Montagem de lipossomas assistida por octanol on-chip para bioengenharia

OLA é uma plataforma microfluídica versátil útil para a comunidade de biologia sintética. em particular, para bioengenharia de células artificiais. Os lipossomas baseados em OLA podem nos ajudar a entender os princípios de auto-organização na biologia e construir montagens que imitam células.

O OLA produz lipossomas monodispersos, unilaminares, do tamanho de uma célula, de uma forma de alto rendimento e com uma excelente eficiência de encapsulação. Requer volumes de amostra muito pequenos, da ordem de 50 microlitros, e os lipossomas formados estão imediatamente disponíveis para experimentação adicional no chip. OLA é útil para estudar reações biológicas dentro de microconfinamentos, dinâmica de vesículas e condensados biomoleculares e suas interações com membranas.

O OLA também tem sido aplicado como uma plataforma de alto rendimento para triagem de medicamentos, por exemplo, para testar a permeabilidade e a atividade membranica de antimicrobianos. A funcionalização da superfície, que é o tratamento PV, é uma etapa crítica para o protocolo e precisa ser realizada cuidadosamente para evitar que a solução fotovoltaica entre na aqua interna e nos canais orgânicos carreadores de lipídios. Além disso, o canal de pós-produção deve ser apenas longo o suficiente para a separação das bolsas de octanol para formar lipossomas.

Ketan Ganar, estudante de doutorado do meu laboratório, ajudará Chang Chen a demonstrar o procedimento. Para começar, pegue um wafer de silício limpo de quatro polegadas de diâmetro e limpe-o ainda mais usando ar pressurizado para remover quaisquer partículas de poeira. Monte a bolacha em um revestidor giratório e distribua suavemente cerca de cinco mililitros de um fotorresiste negativo no centro da bolacha.

Para obter uma camada fotorresistente de 10 micrômetros de espessura, ajuste as configurações do spin coat em 500 RPM por 30 segundos com uma aceleração de 100 RRP por segundo para espalhamento inicial, seguido por um giro de 60 segundos a 3.000 RPM com uma aceleração de 500 RPM por segundo. Em seguida, gire a bolacha. Asse a bolacha em uma placa de aquecimento por dois minutos a 65 graus Celsius e, em seguida, por cinco minutos a 95 graus Celsius.

Assim que o wafer esfriar, monte o wafer na câmara de impressão da máquina de litografia óptica direita direta e alimente o conjunto de lipossomas assistido por octanol ou o design OLA no software. Uma vez que o design é impresso, asse a bolacha a 65 graus Celsius por um minuto, seguido de 95 graus Celsius por três minutos. Para lavar o fotorresistente não curado, mergulhe o wafer em um copo de vidro contendo a solução reveladora até que o fotorresistente não curado seja totalmente removido.

Asse o wafer a 150 graus Celsius por 30 minutos para garantir que o design impresso esteja firmemente preso à superfície do wafer e não saia no processo de fabricação a jusante. Para preparar o dispositivo microfluídico, coloque o wafer mestre em um pedaço quadrado de alumínio e envolva a folha de alumínio ao redor do wafer, formando uma estrutura bem parecida. Despeje suavemente a mistura de PDMS sobre o wafer mestre.

Incube o conjunto em um forno a 70 graus Celsius por pelo menos duas horas. Retire a bolacha mestra do forno e deixe esfriar. Para remover o polidimetilsiloxano solidificado, ou bloco PDMS, remova a folha de alumínio e, em seguida, descasque cuidadosamente o bloco PDMS da borda do wafer.

Pegue uma tampa de vidro transparente, despeje aproximadamente 0,5 mililitros de PDMS no centro da lâmina de vidro e espalhe-a pela tampa inclinando suavemente a lâmina de vidro, garantindo a cobertura total da lâmina de vidro com o PDMS. Monte a corrediça de vidro no revestidor de spin. Certifique-se de que ele esteja posicionado centralmente para que o meio da corrediça se sobreponha ao centro do eixo de pressão.

Em seguida, gire a lâmina de vidro a 500 RPM por 15 segundos a um incremento de 100 RPM por segundo e 1.000 RPM por 30 segundos a um incremento de 500 RPM por segundo. Coloque a lâmina de vidro revestida de PDM com o lado revestido voltado para cima em uma plataforma elevada como um bloco de PDMS em uma placa de Petri coberta. Asse a 70 graus Celsius por duas horas.

