentes têm mostrado que a sinalização Notch na divisão de células-tronco depende principalmente do tráfego endocítico 2,3. O Notch endocitosado/Delta pode ativar a sinalização Notch no núcleo e aumentar a transcrição de genes alvo Notch 4,5,6. O tráfego endossômico Notch/Delta direcional foi observado pela primeira vez em células precursoras de órgãos sensoriais (SOP) de Drosophila durante sua divisão celular assimétrica (ACD), resultando em uma maior atividade de sinalização Notch em pIIa do que em pIIb 7,8. Ensaios de captação de anticorpos com anticorpos anti-Delta e anti-Notch têm sido aplicados para monitorar o processo endocítico em células POP mitóticas. Os endossomos Notch/DeltaD movem-se juntamente com uma proteína motora de cinesina para o fuso central durante a citocinese, e são translocados assimetricamente para dentro da célula pIIa devido à matriz antiparalela do fuso central assimétrico no último momento da divisão celular 3,8. Esses estudos lançaram luz sobre os mecanismos moleculares que regulam a divisão assimétrica em células de Drosophila SOP, mas não está claro se processos endocíticos semelhantes ocorrem em progenitores da glia radial de vertebrados (RGPs).
Além disso, os mecanismos moleculares que regulam a sinalização assimétrica Notch/DeltaD durante a divisão do RGP dos vertebrados não são bem compreendidos. Em zebrafish, tem sido relatado que a interação de Notch e Delta facilita a endocitose do ligante DeltaD9. Não se sabe se a endocitose DeltaD pode afetar a escolha do destino celular das células filhas no cérebro de vertebrados em desenvolvimento. Estudos recentes mostram que a injeção de anticorpos anti-DeltaD conjugados fluorescentemente no tubo neural poderia marcar os endossomos de Sara especificamente em células neuroepiteliais, e os endossomos anti-DeltaD contendo Sara segregam preferencialmente em células filhas em proliferação10. Tem sido sugerido que a sinalização de Notch dos endossomos poderia regular o destino das células filhas. Resultados anteriores mostraram que a maioria das células RGP do peixe-zebra no prosencéfalo em desenvolvimento sofre DCA, e a determinação do destino da célula filha é dependente da sinalização intralinhagem Notch/DeltaD11. A fim de elucidar a natureza da sinalização Notch/DeltaD intralinhagem em RGPs de peixe-zebra, desenvolvemos o ensaio de captação de anticorpos anti-DeltaD no cérebro em desenvolvimento do peixe-zebra. Usando este protocolo, realizamos com sucesso a marcação ao vivo e imagens do tráfego endocítico de DeltaD em RGPs mitóticos.
O anticorpo anti-DeltaD fluorescentemente marcado é eficientemente internalizado nos RGPs ao longo do ventrículo prosencéfalo. Isso facilitou sobremaneira a descoberta do tráfego direcional de endossomos DeltaD nos RGPs de divisão assimétrica12,13. Em comparação com protocolos anteriores de captação de anticorpos desenvolvidos para culturas de Drosophila notum e medula espinhal de peixe-zebra 10, este protocolo alcançou marcação anti-DeltaD de longa duração e altamente eficiente na camada de células do ventrículo cerebral, especificamente com menos de10 nL de mistura de anticorpos microinjetados. A injeção do ventrículo do rombencéfalo é muito conveniente para a aplicação do ensaio de captação de anticorpos no cérebro em desenvolvimento, pois o ventrículo do rombencéfalo é bem expandido em embriões de peixe-zebra e preenchido com líquido cefalorraquidiano no estágio inicial de desenvolvimento14. Ao injetar a mistura de anticorpos no ventrículo do rombencéfalo sem ferir nenhum tecido crucial em desenvolvimento, o protocolo minimizou ao máximo possíveis danos à zona de imagem no prosencéfalo. A dose reduzida do anticorpo primário injetado também evitou potenciais efeitos colaterais de interferir com a sinalização endógena Delta-Notch in vivo. Este protocolo pode ser facilmente combinado com outras perturbações farmacológicas ou genéticas, utilizado em diferentes estágios de desenvolvimento, e possivelmente adaptado ao cérebro adulto, bem como organoides cerebrais 2D/3D derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Em conjunto, o protocolo possibilitou entender como e quando a assimetria de sinalização de Notch é estabelecida durante a DCA. O principal desafio para a implementação bem-sucedida deste protocolo é alcançar a entrega precisa de concentrações apropriadas do anticorpo com base em condições experimentais específicas.

