Name: Isolamento de Vesículas Extracelulares de Baixo Conteúdo de Endotoxinas Derivadas de Linhagens Celulares Cancerígenas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda a isolar vesículas extracelulares com baixo teor de endotoxinas de linhagens celulares SW480 e SW620 usando técnicas assépticas e ultracentrifugação. Este método garante resultados confiáveis em pesquisas com EVs.

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Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia, número de bolsa 2019/33/B/NZ5/00647. Gostaríamos de agradecer ao Professor Tomasz Gosiewski e Agnieszka Krawczyk do Departamento de Microbiologia Médica Molecular, Faculdade de Medicina da Universidade Jaguelônica por sua inestimável ajuda na detecção de DNA bacteriano em EVs.

1. Preparação de tubos de ultracentrífuga
<ol><li>Use tubos estéreis de uso único. Se isso não for possível, reutilize os tubos ultracentrífugos depois de lavá-los com detergente usando uma pipeta Pasteur estéril ou outros aplicadores de uso único. Lembre-se que os tubos de ultracentrífuga devem ser dedicados a um tipo de material centrifugado (sobrenadante de cultura celular/soro/plasma) e espécie (humano/camundongo/etc.).</li>
	<li>Após uma lavagem com detergente, enxágue os tubos ultracentrífugos com água deionizada e livre de LPS 3x. NOTA: Não utilize água de baixa qualidade.</li>
	<li>Seque os tubos de ultracentrífuga e depois preencha-os com etanol 70%. Deixe os tubos com etanol 70% para desinfecção durante a noite. Retire o etanol e seque os tubos novamente.</li>
	<li>Coloque os tubos e tampas em embalagens de esterilização e feche-os bem. Utilizar o método de esterilização por plasma ou gás (óxido de etileno)18,19. Conservar os tubos de ultracentrífuga incluídos na embalagem de esterilização em local seco e utilizá-los antes do prazo de validade. OBS: Realizar monitoramento mensal do nível de LPS em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e da água utilizada para isolamento de EVs. O monitoramento também deve incluir os tubos (por exemplo, testando a água [controle de lavagem] que foi armazenada nos tubos ultracentrífugos durante a noite à temperatura ambiente [RT]).</li>
</ol>2. Preparação de soro fetal bovino de baixa endotoxina com baixa endotoxina EV (EE-FBS)
<ol><li>Certifique-se de usar FBS de endotoxina ultrabaixa (comercialmente disponível; ver Tabela de Materiais; <0,1 EU/mL).</li>
	<li>Coloque um frasco de ultra-baixo endotoxina FBS em banho-maria e incube a 56 °C por 30 min. Esta etapa é necessária para desativar o sistema complemento.</li>
	<li>Pipetar o FBS inativado para tubos de ultracentrifugação e centrifugar a 100.000 x g por 4 h a 4 °C. Recolher o sobrenadante em tubos estéreis de 50 ml, garantindo que não exceda 45 ml por tubo para evitar a contaminação da tampa e molhar o anel do tubo.</li>
	<li>Conservar o soro EE-FBS preparado desta forma a -20 °C. Verificar a concentração de LPS em EE-FBS (etapa 6). A concentração de LPS deve estar no mesmo nível de antes da ultracentrifugação.</li>
</ol>3. Cultura celular
<ol><li>Para este estudo, as culturas SW480 e SW620 em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e gentamicina (50 μL/mL) foram suplementadas com EE-FBS a 10% em frascos de cultura de 75cm2 usando técnica asséptica. Semeando cerca de 4,5 x 10 6 células e6,5 x 106 células por frasco para SW480 e SW620, respectivamente.</li>
	<li>Coletar os sobrenadantes duas vezes por semana (~10 mL por frasco) quando as células atingirem confluência total (~13,5 x 10 6 e 20 x 106 células por frasco para SW480 e SW620, respectivamente) e dividir. Assegurar que a viabilidade das células não seja inferior a 99% e que as células sejam cultivadas a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2.</li>
	<li>Coletar sobrenadantes da cultura celular em tubos de 15 mL adequadamente marcados. Centrifugar os sobrenadantes coletados a 500 x g por 5 min no RT para remover restos celulares.</li>
	<li>Recolher cuidadosamente os sobrenadantes, evitar aspirar detritos, colocar em tubos marcados e centrifugar novamente a 3.200 x g durante 12 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Coletar sobrenadantes da segunda etapa de centrifugação em tubos estéreis marcados com 50 mL. Evite molhar as bordas dos tubos. Certifique-se de que o volume de sobrenadante não exceda 45 mL e que os tubos sejam mantidos verticalmente.</li>
