Name: Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprenda a determinar compatibilidade do pólen em citros utilizando polinização manual, microscopia e análise de genótipo S. Esta técnica identifica 21 haplótipos S em Citrus maxima para programas de melhoramento.

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Este projeto foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32122075, 32072523).

1. Preparação para coloração de azul de anilina
<ol><li>Prepare os seguintes reagentes e ferramentas para o experimento: escova polinizadora, pinça, lápis, papel sulfato, saco de polinização, sacos zip lock, clipes de papel, formaldeído, ácido acético glacial, etanol absoluto, tubos de centrífuga, pinças, conta-gotas de cola, lâminas de vidro, lamínulas, bisturis e polietilenoglicol.</li>
	<li>Preparar meio de germinação in vitro contendo 0,02% de MgSO4, 0,01% de KNO 3, 0,03% de Ca(NO 3)2, 0,01% de H 3 de BO 3, 20% de PEG-4000 e 15% de sacarose. Ajuste o pH para 6,0-6,2 com KOH. Use um agitador magnético, pois o PEG-4.000 é difícil de dissolver.</li>
	<li>Prepare a solução fixadora de Carnoy, que é etanol absoluto e ácido acético glacial misturados na proporção de 3:1. Preparar solução de fixação de FAA, que é formaldeído a 40%, etanol a 80% e ácido acético glacial (1:8:1). Preparar solução de hidróxido de sódio (NaOH) 4 M e azul de anilina, que é 0,1% de azul de anilina em 0,1 M K3PO4. Use um frasco de âmbar para armazenar a solução de azul de anilina porque é sensível à luz.</li>
</ol>2. Coleta de pólen
<ol><li>Conhecer antecipadamente o período de floração das árvores experimentais (Ma jia pummelo neste estudo). Colete flores maduras fechadas desde o início do período de floração até o estágio de pico de floração e coloque-as em um saco zip lock. As flores podem ser armazenadas a 4 °C na geladeira por 24 h.</li>
	<li>Leve as flores para o laboratório. Use uma pinça para coletar as anteras e coloque-as em uma placa de Petri contendo papel de filtro. Colete anteras de 20 a 30 flores.</li>
	<li>Colocar a placa de Petri contendo as anteras em estufa a 28 °C durante 24 h até os grãos de pólen secarem. Para a organização detalhada das flores, ver Hu et al.9.</li>
	<li>Coloque o pólen seco em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Guarde o pólen em um saco zip lock hermético contendo sílica gel (dessecante) que muda de cor. Feche o saco e rotule-o com o nome da variedade de pólen e a data de armazenamento. O pólen seco pode ser armazenado em geladeira a −20 °C por 96 semanas16.</li>
</ol>3. Teste de germinação in vitro de pólen
<ol><li>Despeje 300 μL de meio líquido em uma placa de cultura celular ou na tampa de um tubo de centrífuga de 2 mL e polvilhe o pólen uniformemente com a ajuda de uma escova de polinização. Incubar o pólen a 28 °C em ambiente escuro umedecido por 12 h.</li>
	<li>Remova o 1 mm superior da ponta de uma pipeta de 1.000 μL. Use a pipeta para absorver o pólen com uma pequena quantidade de solução de cultura e mova-o para o centro da lâmina do microscópio. Cubra-o com uma lamínula. Observe o espécime com microscópio invertido com objetiva de 10x.</li>
	<li>Realizar três réplicas independentes usando aproximadamente a mesma densidade polínica para cada réplica17. Gerencie visualmente a quantidade de pólen, certificando-se de que toda a placa de Petri esteja coberta com pólen e que cada placa de Petri tenha uma quantidade quase igual de pólen.</li>
	<li>O pólen germinado produz um tubo polínico com comprimento aproximadamente duas vezes maior que o seu diâmetro. Calcular a taxa de germinação a partir de 20 campos visuais, que dá a porcentagem de pólen germinado em todos os campos de pólen.</li>
</ol>4. Polinização
<ol><li>Escolha um dia ensolarado sem vento para polinização. Selecione 10 botões totalmente desenvolvidos prestes a abrir, descasque as pétalas com cuidado e tome cuidado para não machucá-las.</li>
	<li>Use uma escova de polinização para espalhar uma quantidade suficiente de pólen viável na superfície do estigma e tome cuidado para não danificar o pistilo. Para a autopolinização, utilizar o pólen da mesma planta/cultivar. Para a polinização cruzada, utilizar o pólen de uma planta com genótipo diferente.</li>
	<li>Cubra as flores polinizadas com um saco de papel sulfato. Use um clipe de papel para selar o saco e evitar a polinização por pólenes genotipicamente distintos.</li>
	<li>Escreva o nome da espécie e o número e o tempo de polinização no rótulo. Pendure o rótulo nos galhos próximos às flores polinizadas.</li>