Coloque o bloco PDMS com os canais gravados voltados para cima e a lâmina de vidro revestida com PDMs com o lado revestido voltado para cima na câmara de vácuo do limpador de plasma. Ligue o vácuo e exponha o conteúdo ao plasma de ar a uma frequência de rádio de 12 mega-hertz por 15 segundos para ativar as superfícies. O plasma de oxigênio pode ser visto na forma de uma tonalidade rosada.

Imediatamente após o tratamento com plasma, coloque a lâmina de vidro revestida com PDMS em uma superfície limpa com o lado PDMS voltado para cima. Coloque suavemente o bloco PDMS com o padrão microfluídico agora voltado para a lâmina de vidro revestida com PDMS, permitindo que eles se unam. Asse os dispositivos colados a 70 graus Celsius por duas horas.

Distribua 200 microlitros de álcool polivinílico a 5%, ou solução OVA, em um tubo de 1,5 mililitro e conecte-o ao suporte do reservatório microfluídico. Introduzir o tubo de modo a que uma extremidade fique submersa na solução de PVA e a outra extremidade seja ligada à entrada do canal aquoso exterior do dispositivo microfluídico. Aumentar a pressão da fase aquosa externa para 100 milibares para escoar a solução de PVA nos canais aquosos externos.

Aumentar as pressões das fases orgânicas aquosas e lipídicas internas para 120 milibares para evitar o refluxo da solução de PVA dentro desses canais. Escoar a solução de PVA desta forma por aproximadamente cinco minutos, garantindo a completa funcionalização do canal de saída. Aumente a pressão nos canais aquosos internos e orgânicos carreadores de lipídios para duas barras para remover a solução de PVA e desconecte imediatamente a tubulação da entrada aquosa externa.

Simultaneamente, use uma tubulação conectada a um canal de pressão negativa para remover o excesso de PVA do canal de saída. Asse o aparelho a 120 graus Celsius por 15 minutos e deixe esfriar antes de usar. O dispositivo pode ser armazenado em condições ambientais por pelo menos um mês.

Distribua as soluções em três tubos de 1,5 mililitro e monte-os. Conecte-os ao chip microfluídico tratado com PVA e aplique pressão positiva nos três canais, cerca de 100 milibares nos canais orgânicos aquosos e carreadores de lipídios internos e cerca de 200 milibares no canal aquoso externo. Uma vez que todas as três fases comecem a cofluir na junção, assegure-se de que a produção de emulsão dupla comece e ajuste a pressão de acordo com sua qualidade.

À medida que as gotículas de emulsão dupla fluem, todas as bolsas de octanol se tornam cada vez mais proeminentes e, finalmente, são pinçadas, formando lipossomas. Uma imagem de campo brilhante da geração rápida de gotículas de emulsão dupla é mostrada aqui. O canal lipídico fluorescente mostra a formação de uma bolsa de octanol devido ao desumedecimento parcial.

O canal aquoso interno mostra o encapsulamento da proteína fluorescente amarela. A desumectação da bolsa de octanol no canal de saída que forma um lipossomo é mostrada nesta figura. Esta imagem representa o esquema da transição pH-dependente da solução homogênea de polilisina e ATP encapsulada dentro do lipossomo para coacervados de polilisina ATP separados por fase.

O ambiente ácido inicial no lipossoma torna a carga molecular do ATP neutra, inibindo a coacervação. Quando o pH dentro dos lipossomas se equilibra com o aumento do pH aplicado externamente, o ATP ganha uma carga negativa, desencadeando a coacervação. A distribuição espacial da polilisina e da membrana e as imagens de lapso de tempo da formação de coacervados de polilisina ATP dentro dos lipossomas são mostradas nesta figura.

A edição externa de um tampão básico eleva o nível de pH dentro dos lipossomas ao longo de minutos e inicia a coacervação. T igual a zero minutos refere-se ao tempo imediatamente anterior à ocorrência do primeiro evento de coacervação. Ao demonstrar o procedimento, é crucial ajustar pacientemente a pressão do canal para gerar uma produção constante de emulsão dupla.

OLA e suas variações têm sido empregadas em diversos estudos, por exemplo, crescimento e divisão de lipossomas compreendendo a dinâmica de condensados biomoleculares, expressão livre de células de proteínas, bem como encapsulamento de bactérias. Então, na contusão, acreditamos que o OLA é uma plataforma versátil para a biologia sintética.