Estabelecimento, Manutenção, Diferenciação, Manipulação Genética e Transplante de Organoides de Glândulas Lacrimais de Camundongos e Humanos

Com organoides da glândula lacrimal, pode-se olhar para como certos genes controlam a homeostase da glândula lacrimal. Além disso, os organoides podem ser usados para medicina regenerativa. A principal vantagem da tecnologia organoide da glândula lacrimal derivada de células-tronco adultas é que ela permite o crescimento e o estudo de células epiteliais saudáveis e não transformadas da glândula lacrimal.

Esses organoides poderiam eventualmente ser usados para tratar pacientes com doença do olho seco. Comece preparando o meio e o material necessários para o experimento, seguido pela combinação de todos os componentes do meio de digestão antes do experimento. Pré-molhe os bisturis neste meio para evitar que pedaços de tecido grudem neles.

Recupere o tecido da glândula lacrimal do camundongo do meio, coloque-o na placa de Petri e pique-o usando bisturis pré-molhados. Quando os pedaços de tecido tiverem menos de 0,5 milímetros cúbicos, raspe-os da placa de Petri com o bisturi e transfira-os para um tubo de 15 mililitros contendo o meio de digestão. Para uma biópsia humana muito pequena, coloque-o diretamente no meio de digestão sem picar.

Incube o tubo de 15 mililitros com pedaços de tecido por até 15 minutos em banho-maria de 37 graus Celsius. Enquanto isso, reduza uma ponta de pipeta Pasteur em uma chama e pré-molhe-a no meio de base. Para facilitar o processo de dissociação, pipetar a mistura picada para cima e para baixo a cada cinco minutos com a pipeta Pasteur pré-molhada e estreitada.

Quando muitas células únicas e pequenos aglomerados são visíveis sob o microscópio, pare a dissociação adicionando 10 mililitros do meio base. Depois de girar a 400g por cinco minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros do meio base para repetir a lavagem e pellet para baixo das células. Remova os pedaços de tecido grandes e não digeridos e as fibras de colágeno remanescentes filtrando a mistura picada através de um filtro de 70 micrômetros.

Gire o eluato a 400g por cinco minutos. Após a remoção do sobrenadante, ressuspender o pellet de células em 100 microlitros de matriz extracelular fria, ou MEC, para uma única glândula lacrimal de camundongo e 50 microlitros de MEC fria para biópsia humana, sem criar as bolhas. Seme até 100 microlitros de células por poço de uma placa de suspensão de 12 poços usando um P200 para fazer gotículas de aproximadamente 20 microlitros no poço.

Coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos para permitir a solidificação da MEC. Uma vez que o ECM esteja solidificado, adicione aproximadamente um mililitro de meio de expansão do mouse à temperatura ambiente por poço de uma placa de 12 poços. Preparar na hora um mililitro de meio de diferenciação humana contendo componentes individuais que induzem a secreção pelos organoides da glândula lacrimal.

Em um microscópio automatizado de time-lapse de campo claro, defina as posições a serem fotografadas na placa, o intervalo de tempo de cinco minutos e a duração de quatro horas. Certifique-se de que uma gotícula ECM inteira esteja visível em cada posição. Antes de iniciar a obtenção de imagens, remova o meio de cultura dos poços a serem fotografados sem mover a placa do microscópio e substitua-o pelo meio de diferenciação humana recém-preparado e bem ressuspenso contendo compostos, incluindo forskolina e noradrenalina.

Como controle negativo, inclua um poço com meio de diferenciação atualizado. Clique no botão Executar no microscópio e analise os resultados após quatro horas. Após dissociar os organoides mencionados no texto, descarte o sobrenadante.

Ressuspender as células em 80 microlitros de tampão de eletroporação. Em um tubo de 1,5 mililitro, prepare os plasmídeos necessários para o experimento. Adicione os plasmídeos às células e misture bem, pipetando para cima e para baixo.

Configure o eletroporador com os parâmetros para o pulso de poring e o pulso de transferência. Coloque as células com os plasmídeos em uma cubeta de eletroporação. Meça imediatamente a resistência, que deve estar entre 0,3 amperes e 0,55 amperes, e eletropore imediatamente.

Uma vez feito, transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro e adicione 400 microlitros de tampão de eletroporação suplementado com um inibidor de Rho-quinase. Deixe que as células se recuperem à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, pastilha as células a 500g por cinco minutos.

Após o descarte do sobrenadante, plaquear as células em 200 microlitros de MEC. Após a solidificação, adicione o meio de expansão do mouse. Para a preparação de organoides, dividir os organoides da glândula lacrimal humana aproximadamente três dias antes do dia do transplante.

Para extrair os organoides da MEC, adicione dispase ao meio de cultura para atingir uma concentração final de 0,125 unidades por mililitro e ressuspenda completamente as gotículas da MEC para interrompê-las usando um P1000. Coloque a placa de volta na incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos. Ressuspenda os organoides em 10 mililitros de meio base para lavar a enzima.

Após peletização das células a 400g por cinco minutos, ressuspendê-las em 50 microlitros de meio de expansão humano a frio suplementado com 5% de MEC. Coloque a suspensão organoide no gelo e proceda imediatamente ao transplante. Para transplante ortotópico em camundongos, aspirar a suspensão organoide em uma agulha de insulina.

Quando o rato estiver dormindo, coloque-o rapidamente de lado com a glândula lacrimal principal acessível. Injetar cinco microlitros da suspensão organoide diretamente através da pele na glândula lacrimal. Permita que o mouse se recupere e avalie a presença de qualquer desconforto relacionado ao transplante diariamente, especialmente no olho.

Após a dissecção da glândula lacrimal de camundongos, a digestão enzimática e mecânica gerou pequenos fragmentos de tecido, incluindo os ácinos e os ductos. Na derivação organoide da glândula lacrimal de camundongo com sucesso, organoides císticos de aproximadamente 500 micrômetros de diâmetro foram encontrados após sete dias. Os organoides da glândula lacrimal humana cresceram como cistos dentro de três a quatro dias e atingiram um tamanho completo em 10 a 14 dias após o isolamento do tecido.

Após cinco dias e sete dias, respectivamente, no meio de diferenciação, os organoides das glândulas lacrimais de camundongos e humanos tornaram-se mais densos. A aplicação do ativador cíclico AMP forskolina ou o neurotransmissor noradrenalina resultou em inchaço organoide em menos de três horas. Na eletroporação bem-sucedida, organoides resistentes à higromicina cresceram.

Os clones organoides em crescimento maiores que 300 micrômetros foram colhidos antes de sua diferenciação. A amplificação por PCR do locus Pax6 alvo de RNA-guia produziu uma banda de 367 pares de bases para todos os clones selecionados. Um clone homozigoto knockout da glândula lacrimal de camundongos de seis sequenciados foi obtido usando o RNA guia direcionado para Pax6.

Alguns clones cresceram bem, mas alguns clones organoides foram perdidos após a colheita ou começaram a se diferenciar. Dos 10 clones organoides colhidos, sete cresceram bem. O enxerto organoide foi confirmado um mês após a injeção dos organoides na glândula lacrimal de camundongos pela coloração para um marcador humano-específico, o antígeno nucleolar humano.

Uma coisa a prestar atenção é não digerir excessivamente o tecido, nem os organoides. Caso contrário, as células poderiam morrer, e isso reduziria a taxa de estabelecimento de organoides. Os organoides das glândulas lacrimais podem ser analisados por histologia.

Ao fazer isso, pode-se obter informações sobre sua composição celular.