Name: Ablação do Pedúnculo Ocular para Aumentar a Maturação Ovariana em Caranguejos da Lama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 28 s
Description: Aprenda a técnica de ablação do pedúnculo ocular para induzir a maturação ovariana em caranguejos da lama usando cauterização e cirurgia. Este método aumenta a taxa de maturação sem afetar a sobrevivência dos animais.

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Este estudo foi apoiado pelo Ministério da Educação, Malásia, no âmbito do programa Higher Institution Centre of Excellence (HICoE), Malásia, acreditado no Instituto de Aquicultura Tropical e Pesca, Universiti Malaysia Terengganu (Vot No. 63933 & Vot No. 56048). Agradecemos o apoio da Universiti Malaysia Terengganu e Sayap Jaya Sdn. Bhd. através da Bolsa de Pesquisa de Parceria Privada (Vot. No. 55377). Uma posição de bolsista acadêmico adjunto da Universiti Sains Malaysia para Khor Waiho e Hanafiah Fazhan também é reconhecida.

Este protocolo segue o Código de Prática da Malásia para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos delineado pela Associação de Ciência Animal de Laboratório da Malásia. O sacrifício das amostras experimentais foi feito de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, revisado em 1978). Caranguejos de lama fêmeas sexualmente pré-maduros ( S. olivacea) foram coletados no mercado local (5°66′62′′N, 102°72′33′′E) nas Zonas Húmidas de Setiu, na Malásia. As espécies de caranguejos lamacentos foram identificadas com base em característicasmorfológicas1.
1. Coleta e desinfecção de amostras
<ol><li>Coletar caranguejos fêmeas saudáveis, ativos e pré-maduros (Figura 1). NOTA: Caranguejos fêmeas pré-maduros têm abdômen triangular e de cor clara, juntamente com uma faixa de LC de 80 a 85 mm.</li>
	<li>Lave os caranguejos com água da torneira clorada (água doce) para remover detritos e parasitas osmofílicos.</li>
	<li>Mergulhe os caranguejos em formol de 150 ppm com salinidade de 20 ppt por 30 min.</li>
	<li>Manter a aeração contínua e suave com airstones durante o tratamento com formaldeído. A fonte de aeração pode ser de uma linha de aeração central ou de uma bomba de aerador de aquário.</li>
	<li>Lave os caranguejos com água do mar corrente para remover qualquer formaldeído residual.</li>
</ol><img alt="Comparação da morfologia do caranguejo fêmea pré-madura vs madura; referência de escala de tamanho incluída; biologia marinha." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65039/65039fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Morfologia abdominal de fêmeas de caranguejos de lama utilizados para identificar os estágios de maturação sexual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65039/65039fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Aclimatação
<ol><li>Transfira cada fêmea desinfetada para um tanque circular separado de 32 L.</li>
	<li>Crie as fêmeas por 3 dias em 20 ppt de salinidade e continue se alimentando duas vezes por dia (manhã 09:00 am e noite 20:00 pm) com peixes marinhos picados a cerca de 4%-5% do peso corporal do caranguejo.</li>
	<li>Retire o excesso e a ração não consumida por meio de sifões antes da alimentação matinal.</li>
	<li>Troque 10% da água do mar de criação de caranguejo (20 ppt) diariamente.</li>
</ol>3. Muda induzida para a maturidade sexual
<ol><li>Corte todas as pernas, exceto as pernas de natação usando tesoura esterilizada.<ol><li>Pegue o caranguejo com uma rede de coleta e segure o caranguejo com cuidado. Corte primeiro os dois quelípodos e depois as pernas de caminhada na segunda articulação usando uma tesoura. O caranguejo irá autotomizar os apêndices danificados automaticamente. A anestesia não é necessária para a autotomia do membro.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave o caranguejo em água doce imediatamente após a autotomia dos membros.</li>