	<li>Embrulhe a tampa do tubo com uma película transparente estéril e guarde os sobrenadantes na posição vertical a -80 °C. OBS: Realizar controle mensal de Mycoplasma spp. e contaminação por LPS em sobrenadantes de culturas frescas (etapa 6). Se o nível de endotoxina nos sobrenadantes exceder 0,05 EU/mL, verifique em que estágio a contaminação pode ter ocorrido e reinicie o processo desde o início. Se contaminação da cultura celular por Mycoplasma spp. é detectado, o isolamento dos EVs de tais sobrenadantes deve ser descontinuado.</li>
</ol>4. Isolamento de EVs a partir de sobrenadantes de cultura celular
<ol><li>Preparar filtros de seringas de 0,22 μm e seringas de volume adequado. Preparar dois tubos com sobrenadantes de cultura (90 mL).</li>
	<li>Encha a seringa com o sobrenadante e prenda o filtro ao adaptador da agulha. Coloque a seringa cheia com o filtro sobre um tubo de 50 ml. Empurre o êmbolo flange e colete ~90 mL de filtrado.</li>
	<li>Pipetar o filtrado (7 mL) para os tubos de ultracentrífuga (garantindo que o mesmo volume seja pipetado para cada tubo para equilíbrio adequado) e centrifugar a 100.000 x g por 2 h a 4 °C. NOTA: A eficiência da peletização de EVs depende de muitos fatores (por exemplo, tipo de rotor, seu fator k, comprimento do caminho de migração, viscosidade do meio, etc.), que precisam ser otimizados para uma melhor recuperação de EVs20.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur estéril. Colete os pellets restantes usando pontas de pipeta longas e filtradas e junte-os em dois tubos de ultracentrífuga. Preenchê-los até 7 mL com PBS livre de endotoxinas filtradas para enxaguar os EVs.</li>
	<li>Centrifugar os pellets ressuspensos de PBS a 100.000 x g por 2 h a 4 °C. Remova completamente o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur estéril e adicione 200 μL de PBS filtrado e livre de endotoxinas a ambos os tubos para ressuspender os EVs. Pipetar suavemente a pelota de EVs para coletar todos os EVs.</li>
	<li>Transfira a suspensão de EVs para um tubo de ensaio estéril de 1,5 mL (se possível, use um tubo de baixa ligação de proteínas). Reter 10 μL da suspensão de EV para preparar uma diluição para análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e para outros fins (por exemplo, medição da concentração de proteínas).</li>
	<li>Diluir os EVs com PBS filtrado (1:1.000) para medições por NTA, de acordo com as instruções do fabricante. Fixe os tubos EV envolvendo a tampa com uma película transparente estéril. Conservar os veículos elétricos a -80 °C.</li>
</ol>5. Detecção de marcadores específicos por western blotting
<ol><li>Determinar o nível de proteína nas amostras (por exemplo, pelo ensaio de Bradford) e preparar as amostras (20 μg) com tampão de carga. Preparar o tampão de carga misturando 5 μL de tampão de amostra (4x) e 2 μL de agente redutor de amostra (10x) para um volume total de 20 μL. Incubar as amostras a 70 °C durante 10 min.</li>
	<li>Prepare géis de poliacrilamida com SDS (10%-14%) e carregue os 20 μg de EVs em cada poço.</li>
	<li>Executar a eletroforese com tampão de corrida (30 g de Tris, 144 g de glicina, 10% SDS por 1 L) por 45 min a 150 V.</li>
	<li>Realizar a transferência semi-seca de proteínas do gel para a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) em uma máquina de transferência com tampão Towbin (1,51 g de Tris, 7,2 g de glicina, 10% de metanol por 0,5 L) a 25 V por 1 h.</li>
	<li>Colocar a membrana em tampão TBST (1 mL de Tween, 100 mL de solução salina tamponada com Tris (TBS 10x) por 1 L) para bloqueio com albumina de soro bovino (BSA) a 1% em tampão TBST e incubar por 1 h no balancim em TR.</li>
	<li>Adicionar anticorpos diluídos (1:1.000), anti-CD9 1 (clone#D8O1A) ou anti-Alix 1 (clone#3A9), em BSA a1% e incubar com a membrana durante a noite a 4 °C no balancim. Remover anticorpos e lavar a membrana 3x com 10 mL de 1x TBST por 10 minutos.</li>
	<li>Adicionar o anticorpo secundário de cabra anticoelho ou cabra anti-rato (diluição: 1:2.000) conjugado com peroxidase de raiz forte, dependendo do anticorpo primário na membrana, e incubar por 1 h no balancim em RT. Remover anticorpos e lavar a membrana 3x com 10 mL de 1x TBST por 10 minutos.</li>