</ol>5. Amostragem, fixação e preservação
<ol><li>Retirar os sacos de polinização aproximadamente 3-4 dias após a polinização e coletar as flores polinizadas em sacos zip lock.</li>
	<li>Remova imediatamente as pétalas, recipientes e ovários das flores e mergulhe os estigmas fundidos em um tubo de centrífuga contendo uma solução fixadora recém-preparada. Incubar os estigmas e estilos na solução fixadora durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, descarte a solução fixadora e lave os estigmas e estilos de duas a três vezes em etanol 95%.</li>
	<li>Transfira os estilos para uma solução de etanol a 70%. Certifique-se de que a amostra esteja completamente imersa na solução. Os estilos nesta fase podem ser armazenados a 4 °C por 1-2 meses.</li>
</ol>6. Coloração azul de anilina
<ol><li>Lavar as amostras de estilo armazenadas em etanol 70% com água destilada três a quatro vezes. Imergir em solução de NaOH 4 M, selar e incubar em banho-maria a 65 °C por 60 min. Durante esta etapa, a cor do estilo muda de amarelo-branco para laranja-vermelho.</li>
	<li>Mergulhe os estilos em água destilada por 30 min. Descarte a água destilada e lave os estilos com água destilada de três a quatro vezes ou até que a cor do estilo fique amarela.</li>
	<li>Colocar a amostra num tubo de 10 ml, adicionar o azul de anilina até à imersão da amostra e corar durante 12 h no escuro.</li>
	<li>Observe o crescimento do tubo polínico com um microscópio de fluorescência.</li>
</ol>7. Microscopia de fluorescência
<ol><li>Antes de observar os espécimes, coloque a lâmina sobre uma mesa plana e adicione duas a três gotas de polietilenoglicol à superfície da lâmina.</li>
	<li>Lave o estilo a ser observado com água destilada. Use um bisturi para dividi-lo em duas metades ao longo do eixo longitudinal. Coloque metade do estilo na lâmina de vidro e cubra com uma tampa.</li>
	<li>Coloque a lâmina no palco do microscópio acima da abertura e visualize usando uma objetiva de 10x. Use o filtro DAPI (excitação: 325-375 nm; emissão: 435-485 nm). Observe cinco estilos para cada tipo de polinização. Observe o crescimento do tubo polínico.</li>
</ol>8. Identificação do genótipo S baseada em PCR
<ol><li>Extrair o DNA genômico da amostra de estigma usando o método CTAB18.<ol><li>Coloque as folhas coletadas em um tubo de centrífuga de 2 mL e congele rapidamente em nitrogênio líquido. Preparar HCl:EDTA:NaCl:H2O tampão na proporção de 1:1:3:5 e uma mistura de clorofórmio isoamílico na proporção de 24:1</li>
		<li>Adicionar 10 ml do tampão preparado, 0,2 g de CTAB e 200 μL de mercaptoetanol a um tubo de centrífuga de 50 ml e colocá-los em banho-maria a 65 °C durante 5 minutos até que a solução se torne límpida e transparente.</li>
		<li>Coloque as lâminas em uma argamassa, adicione as amostras congeladas, adicione nitrogênio líquido e triture. Colocar a amostra moída num tubo de centrifugação de 2 ml, adicionar 600 μL de mistura de CTAB, colocá-la em banho-maria a 65 °C durante 60 minutos e misturá-la de cabeça para baixo a cada 30 minutos.</li>
		<li>Adicionar 700 μL da mistura de álcool clorofórmio isoamílico (24:1) e misturar de cabeça para baixo durante 10 minutos. Centrifugar a 24 °C a 12.000 x g por 10 min, pipetar o sobrenadante e transferir para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicionar 60 μL de solução de NaCl 5 M e 1 mL de etanol absoluto e misturar de cabeça para baixo. Congelar a -20 °C por 30 min e centrifugar a 24 °C e 9.000 x g por 5 min.</li>
		<li>Descarte o sobrenadante, adicione 1 mL de solução de etanol a 70% e deixe em temperatura ambiente por 1-2 h. Centrifugar a 24 °C, 9.000 x g por 5 min, descartar o sobrenadante, aspirar o excesso de solução de etanol e secar ao ar por 5 min.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de água estéril para dissolver, medir a concentração de ADN com um espectrofotómetro e congelar num congelador a -4 °C para armazenamento a longo prazo.</li>
		<li>Configure o sistema de reação RT-PCR. Preparar a seguinte mistura de reacção para 10 μL contendo 5 μL de 2x PCRMix, 0,25 μL cada de primer para a frente e para a reviravolta, 1 μL de ADN (100 ng/ μL) e 3,5 μL de H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure o programa PCR de acordo com a Tabela 1. O programa de PCR para todas as isoformas foi de 95 °C por 5 min 32x (95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 1 min) e 72 °C por 5 min. Separe os produtos em géis TAE-agarose 1,5% e fotografe9. Verifique o genótipo S especificado usando DNA genômico.</li>
</ol>