	<li>Transfira individualmente os caranguejos autotomizados com membros para cestos plásticos perfurados (28 cm L x 22 cm W x 7 cm H) e coloque-os em um tanque de fibra de vidro (305 cm L x 120 cm W x 60 cm H). NOTA: Dois cestos podem ser amarrados e cortados juntos. A cesta superior é usada como cobertura para que o caranguejo não possa escapar da cesta.</li>
	<li>Use um sistema de aquicultura recirculante (RAS) com 20 ppt de salinidade e uma profundidade de água de pelo menos 10 cm para garantir que todo o cesto de plástico fique submerso.</li>
	<li>Continue alimentando a fêmea de caranguejo autotomizado com peixes marinhos picados duas vezes por dia a 5% a 7% do peso corporal do caranguejo.</li>
	<li>Criar os caranguejos até amadurecer sexualmente através de muda (35 dias). NOTA: A muda induzida pode ser ignorada para maturação ovariana comercial e produção de sementes com caranguejos de lama fêmeas maduras selvagens. Fêmeas maduras colhidas da natureza devem ser aclimatadas e submetidas diretamente à anestesia por choque frio e subsequente ablação do pedúnculo ocular.</li>
</ol>4. Anestesia
<ol><li>Selecionar fêmeas sexualmente maduras com retalho abdominal ovalado de coloração escura com LC &gt;86 mm (Figura 1).</li>
	<li>Pegue os caranguejos com uma rede de coleta e mantenha-os individualmente em pequenos aquários para anestesia.</li>
	<li>Após 5 min do período de aclimatização, adicionar 2-fenoxietanol (2-PE) a 2 mL/L em cada aquário e permitir 15 min de tratamento anestésico.</li>
	<li>Certifique-se de que os caranguejos estejam totalmente anestesiados pela falta de movimento espontâneo.</li>
</ol>5. Ablação do pedúnculo ocular
<ol><li>Técnica de cauterização<ol><li>Execute todos os procedimentos em cima de uma mesa e em uma área aberta.</li>
		<li>Pegue uma haste de metal de níquel-aço de cabeça plana (por exemplo, uma chave de fenda) com uma alça de madeira ou plástico e cubra a alça com uma toalha de algodão molhada.</li>
		<li>Esterilizar duas pinças cirúrgicas inoxidáveis em autoclave.</li>
		<li>Prepare etanol 70% em um borrifador e mantenha-o longe de quaisquer fontes relacionadas ao fogo, como maçarico e chave de fenda vermelha quente. Tenha papel higiênico pronto para uso. NOTA: O etanol é altamente inflamável. Mantenha uma distância segura das fontes de incêndio.</li>
		<li>Conecte um maçarico a um botijão de gás (butano) com segurança. CUIDADO: Siga as instruções sobre o maçarico e o cilindro de gás. Certifique-se de que o maçarico está desligado ao conectar com o cilindro de gás. Leia e siga todas as precauções de segurança contra incêndio mencionadas no botijão de gás.</li>
		<li>Use luvas grossas de algodão para evitar ferimentos causados por objetos quentes.</li>
		<li>Sujeite a ponta da haste metálica ao fogo do maçarico até que a haste metálica fique vermelha brilhante.</li>
		<li>Cubra o caranguejo anestesiado com uma toalha de algodão molhada. OBS: Cubra as antenas do caranguejo para evitar danos desnecessários.</li>
		<li>Segure um olho do caranguejo com pinça esterilizada. OBS: Esterilizar a pinça em autoclave para primeiro uso e desinfetar com etanol 70% para posterior uso em outros caranguejos.</li>
		<li>Segure a ponta plana de metal quente no olho do caranguejo e pressione levemente por cerca de 10 a 15 s até que o talo do olho fique com uma cor laranja ou laranja-avermelhada. Tenha cuidado ao realizar esta etapa para evitar danos às estruturas adjacentes. OBS: Duas pessoas são necessárias para realizar a ablação do pedúnculo ocular seguindo o método de cauterização: uma para segurar o caranguejo e outra para realizar o procedimento de ablação.</li>
		<li>Desinfete a pinça com spray de etanol 70% para garantir que não haja contaminação cruzada entre caranguejos. NOTA: Só execute esta etapa pelo menos aguardar 5 minutos após o procedimento de ablação do pedúnculo ocular para garantir que a pinça seja resfriada antes da desinfecção usando etanol 70% para evitar possíveis riscos de incêndio.</li>
		<li>Depois de realizar a ablação do pedúnculo ocular em todos os caranguejos, mergulhe a haste de metal de aço níquel quente (chave de fenda) em água da torneira.</li>