<table><tbody><tr><td>Prato de cultura com fundo de vidro de 35mm&nbsp;</td><td>MatTek corporation</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>injetor de pressão de ar&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse-IgG-Atto647N&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50185</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Capilares, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, com filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-6</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 Disco Giratório/Alta Velocidade Widefield</td><td>Nikin</td><td>N/A</td><td>Nikon&nbsp; Microscópio de fluorescência invertida Ti com grande campo de visão confocal CSU-W1.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinças Médicas Dumont Estilo 5</td><td>Thomas Scientific</td><td>72877-D</td><td></td></tr><tr><td>Extrator P897</td><td>Sutter Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Micromanipuladores</td><td></td> Sigma-Aldrich M2773 <td></td></tr><tr><td></td><td>Mouse</td><td>anti-DLD WPI M3301R</td><td></td>da World Precision Instruments</tr><tr><td>;</td><td>Abcam</td><td>AB_1268496</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG bloqueando tampão de Zenon</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z25008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fenol vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000&nbsp; &nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>UltraPureTM baixo ponto de fusão agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de captação de anticorpos para rastreamento de endocitose notch/delta durante a divisão assimétrica de progenitores da glia radial de zebrafish

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

A divisão celular assimétrica (DCA), que produz duas células-filhas de destinos diferentes, é fundamental para gerar diversidade celular. Nos órgãos em desenvolvimento de invertebrados e vertebrados, a divisão assimétrica dos progenitores gera um Notchhi auto-renovador e um Notchlo diferenciando-se. No cérebro embrionário do peixe-zebra, os progenitores radiais da glia (RGPs) - as principais células-tronco neurais dos vertebrados - são submetidos principalmente à DCA para dar origem a um RGP e um neurônio diferenciador. A clareza óptica e a fácil acessibilidade dos embriões de peixe-zebra os tornam ideais para imagens in vivo de lapso de tempo para visualizar diretamente como e quando a assimetria da sinalização Notch é estabelecida durante a DCA. Estudos recentes têm mostrado que a endocitose dinâmica do ligante Notch DeltaD desempenha um papel crucial na determinação do destino celular durante a DAC, e o processo é regulado pelo regulador de polaridade conservado evolutivamente Par-3 (também conhecido como Pard3) e pelo complexo motor dineína. Para visualizar os padrões de tráfego in vivo de endossomos de sinalização de Notch em RGPs mitóticos, desenvolvemos este ensaio de captação de anticorpos. Usando o ensaio, descobrimos a dinamicidade dos endossomos contendo DeltaD durante a divisão do RGP.

Na Figura 2A, os embriões injetados com Atto647N, sem ligação com o anticorpo primário, mostraram fluorescência de fundo no ventrículo cerebral. Pouquíssimas partículas fluorescentes engolidas podem ser observadas nas células. Os embriões de peixe-zebra injetados com anti-Dld-Atto647N mostraram grandes quantidades de partículas fluorescentes internalizadas na maioria das células do prosencéfalo em desenvolvimento (Figura 2A, painel direito). Após zoom para focal...

Este trabalho desenvolve um ensaio de captação de anticorpos para obtenção de imagens da sinalização Notch/DeltaD intra-linhagem na divisão de progenitores radiais da glia do cérebro embrionário do peixe-zebra.

Ensaio de Captação de Anticorpos para Rastreamento de Endocitose Notch/Delta Durante a Divisão Assimétrica de Progenitores da Glia Radial de Zebrafish