<ol><li>Matsumoto, D., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+S-RNases+by+an+S+locus+F-box+like+protein+and+an+S+haplotype-specific+F-box+like+protein+in+the+Prunus-specific+self-incompatibility+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system.</a> Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).</li>
<li>Goldberg, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+selection+maintains+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Species selection maintains self-incompatibility.</a> Science. 330 (6003), 493-495 (2010).</li>
<li>Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+fruit+quality+of+Guangfeng+Ma+jia+pummelo+and+Pinghe+red+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22China+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo.</a> China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).</li>
<li>Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+self-incompatibility+mechanism+in+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees.</a> Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).</li>
<li>Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-self-+and+self-recognition+models+in+plant+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility.</a> Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).</li>
<li>Meng, X., Sun, P., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-RNase-based+self-incompatibility+in+Petunia+inflata%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata.</a> Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+self-compatibility+by+a+mutant+Sm-RNase+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus.</a> Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).</li>
<li>Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-incompatibility+triggers+programmed+cell+death+in+Papaver+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen.</a> Nature. 429, 305-309 (2004).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+expression+of+S2-RNase+attenuates+self-incompatibility+in+%26%2334%3BGuiyou+No.+1%26%2334%3B+pummelo%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in &#34;Guiyou No. 1&#34; pummelo.</a> Horticulture Research. 8 (1), 199(2021).</li>
<li>Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+selection+in+self-compatible+wild+tobacco+results+from+coordinated+variation+in+homologous+self-Incompatibility+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes.</a> Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).</li>
<li>Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+S-locus+F-box+proteins+of+petunia+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility+are+themselves+subject+to+ubiquitin-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation.</a> The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).</li>
<li>Hua, Z., Kao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+components+of+a+putative+petunia+S-locus+F-box-containing+E3+ligase+complex+involved+in+S-RNase-based+self-incompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility.</a> Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).</li>
<li>Entani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-proteasome-mediated+degradation+of+S-RNase+in+a+solanaceous+cross-compatibility+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction.</a> The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).</li>
<li>Abdallah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+self-incompatibility+and+genetic+diversity+in+diploid+and+hexaploid+plum+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 896(2019).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+production+in+the+new+generation+of+apricot+cultivars%3A+self-incompatibility%2C+S-RNase+allele+identification%2C+and+incompatibility+group+assignment.+%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. </a> Frontiers in Plant Science. 9, 527(2018).</li>
<li>Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalaenopsis+pollinia+storage+at+sub-zero+temperature+and+its+pollen+viability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Studies%22%5BJournal%5D)">Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment.</a> Botanical Studies. 59 (1), 1(2018).</li>
<li>Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+evolution+of+genes+related+to+self-incompatibility+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus.</a> , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).</li>
<li>Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protocol+for+genomic+DNA+extraction+from+Citrus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+S-genotypes+of+63+pummelo+germplasm+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Horticulturae+Sinica%22%5BJournal%5D)">Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources.</a> Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).</li>
<li>de Nettancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incompatibility+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Incompatibility in angiosperms.</a> Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).</li>
<li>Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+self-incompatibility+and+its+evolutionary+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences.</a> International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).</li>
<li>Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+pollination+requirements+in+Japanese+plum+by+phenological+monitoring%2C+hand+pollinations%2C+fluorescence+microscopy+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61897(2020).</li>
<li>Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+self-+and+inter-%28in%29compatibility+relationships+in+apricot+combining+hand-pollination%2C+microscopy+and+genetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60241(2020).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm nada a divulgar.