		<li>Desinfete a toalha antes de reutilizar. Várias toalhas podem ser usadas para economizar tempo. NOTA: Lave a toalha com água da torneira e mergulhe-a em água clorada de 30 ppm por 5 min. Em seguida, lave a toalha com água da torneira novamente e mergulhe-a em uma solução de tiossulfato de sódio a 1 g/L.</li>
		<li>Mantenha o maçarico em um local seguro depois de desligá-lo e aguarde até que ele retorne à temperatura ambiente (cerca de 30 min) antes de desconectar.</li>
	</ol></li>
	<li>Técnica cirúrgica<ol><li>Realize o procedimento em uma área bem ventilada.</li>
		<li>Esterilizar duas tesouras cirúrgicas e pinças em autoclave.</li>
		<li>Despeje 50 mL de etanol a 70% em um copo de vidro de 100 mL.</li>
		<li>Use luvas grossas de algodão.</li>
		<li>Segure o caranguejo anestesiado e cubra-o com uma toalha de algodão molhada.</li>
		<li>Segure um olho do caranguejo com pinça esterilizada.</li>
		<li>Corte rapidamente o pedúnculo ocular usando tesoura cirúrgica esterilizada. NOTA: A hemolinfa pode ser perdida da parte ferida do caranguejo.</li>
		<li>Mergulhe a tesoura e a pinça em etanol 70% após cada uso e seque-as com papel higiênico antes de reutilizá-las.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Cuidados pós-anestésicos
<ol><li>Prepare 20 ppt de água do mar filtrada e mantenha em um tanque aéreo com aeração contínua.</li>
	<li>Conecte um tubo flexível com o tanque superior para o fluxo gravitacional de água.</li>
	<li>Imediatamente após a ablação do talo ocular, coloque o caranguejo no cesto e submeta o caranguejo à água do mar corrente (temperatura da água ambiente: 28 °C) do tanque superior.</li>
	<li>Mantenha a água do mar fluindo e monitore o caranguejo até que ele possa se mover espontaneamente, o que indica recuperação da anestesia. NOTA: A água do mar pode ser preparada em um tanque de solo, e uma bomba de água submersível pode ser usada para o fluxo de água.</li>
	<li>Mantenha os caranguejos individualmente em água do mar de 20 ppt com aeração em um aquário por 30 min para observação adicional. OBS: Os caranguejos recuperados serão cultivados individualmente no processo de cultivo subsequente de matrizes.</li>
</ol>7. Observação da maturação ovariana
<ol><li>Criação de matrizes<ol><li>Transfira os caranguejos maduros para tanques circulares individuais de 32 L.</li>
		<li>Continue a alimentação com peixes marinhos picados (congelados a -20 °C) duas vezes por dia (manhã 09:00 am e noite 20:00 pm), e remova a ração não consumida antes da alimentação matinal.</li>
		<li>Criar o reprodutor individualmente por 30 dias em salinidade de 20 ppt.</li>
		<li>Retire as fezes e troque 10% da água do mar (20 ppt) diariamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção<ol><li>Limpe uma bandeja dissecante, tesoura e pinça com etanol 70%.</li>
		<li>Anestesiar as fêmeas individualmente com o método de anestesia de imersão em 2-PE.</li>
		<li>Selecionar aleatoriamente fêmeas recém-maduras (após a muda de fêmeas pré-maduras) que não passaram pela ablação do pedúnculo ocular para confirmar seus estágios gonadais.</li>
		<li>Sacrificar individualmente todas as fêmeas experimentais ablativas com o olhículo e identificar os estágios de maturação das gônadas. Destrua os gânglios torácicos do caranguejo usando uma ave estéril afiada. Remova a carapaça superior primeiro e, em seguida, o hepatopâncreas para tornar o ovário visível. Observe a coloração dos ovários e identifique o estágio de maturação ovariana (Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Identificação dos estágios de maturação ovariana<ol><li>Observe a cor do ovário a olho nu ou sob um estereomicroscópio.</li>
		<li>Identificar os estágios de maturação ovariana com base na coloração30: o imaturo (estágio-1) apresenta uma cor branca translúcida ou cremosa; o início da maturação (estágio-2) apresenta coloração pálida a amarelada clara; (iii) o pré-maturação (estágio 3) apresenta coloração amarela a laranja claro; e (iv) o totalmente amadurecido (estágio-4) apresenta coloração laranja-escura a avermelhada.</li>
	</ol></li>
</ol>

