Estimulação Multimodal Automatizada e Gravação Neuronal Simultânea de Múltiplos Pequenos Organismos

As respostas neurais dão informações sobre a atividade cerebral, mas podem variar entre experimentos e indivíduos. Esse protocolo auxilia automatizando o registro e a análise dos estímulos e simplificando a programação de diferentes tipos e padrões de estímulos. A técnica automatizada permite gravações para múltiplos neurônios e organismos no mesmo formato microfluídico em paralelo.

Isso melhora a repetibilidade dos registros e permite a exploração da variabilidade neuronal entre populações. Diferentes padrões de estimulação são necessários para revelar fenômenos neurais como adaptação e integração sensorial. Este método é generalizável para outros sinais dinâmicos de células e organoides para organismos e plantas.

Para começar, ligue o microscópio, preencha e remova as bolhas de ar da tubulação do reservatório usando a seringa de escorvamento e, em seguida, preencha a tubulação de saída com tampão. Remova o dispositivo microfluídico do dessecador a vácuo. Coloque o dispositivo no microscópio e insira rapidamente a tubulação de saída.

Empurre suavemente a seringa de saída para injetar líquido no dispositivo até que uma gotícula saia de uma entrada. Nesta entrada de gotícula emergida, use uma conexão gota-a-gota para inserir o tubo de entrada fluídico correspondente, garantindo que as gotas de líquido estejam presentes na tubulação de entrada e na vigia do dispositivo para evitar a introdução de uma bolha. Conecte o próximo tubo de entrada à próxima gota.

Injete mais líquido da saída, se necessário, e repita até que todas as entradas estejam cheias. Insira um pino de bloqueio sólido nas entradas não utilizadas e na porta de carregamento do worm. Verifique o fluxo na tela para garantir que o fluxo vá na direção desejada.

Vire a válvula um no controlador da válvula e observe o fluxo do estímulo fluindo para a arena microfluídica. Se a vazão estiver desequilibrada, ajuste as alturas do reservatório. Transfira os animais adultos jovens para um meio de crescimento de nematódeo não semeado ou placa de ágar NGM usando um palito de ponta de arame e, em seguida, inunde a placa com aproximadamente cinco mililitros de um tampão basal XS para que os animais possam nadar.

Desenhe os vermes em uma seringa de carregamento de um a três mililitros usando a tubulação conectada pré-cheia com um tampão basal XS. Usando um estereoscópio, mova a tubulação abaixo da superfície líquida com uma mão para cada animal desejado e desenhe-a para dentro da tubulação usando a seringa mantida na outra mão. Feche o contorno da tomada, remova o pino de carregamento do worm e conecte a seringa de carregamento do worm ao dispositivo usando uma conexão drop-to-drop.

Em seguida, flua suavemente os animais para a arena. Estabelecer fluxo tampão e permitir até uma hora para imobilização por tetramisol. Usando o editor de texto, crie um arquivo de texto de definição de estímulo chamado userdefinedacquisitionsettings.

txt contendo as configurações de estimulação para a aquisição automatizada das imagens. Esse arquivo define parâmetros de aquisição do microscópio, como tempo de exposição e excitação, duração do teste, intervalos e diretório de salvamento. Ele também define o tipo de experimento e as configurações de tempo de estimulação.

Para um experimento de estímulo único, use um formato com apenas um comando de estimulação repetido. Para um experimento multipadrão, use um formato com múltiplos comandos de estimulação, incluindo uma sequência padrão de dígitos que representa a ordem dos padrões de estímulo. Para cada padrão, insira um comando de estimulação em uma linha separada.

Em seguida, execute o software de controle do microscópio. Verifique se todas as entradas fluídicas estão abertas, o fluxo é desejado dentro da arena e os neurônios de interesse estão em foco dentro da janela ao vivo. Em seguida, feche a janela ao vivo e execute o script multipatternrunscript.

bsh dentro do software. Para analisar os dados, execute o NeuroTracker clicando sequencialmente em plugins, depois rastreando e, em seguida, NeuroTracker. Selecione a pasta que contém os arquivos de vídeo tiff a serem rastreados e selecione o intervalo de arquivos a serem processados.

Em seguida, usando a imagem e ajustar menus, abra as janelas de contraste de brilho e controle de limite. Verifique o plano de fundo escuro e não redefina o intervalo na janela de limite, definindo o método de limite como padrão e a visualização como vermelha. Em seguida, clique em auto na janela de contraste de brilho para visibilidade do neurônio.

Na janela de contraste de brilho, ajuste os controles deslizantes mínimo e máximo até que os neurônios sejam claramente distinguíveis. Em seguida, ajuste o nível de limiar até que todos os neurônios apareçam como pequenos pontos vermelhos separados de outros objetos. Ajuste o controle deslizante do quadro para observar o movimento do neurônio e as mudanças de intensidade, observando quaisquer animais a serem excluídos do rastreamento, como devido à sobreposição com outros animais.

Depois de identificar os neurônios para rastreamento, ajuste o nível de limiar para cada animal, se necessário, de modo que a área de limiar vermelha acima do neurônio seja visível em cada quadro. Clique no neurônio para registrar sua posição e nível de limiar. Quando todos os neurônios estiverem selecionados, pressione a barra de espaço para iniciar o rastreamento.

Monitore o processo de rastreamento de cada animal e faça as correções necessárias. Se o NeuroTracker parar, ele perdeu o neurônio. Ajuste o nível de limite conforme necessário e clique novamente no neurônio.

Se a caixa de integração saltar para outro animal próximo ou estrutura não neuronal, pressione a barra de espaço para pausar. Mova o controle deslizante de volta para o primeiro quadro errôneo e clique novamente no local correto do neurônio. Execute o neurotrackersummarypdf.

m no MATLAB e selecione a pasta que contém os arquivos de texto de dados do NeuroTracker. Aguarde a geração de um PDF resumido, permitindo a verificação do processo de rastreamento. Os animais podem ser identificados pelos números e pelas respostas neurais de cada animal e ensaio e ser visualizados para avaliar a variabilidade populacional.

Use a função DataBrowse. m para explorar os dados neurais agrupados por número de ensaio, número de animais, padrão de estimulação ou por outra categoria. O fenômeno de inibição temporal foi testado em um experimento de pulso pareado que produziu oito padrões consistindo de dois pulsos odorantes de um segundo separados por um intervalo que variou de zero a 20 segundos.

O primeiro pulso de odor de um segundo provocou igual magnitude de resposta nos neurônios AWA que detectam o diacetil e as respostas no segundo pulso variaram com o intervalo inter-estímulo. A desinibição foi avaliada pelo experimento catch trial, onde foi observada adaptação ao estímulo diacetil, mas a apresentação do novo estímulo 2-metilpirazina não provocou um forte efeito de desinibição. A estimulação multimodal testada revelou que a estimulação química isoladamente causou adaptação, enquanto a estimulação óptica isoladamente não.

No entanto, o padrão de estímulo multimodal combinado demonstrou que as respostas optogênicas foram suscetíveis à adaptação quimicamente induzida. Ao modificar o desenho microfluídico para incluir duas arenas, podemos comparar perturbações genéticas ou outras ao lado de uma referência combinada ao mesmo tempo. Uma vez configurado, o sistema pode ser modificado de várias maneiras.

Por exemplo, medimos automaticamente as respostas químicas à dose e as mudanças dependentes do estado da atividade neural, como entre os estados de sono e vigília.