Em fruticulturas, tanto a partenocarpia quanto o SI são características importantes, pois abrem caminho para frutos sem sementes - uma característica muito apreciada pelos consumidores. A autoincompatibilidade promove a rejeição do autopólen e, assim, previne a endogamia20. Entre os citros, o pummelo é uma variedade auto-incompatível7. Quase 40% de todas as espécies de angiospermas apresentam SI21. Essa característica impede a frutificação, diminui a...

A autoincompatibilidade (IE) é um mecanismo geneticamente controlado presente em aproximadamente 40% das espécies de angiospermas. Nesse processo, o pistilo rejeita o pólen de uma planta com o mesmo genótipo SI e, assim, impede a autofecundação 1,2. Ma jia pummelo é uma variedade local na província de Jinagsu, China, com as excelentes qualidades de frutas grandes e cor-de-rosa, um rico teor de suco, um sabor doce e azedo e uma casca grossa3. Embora o SI promova o cruzamento, ele impacta negativamente a produtividade e a qualidade dos frutos4 e necessita de árvores polinizadoras adequadas com genótipos distintos de SI para taxas de frutificação confiáveis e altas produtividades. Atualmente, existem dois tipos principais de SI, a autoincompatibilidade esporofítica (ISC), representada por Brassicaceae, e a autoincompatibilidade gametofítica (IGS), representada por Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.
A citricultura é uma das culturas frutíferas mais importantes do mundo. O sistema GSI à base de S-RNase é encontrado em muitos acessos de citros e influencia negativamente a taxa de frutificação9. Nesse sistema, o SI é controlado pelo locus S, um único locus polimórfico com dois alelos complexos que carregam determinantes do pistilo S e determinantes do pólen S 7. O determinante feminino é a ribonuclease S (S-RNase), e o masculino é o locus S F-box (SLF)7. As células do pistilo secretam proteínas S-RNase. As RNAs-S não-auto são reconhecidas pelas proteínas SLF, o que leva à ubiquitinação e degradação das S-RNases não-auto pela via do proteassoma 26S. Em contrapartida, as auto-S-RNases são capazes de acumular e inibir o crescimento do tubo polínico (TP), pois escapam das proteínas SLF e, portanto, são impedidas de ubiquitinzação10,11,12,13.
Aqui, relatamos uma técnica in vivo que é útil para identificar genótipos S e graus de compatibilidade e incompatibilidade polínica. O protocolo envolve a extração de DNA total das folhas e a predição do genótipo S por meio de primers S-específicos. Além disso, a coloração com azul de anilina e a microscopia de fluorescência seguida de polinização manual fornecem evidências do grau de compatibilidade e incompatibilidade. O procedimento de polinização semi in vivo, que envolve a polinização manual das flores em laboratório14,15, também foi adaptado para avaliar os graus de autocompatibilidade e incompatibilidade. No entanto, também utilizamos a polinização a campo seguida do ensacamento das flores para evitar a contaminação por pólen indesejado para permitir que os tubos polínicos se desenvolvam em condições naturais. Este protocolo é simples e direto e fornece as informações necessárias para a seleção bem-sucedida de árvores polinizadoras adequadas.