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

A sinalização de entalhe controla a decisão e padronização do sulfato durante o desenvolvimento em metazoários. Desenvolvemos um ensaio de captação de anticorpos para marcar o ligante delta-D e obter imagens de seu tráfego endocítico em progenitores radiais da glia no prosencéfalo do peixe-zebra em desenvolvimento. A injeção ventricular oculta do peixe-zebra permite a captação seletiva de Anti-Dld-Atto-647N por progenitores da glia radial miotótica que revestem os ventrículos cerebrais em desenvolvimento com alta eficiência e efeitos duradouros.Este protocolo pode ser facilmente combinado com outras perturbações farmacológicas ou genéticas utilizadas em diferentes estágios de desenvolvimento e possivelmente adaptadas ao cérebro adulto, bem como organoides cerebrais 2D ou 3D derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Depois de gerar os embriões fertilizados e incubá-los por 18 a 20 horas, retire-os da incubadora. Observá-los sob um microscópio de epifluorescência usando luz branca primeiro a uma ampliação de 20 vezes.Descarte embriões mortos que pareçam turvos ou rompidos ao microscópio usando uma pipeta de vidro. Em seguida, ligue a lâmpada fluorescente e escolha a configuração do filtro RFP do microscópio. Selecione os embriões com fluorescência vermelha forte e transfira-os para um novo prato com água de ovo.Agora descorione os embriões manualmente com duas pinças finas sob luz branca. Segure o córion com um par de pinças e faça uma ruptura no córion com o outro fórceps. Abra a lágrima cuidadosamente usando a pinça e torne-a grande o suficiente para o embrião passar, empurrando suavemente o embrião com as pontas das outras pinças.Transfira os embriões descorionados para uma nova placa de Petri com meio embrionário fresco para um rápido enxágue antes da microinjeção. Depois de puxar agulhas de injeção finas em um puxador, abra a ponta da agulha com pinça sob um microscópio de dissecção estéreo. Faça o diâmetro da ponta em torno de 10 micrômetros e o ângulo de conicidade em torno de 30 graus.Agora misture 0,5 microlitros do anticorpo anti-Dld com dois microlitros do anticorpo anti camundongo L G Atto-647N, pipetando cinco a 10 vezes para conjugá-los e incubar à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Ao final da incubação, adicionar 2,5 microlitros de tampão bloqueador e 0,5 microlitros de vermelho de fenol 0,5% à mistura de anticorpos e misturar por pipetagem para bloquear quaisquer anticorpos não conjugados remanescentes na mistura. Em seguida, prepare a agarose de 1% de baixo ponto de fusão no meio embrionário.Aqueça a mistura contida em agarose a 70 graus Celsius até que a mistura fique transparente. Depois de aliquotar a solução de agarose, mantenha-os em um bloco de calor a 40 graus Celsius. Enxaguar o embrião no tubo contendo agarose de 1% de baixo ponto de fusão durante três segundos.Coloque o embrião em uma tampa de placa de Petri de plástico invertida com gotas individuais de agarose para montar cada embrião separadamente. Coloque os embriões lateralmente na agarose e mantenha esta posição até que a agarose se solidifique à temperatura ambiente. Cubra todos os embriões montados na agarose com meio de ovo.Coloque os embriões embutidos sob o microscópio estéreo e cubra a agarose com água de ovo. Ajuste o injetor de pressão de ar com micro manipuladores, colocando-os próximos aos microscópios. Use o cilindro de gás de aço contendo nitrogênio gasoso sob alta pressão como recurso de ar.Uma vez que os embriões tenham sido montados na agarose, abra a válvula de gás. Ao usar o módulo de enchimento frontal do microinjetor, faça o frontload da agulha de vidro preparada com dois microlitros de mistura de anticorpos no micromanipulador. Agora ajuste a pressão de entrada para 80 a 90 libras por polegada quadrada e a pressão de injeção para 20 libras por polegada quadrada.Calibrar o volume de injeção usando um micrômetro sob o microscópio. Ajuste a duração do tempo de sintonia de acordo com o tamanho da abertura da agulha de 10 a 120 milissegundos. Toque na pá para entregar cada pulso de injeção e ajuste o volume de injeção de cada entrega para quatro a cinco nanolitros.Em seguida, cutuque a ponta da agulha de microinjeção através da placa do teto dorsal do cérebro posterior, posterior ao ponto de dobradiça rondimere zero-one e injete cerca de 10 nanolitros de mistura de anticorpos sem atingir o tecido cerebral. Observado o fluxo de fluidos vermelhos no ventrículo cerebral. Após a injeção, remova a ponta da agulha do embrião rapidamente girando o botão do micromanipulador.Para uma injeção bem-sucedida, o corante vermelho da mistura injetada permanece no ventrículo cerebral de forma estável sem vazar para a agarose cercada. Mova a placa de montagem sob o microscópio para localizar outro embrião montado em uma posição adequada para repetições. Depois de injetar seis a oito embriões, descasque a agarose com uma faca microcirúrgica para liberar os embriões da agarose incorporada.Transfira os micro embriões injetados para um prato fresco com 30 mililitros de meio embrionário e coloque-os à temperatura ambiente para os próximos passos. Após 30 minutos, transferir os embriões selecionados para 10 mililitros de meio embrionário. Para montar os embriões, prepare agarose 0,8% de baixo ponto de fusão contendo a mesma concentração de tricane no tubo.Use uma pipeta de vidro para imergir os embriões injetados na agarose quente por três segundos. Em seguida, remova imediatamente os embriões da agarose com a mesma pipeta de vidro e coloque os embriões no centro de placas de cultura de fundo de vidro de 35 milímetros com uma gota de agarose do tubo. Oriente os embriões suavemente com uma sonda de fibra ou ponta de carregamento para manter o lado dorsal do cérebro embrionário o mais próximo possível do fundo de vidro.Vire a posição do embrião suavemente para estender o embrião sem enrolar à medida que a agarose se solidifica gradualmente. Depois, verifique a posição do embrião virando o prato de fundo de vidro. Certifique-se de que todo o prosencéfalo dorsal com os embriões corretamente montados possa ser visto ao microscópio.Adicione dois a três mililitros de meio embrionário pré-aquecido de 28,5 graus Celsius contendo tricane para cobrir o embrião. Coloque a placa corretamente no estágio de temperatura controlada do microscópio confocal e ajuste a temperatura da câmara de imagem para 28,5 graus Celsius. O embrião já está pronto para exames de imagem.Os embriões injetados com Atto-647N mostraram fluorescência de fundo no ventrículo cerebral. Os embriões de zebrafish injetados com anti-Dld-Atto-647N mostraram grandes quantidades de partículas fluorescentes internalizadas na maioria das células do prosencéfalo em desenvolvimento. Imagens de lapso de tempo mostraram o movimento de endossomos intracelulares Anti-Dld-Atto-647N durante a divisão celular.A maioria dos progenitores mitóticos da glia radial mostrou segregação assimétrica anterior ou posterior dos endossomos anti-Dld-Atto-647N em duas células-filhas. A assimetria estabilizou-se no final da anáfase, resultando em herança assimétrica dos endossomos de sinalização de entalhe pelas células filhas posteriormente. Certifique-se de que a agulha foi colocada no ventrículo oculto da marca no local certo e verifique se há algum vazamento após a microinjeção.Além da marcação da sinalização delta da incisura, o protocolo é aplicável para marcar outras proteínas de membrana ou proteínas extracelulares usando estratégias semelhantes, se um bom anticorpo para o domínio extracelular estiver disponível.