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse.

Este protocolo foi desenvolvido para a ablação do pedúnculo ocular do caranguejo-da-lama, Scylla spp., e pode ser aplicado como um método eficiente para induzir a maturação gonadal. Este protocolo pode ser facilmente replicado para a maturação comercial dos ovários de caranguejos lama e pode ser implementado para reduzir o período latente (tempo de uma desova para outra) na produção de sementes de caranguejo lama.
A ablação do pedúnculo ocular de crustáceos (i.e., camarão de água doce...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65039">Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs</a>. The Introduction, Protocol, Discussion and References were&#160;updated.

Erratum: Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs

Todas as quatro espécies de caranguejos pertencentes ao gênero Scylla são espécies de crustáceos comercialmente importantes na aquicultura 1,2. O crescimento de crustáceos, incluindo caranguejos da lama, e sua transformação da fase pré-madura (sub-adulta ou púbere) para a fase sexualmente madura (adulta) ocorrem através de um processo de muda que envolve a eliminação periódica de exoesqueletos mais velhos e menores. A largura da carapaça (LC), as morfologias dos quelípodos e dos retalhos abdominais são amplamente utilizadas para determinar a maturidade sexual de Scylla spp. 3,4,5. O processo de muda é regulado pela ação de vários hormônios e requer uma enorme quantidade de energia6. Além do processo normal de muda, a perda de membros, voluntária ou induzida por fatores externos, agiliza a muda dos caranguejos sem afetar sua taxa de sobrevivência 7,8,9. Portanto, a autotomia de membros é comumente utilizada para indução de muda na indústria de criação de caranguejos de casca mole 7,9.
A ablação unilateral ou bilateral do pedúnculo ocular é mais popular em camarões de água doce e camarões marinhos para maturação de gônadas e produção de sementes10,11,12,13. Técnicas comuns de ablação de pedúnculo ocular em crustáceos incluem: (i) ligadura na base do pedúnculo ocular com corda14,15; (ii) cauterização do pedúnculo ocular com pinça quente ou eletrocautério16; (iii) remoção ou pinçamento direto do pedúnculo ocular para deixar a ferida aberta12; e (iv) remoção do conteúdo do pedúnculo ocular por incisão após corte da porção distal do olho com navalha17. Os órgãos X do pedúnculo ocular são importantes órgãos endócrinos em crustáceos, pois regulam os hormônios hiperglicêmicos (CHH) dos crustáceos, os hormônios inibidores da muda (MIH) e os hormônios inibidores da vitelogênese (VIH)6,18,19,20,21,22. Os órgãos X do pedúnculo ocular (ou complexo da glândula sinusal) sintetizam e liberam hormônios inibidores das gônadas (GIH), também conhecidos como hormônios inibidores da vitelogênese (VIH), pertencentes à família dos hormônios neuropeptídeos6. A ablação unilateral ou bilateral do pedúnculo ocular reduz a síntese de GIH, resultando na dominância de hormônios estimulantes (i.e., hormônios estimulantes das gônadas, GSH) e na aceleração do processo de maturação ovariana em crustáceos23,24,25,26. Sem a influência do GIH após a ablação do pedúnculo ocular, crustáceos fêmeas dedicam sua energia ao desenvolvimento ovariano27. Verificou-se que a ablação unilateral do pedúnculo ocular é suficiente para a indução da maturação ovariana em crustáceos11 e que o pedúnculo ocular ablado de camarões e caranguejos pode se regenerar após várias mudas28. Há quatro estágios de desenvolvimento ovariano registrados em Scylla spp.: i) imaturo (estágio-1), ii) maturação precoce (estágio-2), iii) pré-maturação (estágio-3) e iv) totalmente maduro (estágio-4)29,30. O estágio ovariano imaturo é encontrado em fêmeas imaturas. Após a muda puberal e o acasalamento, o ovário imaturo começa a se desenvolver e finalmente amadurece (estágio 4) antes da desova31.
Um protocolo de ablação ocular é essencial para o desenvolvimento de matrizes de caranguejo e produção de sementes. No mercado global de alimentos, caranguejos maduros com ovários totalmente maduros (estágio 4) em vez de caranguejos com maior teor muscular são preferidos pelos consumidores e, portanto, têm um valor comercial mais alto, até mesmo maior do que os machos grandes. Não há um protocolo completo para a ablação ocular de caranguejos da lama. O protocolo de ablação do pedúnculo ocular neste trabalho minimiza o estresse com o uso de caranguejos totalmente anestesiados e minimiza os danos físicos causados às mordidas de caranguejos. Este protocolo é fácil e econômico. Apresentamos um protocolo para a ablação do pedúnculo ocular de Scylla spp., que pode induzir a maturação da gônada. Duas técnicas de ablação do pedúnculo ocular (cauterização e cirurgia) foram testadas e suas eficiências comparadas com base na taxa de desenvolvimento gonadal de fêmeas de caranguejos da lama.