<table><tbody><tr><td>etanol absoluto</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Anilina azul</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico, H3BO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>garrafa marrom</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de cálcio tetrahidratado, Ca (NO3) 2</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>80029062</td><td></td></tr><tr><td>Tubo centrífugo</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr> tubos <tr><td>de centrífuga</td><td>Labgic Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAB</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>57-09-0 (CAS)</td><td></td></tr> <tr><td>Deixando cair</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético, EDTA</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009617</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formaldeído</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>Moedor rápido de amostra totalmente automático</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td>Ácido</td> acético glacial Tissuelyser-96 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10000218</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de moagem</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Álcool isoamílico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10003218</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>rótulo</td><td>M & Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8</td><td>Shanghai Leica Co., Ltd</td><td>21903797</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>MICROSCÓPIO Vidro de cobertura</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>clipes de papel</td><td>M& Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lápis</td><td>M& Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>escova polinizadora</td><td>Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol, PEG 6000</td><td>Pequim Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd</td><td>DH229-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol, PEG-4000</td><td>Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd</td><td>1521GR500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio, KOH</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017008</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de potássio, KNO3</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>bisturi</td><td>Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio, NAOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td></td><td></td>Banho</tr> maria do termostato da <tr><td>fábrica</td><td></td><td></td>da malha de Taizhou Jinnong do papel do<td>sulfato</td></tr> de <tr><td></td><td>10021418 Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>L-909193</td><td></td></tr><tr>Reagente químico Co. de<td>Trichloromethane</td><td>Sinopharm, Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Trihydrate tribásico do fosfato tripotássico, K3PO4</td><td>Shanghai Lingfeng O reagente químico Co., Ltd</td><td>20032318</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>fecha sacos</td><td>M& Fornecedor verificado - G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>GEN-VIEW SCIENTIFIC INC</td><td>60-24-2(CAS)</td><td></td></tr></tbody></table>

determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo s

Determination of Self-(In)compatibility and Inter-(In)compatibility Relationships in Citrus Using Manual Pollination, Microscopy, and S-Genotype Analyses

Os citros usam a autoincompatibilidade baseada em S-RNase para rejeitar o autopólen e, portanto, requer árvores polinizadoras próximas para o sucesso da polinização e fertilização. No entanto, identificar variedades adequadas para servir como polinizadores é um processo demorado. Para resolver este problema, desenvolvemos um método rápido para identificar cultivares de citros compatíveis com polinização que utiliza eletroforese em gel de agarose e coloração com azul de anilina. A compatibilidade polínica é determinada com base na identificação de genótipos S por meio da extração de DNA total e da realização de ensaios de genotipagem baseados em PCR com primers específicos. Além disso, os estilos são coletados 3-4 dias após a polinização manual, e a coloração com azul de anilina é realizada. Finalmente, o estado de crescimento dos tubos polínicos é observado com um microscópio de fluorescência. A compatibilidade e a incompatibilidade polínica podem ser estabelecidas observando-se se o crescimento do tubo polínico é normal ou suprimido, respectivamente. Devido à sua simplicidade e custo-efetividade, este método é uma ferramenta eficaz para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica de diferentes variedades de citros para estabelecer grupos de incompatibilidade e relações de incompatibilidade entre diferentes cultivares. Este método fornece informações essenciais para o sucesso da seleção de polinizadores adequados e, assim, facilita o estabelecimento de novos pomares e a seleção de genitores apropriados para programas de melhoramento.

Para os experimentos realizados foram selecionadas flores maduras, coletadas as anteras, secas em estufa e o pólen germinado a 28°C por 12 h. A viabilidade polínica e as taxas de germinação foram quantificadas como mostra a Figura 1.
Os citros foram polinizados manualmente, e a compatibilidade e incompatibilidade polínica foram avaliadas pela coloração com azul de anilina e microscopia de fluorescência. O pólen compatível poderia germinar na superfície do estigma ...

Este protocolo fornece um método rápido para determinar a compatibilidade e incompatibilidade polínica em cultivares de citros.

Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S

Citrus uses S-RNase-based self-incompatibility to reject self-pollen and, therefore, requires nearby pollinizer trees for successful pollination and ...