antibody-uptake-assay-for-tracking-notchdelta-endocytosis-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

Este vídeo demonstra um ensaio de captação de anticorpos para obter imagens da sinalização Notch/DeltaD em progenitores da glia radial do peixe-zebra. Envolve a montagem de embriões de peixe-zebra descorionados embebidos em agarose, a injeção de uma solução de corante direcionada a ligantes DeltaD em RGPs e imagens sob um microscópio de fluorescência para divisão celular assimétrica, confirmando a ativação da sinalização Notch / DeltaD.

Um ensaio de captação de anticorpos para sinalização de entalhe / DeltaD de imagem em progenitores de glia radial de peixe-zebra

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

Uma nova técnica para a detecção de receptores endógenos de baixa abundância presentes em embriões de peixe-zebra é descrita. Nós o chamamos de AFLIP porque consiste na marcação de afinidade do receptor por seu ligante ligado à imunoprecipitação.

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Immunolabeling métodos para analisar populações distintas de microtúbulos no cérebro em desenvolvimento zebrafish são descritos aqui, que são amplamente aplicáveis a outros tecidos. O primeiro protocolo descreve um método otimizado para immunolabeling estável e dinâmica de microtúbulos. O segundo protocolo fornece um método para a imagem e quantificar microtúbulos nascentes especificamente.

Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish

O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

Zebrafish visando eletrófilos reativos e oxidantes (Z-REX) é um método baseado em biologia química para a investigação da sinalização de pequenas moléculas reativas. Esta técnica pode ser aplicada a peixes vivos de diferentes estágios de desenvolvimento. Aqui, acoplamos ensaios padrão em zebrafish com Z-REX para análise de vias de sinalização.

Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Aprenda um ensaio de captação de anticorpos para rastrear a endocitose Notch/Delta em progenitores de glia radial de zebrafish. Este método permite visualizar a sinalização celular durante o desenvolvimento do cérebro embrionário com alta eficiência.

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