<table><tbody><tr><td>Tubo de aeração&nbsp;</td><td>Ming Yu Three</td><td>N/A</td><td>aquário e pet shop</td></tr><tr><td>Airstone</td><td>Ming Yu Three</td><td>N/A</td><td>aquário e pet shop</td></tr><tr><td>Máquina de autoclave</td><td>HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION</td><td>N/A</td><td>MADE IN JAPAN</td></tr><tr><td>Pó de branqueamento (Hi-Chlon 70%)</td><td>Nippon Soda Co.Ltd,Japan</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Blow torch&nbsp;</td><td>MR D.I.Y. Group Berhad</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tanque circular (32L)</td><td>BEST PLASTIC INDUSTRY SDN. BHD.&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Luvas de mão de algodão (grossas)&nbsp;</td><td>MR D.I.Y. Group Berhad</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Toalha de algodão</td><td>MR D.I.Y. Group Berhad</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Termômetro digital</td><td>Hanna Instrument</td><td>HI9814</td><td>Hanna&nbsp; Instrumentos&nbsp; GroLine Hydroponics Impermeável pH / EC / TDS / Temp. Medidor portátil HI9814</td></tr><tr><td>Paquímetro Digital</td><td>INSIZE Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de dissecação</td><td>Hatcheri AKUATROP&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Centro de Pesquisa da Universiti Malaysia Terengganu</td></tr><tr><td>Frasco conta-gotas/Pipetas de Plástico Conta-gotas</td><td>Shopee Malásia</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>033361.M1</td><td>Diluído a 70% usando água destilada dupla</td></tr><tr><td>Tanque de fibra de vidro (1 ton)</td><td>Hatcheri AKUATROP&nbsp;</td><td>N / A</td><td>Centro de Pesquisa da Universiti Malaysia Terengganu</td></tr><tr><td>Areia fina</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>coletado da praia do mar da Universiti Malaysia Terengganu Kits de</td></tr><tr><td>primeiros socorros</td><td>Watsons Malásia</td><td>N / A</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Haste de metal de aço níquel de cabeça chata (chave de fenda)</td> <td>MR D.I.Y. Group Berhad</td><td>N / A</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>119690010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de gás (gás butano) para maçarico</td><td>MR D.I.Y. Group Berhad</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pistola de isqueiro a gás (cabeça longa)</td><td>MR D.I.Y. Group Berhad</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Copo de vidro (100 mL))</td><td>Corning Life Sciences</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>Saco de gelo&nbsp;</td><td>Watsons Malaysia</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cestos de plástico perfurados&nbsp;</td><td>Eco-Shop Marketing Sdn. Bhd.</td><td>Tubo de PVC</td> N <td>/ A N / A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Refratômetro</td><td>ATAGO CO., LTD.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador</td><td>Sharp Corporation Japão</td><td>N/A</td><td>Freezer Horizontal SHARP 110L - SJC 118</td></tr><tr><td>Rede de colher</td><td>MR D.I.Y. Group Berhad</td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Seawater</td><td>Hatcheri AKUATROP&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Centro de Pesquisa da Universiti Malaysia Terengganu</td></tr><tr><td>Tubo de sifão</td><td>MR D.I.Y. Group Berhad</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Frasco de spray</td><td>Mr. DIY Sdn Bhd</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica de aço inoxidável&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica de aço inoxidável&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Bomba de água submersível&nbsp;</td><td>Modelo AS</td><td>N/A</td><td>: Astro 4000</td></tr><tr><td>Tintura de solução de iodo&nbsp; (Iodo de Povidona)</td><td>Farmasi Fajr Sdn Bhd</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Papel de seda&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Aquário de plástico transparente</td><td>Ming Yu Três</td><td>N/A</td><td>aquário e pet shop</td></tr><tr><td>Mesa impermeável</td><td>Hatcheri AKUATROP&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Centro de Pesquisa da Universiti Malaysia Terengganu</td></tr></tbody></table>