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65056.jpg

Esta técnica pode identificar eficientemente o genótipo S e identificar com precisão a autoincompatibilidade dos citros, fornecendo informações necessárias para a seleção de árvores polinizadoras adequadas. Esta é uma técnica eficiente em termos de tempo, simples e confiável para selecionar as árvores matrizes apropriadas em programas de melhoramento. Esta técnica é simples e fácil de fazer e fazer experimento pela primeira vez requer paciência e cuidado.A identificação do genótipo S e o desenho do primer específico S necessitam de maior atenção e cuidado. Quem demonstrará o procedimento será Yu Hu, mestrando do meu laboratório. Comece a coleta de pólen levando as flores de Majia pomelo, Citrus maxima, para o laboratório.Recolher as anteras com uma pinça e colocá-las numa placa de Petri contendo papel de filtro. Secar os grãos de pólen colocando a placa de Petri contendo as anteras em forno de 28 graus Celsius por 24 horas. Após a secagem, guarde o pólen em um saco zip lock hermético Micro Centron contendo sílica gel que muda de cor.Feche o saco e rotule-o com o nome da variedade de pólen e a data de armazenamento. Despeje 300 microlitros do meio líquido na tampa de um tubo de centrífuga de dois mililitros e polvilhe o pólen uniformemente com a ajuda de uma escova de polinização. Coloque o pólen em uma caixa preta umidificada e incube a 28 graus Celsius por 12 horas.Após a incubação, corte a ponta superior de um milímetro de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros e aspirar o pólen com uma pequena quantidade de solução de cultura. Coloque o pólen no centro da lâmina do microscópio e cubra-o com uma lamínula. Uma vez feito, observar o espécime com um microscópio invertido usando uma objetiva de 10X.Execute três réplicas independentes usando aproximadamente a mesma densidade de pólen para cada réplica. Para a polinização, use uma escova de polinização para espalhar uma quantidade suficiente de pólen viável na superfície do estigma, garantindo que não danifique o pistilo. Cubra as flores polinizadas com um saco de papel sulfato e evite a polinização por pólenes genotipicamente distintos, selando o saco com um clipe de papel.Escreva o nome da espécie e o número e o tempo de polinização no rótulo. Pendure o rótulo nos galhos próximos às flores polinizadas. Retirar os sacos de polinização aproximadamente três a quatro dias após a polinização e coletar as flores polinizadas em sacos zip lock.Remova imediatamente as pétalas, recipientes e ovários das flores e mergulhe o estigma fundido em um tubo de centrífuga contendo uma solução fixadora recém-preparada. Incube o estigma e o estilo na solução fixadora durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, descarte a solução fixadora antes de lavar o estigma e modelar de duas a três vezes em etanol 95%.Em seguida, adicione a solução de etanol a 70% ao estilo, garantindo que a amostra esteja completamente imersa na solução. Os estilos nesta fase podem ser armazenados a quatro graus Celsius por um a dois meses. Para coloração de azul de anilina, lavar as amostras de estilo armazenadas em etanol 70% com água destilada de três a quatro vezes.Mergulhe-o em uma solução de hidróxido de sódio de quatro molares e sele antes de incubá-lo em banho-maria de 65 graus Celsius por 60 minutos. Durante esta etapa, a cor do estilo muda de amarelo-branco para laranja-vermelho. Em seguida, mergulhe os estilos em água destilada.Após 30 minutos, descarte a água destilada e lave os estilos com água destilada de três a quatro vezes ou até que a cor do estilo fique amarela. Em seguida, adicione o azul de anilina até que a amostra esteja submersa e incube por 12 horas no escuro. Observar o crescimento do tubo polínico ao microscópio de fluorescência.Coloque o slide em uma mesa plana. Divida o estilo em duas metades ao longo do eixo longitudinal usando um bisturi. Coloque metade do estilo em uma lâmina de vidro e adicione duas a três gotas de polietilenoglicol à superfície da lâmina.Em seguida, cubra com uma tampa. Uma vez feito, coloque a lâmina no estágio do microscópio acima da abertura e visualize usando uma objetiva de 10X. Use o filtro DAPI e observe o crescimento do tubo polínico.Observe cinco estilos para cada tipo de polinização. A viabilidade polínica de Citrus maxima e as taxas de germinação foram quantificadas por microscopia fluorescente. O pólen compatível germinou com sucesso na superfície do estigma e produziu um tubo polínico normal, que cresceu e, finalmente, levou à fecundação no ovário.Em contraste, tubos polínicos incompatíveis cresceram através de aproximadamente 2/3 do estilo e depois pararam de crescer. A eletroforese em gel de agarose detectou o produto DNA amplificado usando os primers locus-specific S. Mostrou a amplificação do produto do DNA entre 500 a 1.000 pares de bases.O genótipo S correspondente foi identificado. 21 haplótipos S em diferentes espécies de citros foram identificados por esse método. A etapa de polinização é fundamental.Somente a polinização bem sucedida pode garantir a observação subsequente dos tubos polínicos. A técnica foi utilizada para analisar os traços de autoincompatibilidade e explorar e identificar os determinantes femininos da autoincompatibilidade. Este método é importante para pesquisas de autoincompatibilidade e programas de melhoramento.Também pode facilitar a comunidade agrícola para a seleção de árvores polinizadoras para seus pomares.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós desenvolvemos uma metodologia para a realização de cruzes em Setaria viridis (S. viridis). O método envolve a poda da panícula antes de um tratamento com água quente para matar pólen viável. Cruzes são executadas seguindo um regime de crescimento bem controlada e tipicamente resulta na recuperação de 1 a 7, a polinização cruzada de sementes / s por panícula.

