Identificação Padronizada da Estrutura Composta na Medicina Tibetana Usando Espectrometria de Massa com Armadilha de Íons e Análise de Fragmentação em Múltiplos Estágios

Este método pode ajudar os pesquisadores a analisar as estruturas dos compostos da medicina tibetana, especialmente os componentes da árvore. Ele pode fornecer informações sobre o estudo qualitativo do conteúdo do composto na medicina natural. A principal vantagem desta técnica é que a precisão da estrutura composta obtida neste caso é superior à do banco de dados.

Esta técnica pode ser utilizada na análise da estrutura de intermediários metabólicos na bexiga ou urina. Para começar, a medicina tibetana Abelmoschus manihot preparação de amostras de sementes. Pesar com precisão um grama de AMS e colocá-lo num balão cónico contendo 30 mililitros de metanol a 80%.

Usando um sonicador de banho de ultrassom a 40 kilohertz, execute a extração na mistura por 30 minutos a 25 graus Celsius. Em seguida, centrifugar a amostra a 14.000g por cinco minutos. Prepare uma seringa de injeção e um filtro de membrana microporosa orgânico de 0,22 mícron e filtre o sobrenadante em um frasco de amostra de dois mililitros.

Depois de ligar o interruptor da bomba de vácuo, abra a válvula principal do cilindro de argônio junto com a válvula de pressão parcial e ajuste a pressão para aproximadamente 0,3 megapascals. Em seguida, abra a válvula de nitrogênio. Inicie o software de controle de espectrometria de massa, ou MS.

Clique em Fonte ESI aquecida no painel do software e defina os parâmetros do MS, incluindo temperatura do aquecedor, taxas de fluxo de gás, tensão de pulverização para os modos positivo e negativo e temperatura capilar. Clique no botão Aplicar para ativar a fonte de íons para cromatografia líquida ou LC.Prepare as fases móveis A e B usando ácido fórmico a 0,1% em uma solução aquosa em acetonitrila pura, respectivamente. Desgaseifique-os em um sonicador de banho de ultrassom a 40 kilohertz por pelo menos 15 minutos antes de conectar as soluções às passagens de fluido A e B, respectivamente.

Prepare uma solução de água de metanol volume a volume 1:9 e, em seguida, encha-a manualmente nas garrafas de fluido de limpeza da bomba e do injetor. Depois de iniciar o software de controle LC-MS, clique em Controle Direto para abrir o painel de controle LC. Abra a válvula de purga no sentido anti-horário no módulo da bomba.

Clique em Mais opção para abrir a configuração da bomba e definir os parâmetros de purga em cinco mililitros por minuto durante três minutos. Clique em Purge para iniciar a remoção da bolha. Feito isso, feche a válvula de purga.

Em seguida, clique em Seringa Prime para enxaguar a seringa por três ciclos, Wash Buffer Loop para enxaguar a alça por um ciclo e Wash Needle Externamente para lavar a agulha por um ciclo. Coloque o frasco de amostra no amostrador. Clique em Configuração do instrumento para abrir a janela de edição do método e clique em Novo para criar um novo método de instrumento LC-MS.

Estabeleça um tempo de execução total para o método e defina o limite de pressão. Taxa de fluxo total, gradiente de fluxo, temperatura da amostra, temperatura da coluna e delta de temperatura pronta na janela Edição de método. Para o método MS, selecione o tipo de experimento MS ou MSn Geral.

Insira valores do tempo de aquisição, polaridade, intervalo de massa, número do valor de desvio e duração. Clique em Salvar para definir as configurações como um método de instrumento. Clique em Configuração de sequência para abrir a tabela de sequência, na qual insira as informações sobre o tipo de amostra, arquivo, nome, caminho, ID da amostra, método do instrumento, posição e volume de injeção.

Registre a tabela de sequência clicando em Salvar, implemente as configurações e inicie a aquisição do MS. Para carregar os dados do MS no software de processamento de dados, clique duas vezes no arquivo bruto no Explorer. No cromatograma de pico base BPI, selecione a área máxima sob a curva ou AUC clicando e arrastando o mouse.

O espectro MS correspondente será exibido na mesma janela. Selecione um íon direcionado para a próxima análise do MS/MS. Reabra a janela Edição de Método e, na tabela de configuração MSn, defina o m/z do íon de destino com uma casa decimal na coluna Massa pai.

Em seguida, selecione o modo de colisão e insira a energia de colisão ou o valor CE. Defina o intervalo de varredura do MS/MS. Clique em Salvar para registrar o método MS e insira um novo nome de arquivo na tabela de sequência.

Clique no botão Iniciar para iniciar a aquisição do MS/MS. Quando a aquisição estiver concluída, clique duas vezes no arquivo raw no Explorer para carregar o arquivo raw do MS/MS no software de processamento de dados. Identifique o íon de fragmento mais forte no espectro e insira seu valor m/z na lista de métodos MSn.

Na tabela de configuração MSn, defina os parâmetros MS3, incluindo modo de colisão, valor CE e intervalo de verificação. Novamente, clique em Salvar para registrar o método MS e insira um novo nome de arquivo na tabela de sequência. Clique em Iniciar para iniciar a aquisição MS3.

Como demonstrado anteriormente, clique duas vezes no arquivo raw no Explorer para carregar o arquivo bruto MS3 no software de processamento de dados e repita as etapas para obter o espectro MS4. Para analisar os dados, clique duas vezes nos arquivos brutos para abrir todos os espectros de massa de MS para MSn. Calcule manualmente os valores de diferença m/z entre o íon e os íons de fragmento correspondentes.

Em seguida, desenhe manualmente a estrutura central de acordo com os resultados do MS4 e derive a estrutura original usando grupos funcionais ou segmentos moleculares com base no valor da diferença m/z. Desenhar manualmente os caminhos de clivagem molecular de acordo com cada estrutura molecular no MSn. O ESI-MS da celobiose de carboidrato modelo produziu a molécula proteinada M H em m/z 365 no modo positivo.

A varredura de íons do produto, ou CID MS/MS, resultou em um segundo íon fragmentado em m/z 305. Além disso, as análises MS3 e MS4 resultaram sequencialmente no terceiro e quarto fragmentos de íons em m/z 254 e m/z 185, respectivamente. A análise MS/MS revelou a sequência de fragmentações iônicas, ou seja, hidrólise da abertura do anel, clivagem de CC e desidratação.

Assim, este método foi considerado adequado para carboidratos. A análise qualitativa preliminar de AMS usando LC Q-TOF MS revelou a presença de numerosos compostos desconhecidos. A análise negativa do íon M H em m/z 617 produziu um segundo íon fragmento em m/z 571.

A análise MS3 deste íon fragmento produziu um terceiro íon fragmento em m/z 525 pela perda de hidroxietil como metanol correspondendo a 32 dalton e hidroxila como água, que é 18 dalton. A análise MS4 produziu íons quarto fragmento em m/z 344 e 273. A identificação manual da estrutura central revelou a estrutura molecular do composto em m/z 617 e seus caminhos de clivagem em MSn.

A varredura iônica do produto do íon M H de outro composto desconhecido foi realizada, e sua estrutura molecular e mecanismo de clivagem também foram revelados. Depois que a bomba de vácuo for ligada, aguarde pelo menos cinco horas para garantir um grau de vácuo suficiente para as condições experimentais. A análise estatística pode ser usada para agrupar os fragmentos com a mesma ou semelhante relação massa-carga.

Com a solução de espectrometria de massa aumentando, esta técnica poderia ajudar os pesquisadores a obter compostos mais novos em medicinas naturais.