ablação do pedúnculo ocular para aumentar a maturação ovariana em caranguejos da lama

Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs

Caranguejos da lama (Scylla spp.) são espécies de crustáceos comercialmente importantes que podem ser encontrados em toda a região do Pacífico Indo-Ocidental. Durante o cultivo, a indução da maturação ovariana é importante para atender à demanda dos consumidores por caranguejos maduros e acelerar a produção de sementes. A ablação do pedúnculo ocular é uma ferramenta eficaz para melhorar a maturação ovariana em caranguejos da lama. No entanto, não existe um protocolo padrão para a ablação do pedúnculo ocular de caranguejos da lama. Neste estudo, duas técnicas de ablação do pedúnculo ocular são descritas: cauterização (uso de metal quente para abater o pedúnculo ocular de um caranguejo anestesiado) e cirurgia (remoção do pedúnculo ocular com tesoura cirúrgica). Antes da ablação do pedúnculo ocular, fêmeas sexualmente maduras (LC > 86 mm) foram anestesiadas com uma bolsa de gelo (−20 °C) com água do mar. Quando a temperatura da água atingiu 4 °C, a bolsa de gelo foi removida da água. Água do mar corrente (temperatura ambiente: 28 °C) foi usada para recuperação da anestesia imediatamente após a ablação do pedúnculo ocular. A mortalidade não ocorreu durante ou após o processo de ablação do pedúnculo ocular. O protocolo de ablação do pedúnculo ocular aqui apresentado acelerou a maturação ovariana dos caranguejos da lama.

Maturação gonadal Tecidos ovarianos brancos cremosos (ovários imaturos, estágio 1) foram encontrados em 100% das fêmeas dissecadas (n = 6) antes da realização da ablação do pedúnculo ocular (Figura 2). A taxa de maturação gonadal das fêmeas de caranguejos com haste ocular (n = 63; 31 fêmeas com a técnica de cauterização e 32 fêmeas com a técnica cirúrgica) foi maior em comparação com as fêmeas que não foram submetidas à ablação do pedúnculo ocular (n = 31) após 30 dias de...