Métodos para a realização Cruzes em<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Um novo sistema de modelo para as gramíneas

Para revelar a eficácia polinizador de uma determinada espécie de planta, foram desenvolvidos vários métodos de experimentos de campo. Este estudo demonstra os métodos básicos de experimentos de campo para a ecologia da polinização usando o estudo de caso de Lycoris sanguinea var. Sanguinea e do romance mecanismo de polinização, quebrando-bud polinização.

Experimentos de campo de Ecologia da polinização: o caso da<em&gt; Sanguinea de Lycoris</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Neste protocolo, métodos para a realização de cruzamentos de consanguinidade e para avaliar o sucesso dessas cruzes, são descritos para a formiga Vollenhovia emeryi. Estes protocolos são importantes para as experiências que visa compreender a base genética dos sistemas de determinação do sexo em Hymenoptera.

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

Aqui, apresentamos um protocolo para forçar a floração em tangerineiras sob condições phytotron. Água, stress, alta luminosidade e um fotoperíodo de primavera simulado permitido flores viáveis a serem obtidos em um curto período de tempo. Esta metodologia permite que os pesquisadores ter vários períodos de floração em 1 ano.

Forçado a floração em tangerineiras Phytotron condições

Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.

Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis

Apresentamos uma metodologia para estabelecer os requisitos de polinização das cultivares de damasco(Prunus armeniaca L.) combinando a determinação da auto-(in)compatibilidade por microscopia de fluorescência com a identificação do S-genótipo pela análise pcr.

Determinação das Relações de Auto e Inter-(in)compatibilidade em Damasco combinando polinização manual, microscopia e análises genéticas

Descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês, que combina polinizações de campo e laboratório e observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência com a identificação de S-genótipos pela PCR e o monitoramento da floração para a seleção de polinizadores.

Estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, Microscopia de Fluorescência e Genotipagem Molecular

Neste trabalho, um método robusto para a quantificação da eficiência reprodutiva da levedura Saccharomyces cerevisiae é descrito. Este método é particularmente útil para a quantificação de barreiras pré-zigóticas em estudos de especiação.

Determinação da eficiência de acasalamento de haploides em Saccharomyces cerevisiae

Um método aprimorado para medir o perfil de hidratação polínica em Arabidopsis thaliana é descrito aqui. O novo método oferece maior resolução, não é invasivo e é altamente reprodutível. O protocolo representa uma nova ferramenta para uma dissecação mais fina dos processos que regulam os estágios iniciais da polinização.

Bioensaio de Hidratação Polínica In Vivo de Grão Único de Alta Resolução para Arabidopsis thaliana

Aqui é descrito o procedimento implementado no Grupo Biologia Caffrey Membrana Estrutural e Funcional para configurar manualmente ensaios de cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

Aprenda a determinar compatibilidade do pólen em citros utilizando polinização manual, microscopia e análise de genótipo S. Esta técnica identifica 21 haplótipos S em Citrus maxima para programas de melhoramento.

Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S (Vídeo) | JoVE Journal

Determinação das relações de auto-(in)compatibilidade e (in)compatibilidade em citros utilizando polinização manual, microscopia e análises de genótipo S

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