Dois protocolos de ablação de pedúnculo ocular (isto é, cauterização e abordagens cirúrgicas) foram realizados em caranguejos fêmeas anestesiados. A ablação ocular de caranguejos de lama acelerou o amadurecimento dos ovários sem diminuir a taxa de sobrevivência.

Ablação do Pedúnculo Ocular para Aumentar a Maturação Ovariana em Caranguejos da Lama

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the ...

O protocolo descrito minimiza o estresse durante a ablação do pedúnculo ocular de caranguejos da lama, reduzindo a ocorrência de mortalidade por ablação do pedúnculo ocular. A eficiência do tempo é a chave para minimizar o estresse dos animais. Certifique-se de que tudo está preparado antes de realizar o procedimento.Comece lavando os caranguejos fêmeas saudáveis, ativos e prematuros com água da torneira clorada para remover quaisquer detritos e parasitas. Mergulhe os caranguejos em formol por 30 minutos. Garantir aeração contínua e suave com pedras de ar durante o tratamento com formaldeído.Em seguida, use água do mar corrente para lavar os caranguejos para remover qualquer formaldeído residual. Para realizar a cauterização do talo do caranguejo, comece aquecendo a ponta de uma haste de metal com um maçarico até que a haste fique vermelha brilhante. Cubra um caranguejo anestesiado com uma toalha de algodão molhada e segure um olho do caranguejo com pinça esterilizada.Pressione a ponta de metal quente vermelho no olho do caranguejo por cerca de 10 a 15 segundos até que o olho fique com uma cor laranja ou laranja avermelhada. Desinfete as pinças com etanol 70% e limpe-as com papel higiênico estéril para garantir que não haja contaminação cruzada entre caranguejos. Depois de realizar a ablação em todos os caranguejos, mergulhe a haste de metal na água da torneira.Para realizar a ablação cirúrgica, segure o caranguejo anestesiado usando luvas grossas de algodão e cubra-o com uma toalha de algodão molhada. Use pinças estéreis para segurar um olho do caranguejo e corte rapidamente o talo ocular com tesoura cirúrgica. No pós-operatório, prepare um tanque aéreo com 20 partes por mil de água do mar filtrada com aeração contínua.Conecte um tubo flexível com o tanque para fluxo de água gravitacional. Coloque o caranguejo em uma cesta e submeta-o à água do mar fluindo do tanque superior. Monitore o caranguejo sob a água do mar até que ele possa se mover espontaneamente.Coloque os caranguejos individualmente em outro aquário com água do mar por 30 minutos para observação posterior. Selecionar aleatoriamente fêmeas recém-maduras que não tenham sido submetidas à ablação do pedúnculo ocular. Após a remoção da carapaça superior e do hepatopâncreas, observar e identificar o estágio de maturação do ovário do caranguejo.Os estágios de maturação ovariana podem ser identificados com base em sua coloração, sendo o estágio imaturo um branco translúcido ou cremoso, o estágio inicial de maturação dois sendo pálido a amarelo claro, o estágio pré-maturado três sendo amarelo a laranja claro, e o estágio quatro totalmente maduro sendo de cor laranja escura a avermelhada. A taxa de maturação das gônadas foi maior nas fêmeas com haste ocular em relação às que não foram abladas. A maior porcentagem de ovários em estágio três foi encontrada em caranguejos fêmeas com haste ocular.A análise de variância one-way mostrou diferenças significativas entre os estágios de maturação ovariana das fêmeas experimentais. O grupo controle apresentou maior prevalência de fêmeas imaturas em relação aos grupos ablados. Apenas os grupos ablados foram capazes de produzir caranguejos fêmeas estágio quatro a partir de um estágio imaturo 30 dias após o tratamento.É importante garantir que o pedúnculo ocular do caranguejo de lama tenha sido totalmente ablado, após a técnica de cauterização ou cirurgia. A ablação ocular permite que os criadores de crustáceos induzam a maturação e a muda ovariana facilmente. Também permite que os pesquisadores investiguem mais a fundo o papel do pedúnculo ocular na regulação da reprodução do caranguejo da lama.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

O hawaiensis anfípode Parhyale é um organismo modelo promissor para estudos de embriologia e desenvolvimento crustáceo artrópodes comparativa e evolução. Este protocolo descreve um método para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem precoces de Parhyale.

Ablação de uma única célula de oito células de embriões de Crustáceo anfípodes<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Descrevemos métodos de manipulação de oócitos imaturos de Xenopus laevis, maturação in vitro de oócitos em óvulos e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite a degradação de algumas proteínas maternas e a superexpressão de genes de interesse na fertilização e, portanto, é valioso para estudar papéis de fatores específicos no desenvolvimento embrionário inicial.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Descrevemos um sistema de capas de oócitos e animais de Xenopus para a clonagem de expressão de genes capazes de induzir uma resposta em ectoderma competente, e discutimos técnicas para a análise subsequente de tais genes. Este sistema é útil na identificação funcional de uma ampla gama de produtos gênicos.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

O estudo da biologia dos anfíbios fornece informações valiosas sobre os processos reprodutivos, fisiológicos, embriológicos e de desenvolvimento que impulsionam os organismos de muitos grupos taxonômicos. Aqui, apresentamos um guia abrangente sobre diferentes metodologias que podem ser usadas para estudar o controle e o monitoramento ovariano em anfíbios.

Técnicas reprodutivas para monitoramento e controle ovariano em anfíbios

Este protocolo descreve abordagens para detecção e quantitação de grandes extrusões agregadas e/ou organelas (~4 μm) produzidas por células C. elegans na forma de exóferas ligadas à membrana. Descrevemos tensões, condições de crescimento, critérios de pontuação, considerações de tempo e microscopia necessárias para facilitar a dissecção desse mecanismo de expulsão de detritos.

Abordagens Quantitativas para Pontuação in vivo Neuronal Aggregate e Extrusão organela em Grandes Vesículas Exofer em C. elegans

Este protocolo descreve a construção de um sistema de microinjeção de baixo custo, sua implantação estereotaxa em estruturas cerebrais profundas e o procedimento para microinjeções cronometradas de tetrodotoxina em ratos acordados e desenfreados. O objetivo é revelar a participação de estruturas hipotalâmicas na regulação da ovulação inibindo sua atividade neural.

Desvendando o papel das áreas discretas do cérebro de rato na regulação da ovulação através da inativação reversível por microinjeções de tetrodotoxinas

Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

O protocolo demonstra um método de dissecação simples e fácil, adequado para fêmeas de insetos migratórios selvagens capturadas com armadilhas de holofotes. Esta técnica pode esclarecer significativamente a mesma espécie comparando ambos os tecidos reprodutivos, ou seja, o saco de acasalamento e o desenvolvimento ovariano de fêmeas de insetos selvagens.

Dissecção e classificação do desenvolvimento ovariano em fêmeas selvagens

Este protocolo estabelece métodos para extrair e quantificar as respostas ao feromônio sexual volátil em C. elegans, fornecendo ferramentas para estudar a comunicação química e a trajetória de navegação.

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Aqui, apresentamos protocolos e ferramentas para visualizar o cálcio durante a fertilização e embriogênese inicial usando um repórter de cálcio geneticamente codificado expresso na linha germinativa do nematóide modelo C. elegans.

Visualização in vivo de transientes de cálcio durante a fertilização e desenvolvimento inicial em C. elegans

Aprenda a técnica de ablação do pedúnculo ocular para induzir a maturação ovariana em caranguejos da lama usando cauterização e cirurgia. Este método aumenta a taxa de maturação sem afetar a sobrevivência dos animais.

Ablação do Pedúnculo Ocular para Aumentar a Maturação Ovariana em Caranguejos da Lama

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