	<li>Misturar o substrato e o luminol na proporção de 1:1 para obter 1 mL de solução. Despeje a solução sobre a membrana. Coloque a membrana imediatamente na câmara de medição do sistema de imagem, escolha o módulo de quimioluminescência e visualize as bandas de proteínas na tela.</li>
</ol>6. Medição do nível de endotoxina pelo teste Limulus Amebocyte Lysate (LAL)
<ol><li>Realizar a dosagem cromogênica do LAL do nível de endotoxina, de acordo com a recomendação do fabricante. Resumidamente, utilizar o método baseado na interação da endotoxina com o lisado de amebócito de límulo (LAL). O limite de detecção deste método é de 0,005 EU/mL. NOTA: O ensaio LAL, apesar de suas limitações, continua sendo atualmente o método padrão para detectar e quantificar a contaminação por endotoxinas em diferentes tipos de soluções e outros produtos utilizados na ciência ou na medicina8. O fator limitante deste kit é a estabilidade da solução de lisado de amebócito reconstituída, que é estável por apenas 1 semana a -20 °C se congelada imediatamente após a reconstituição.</li>
	<li>Use uma diluição dez vezes maior de EVs e outras amostras e uma diluição de 50 vezes de soro. Para experimentos posteriores, use apenas reagentes de baixa endotoxina, como EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/mL) e sobrenadantes de cultura livres de LPS.</li>
</ol>7. Detecção do gene procariótico 16S rRNA em amostras de EV
<ol><li>Isolar o DNA das amostras de EV. Procure manter assépticos os reagentes e o local de isolamento. Medir a concentração e a qualidade do DNA (por exemplo, usando um espectrofotômetro).</li>
	<li>Realizar reação em cadeia da polimerase (PCR), conforme descrito anteriormente21. Preparar gel de agarose a 1,5% com brometo de etídio ou verde SYBR para visualizar os produtos de PCR em luz ultravioleta (UV).</li>
	<li>Executar a eletroforese da amostra e do marcador de peso com tampão TRIS-acetato-EDTA a 75 V por 45 min. Visualize bandas de DNA usando o sistema de imagem.</li>
</ol>8. Determinação da concentração efetiva de LPS para estimulação em modelo de monócitos humanos
<ol><li>Preparar 2 x 106 monócitos/mL de suspensão de monócitos em RPMI 1640 suplementado com L-glutamina, glicose e EE-FBS a 2%. Adicionar 50 μL da suspensão por poço de uma placa de cultura de tecidos de 96poços 22.</li>
	<li>Adicionar um volume adequado de LPS ou meio de cultura para obter as seguintes concentrações finais: 0 pg/mL (controle), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL e 100 ng/mL, em 100 μL de volume total de suspensão celular. Faça triplicatas de cada concentração de LPS.</li>
	<li>Cultivar as células por 18 h a 37 °C, 5% CO2. Colete o sobrenadante.</li>
	<li>Gire o sobrenadante a 2.000 x g por 5 min. Transfira os sobrenadantes para novos tubos. Medir as concentrações de TNF8,23 e IL-1023 no sobrenadante coletado com o kit de citocinas humanas cytometric beads array (CBA), de acordo com o procedimento do fabricante, com citômetro de fluxo.</li>
</ol>

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<li>Gałuszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227(2020).</li>
<li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+polymyxins%3A+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27(2006).</li>
<li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+removal+from+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li>
</ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de relações comerciais ou financeiras que pudessem ser construídas como um potencial conflito de interesses.

Nos últimos anos, métodos para o isolamento adequado dos EVs têm se tornado cada vez mais importantes, possibilitando suas análises mais confiáveis, por exemplo, no contexto da obtenção de dados ômicos e funcionais confiáveis24. Com base na experiência de pesquisa prévia, parece que não só o tipo de método de isolamento, mas também outras condições durante este procedimento podem ser importantes. O uso de SFB com DEPLEÇÃO de EV é amplamente reconhecido como uma necessidade25,26</...

Vesículas extracelulares (EVs), de acordo com a nomenclatura MISEV 2018, são um termo coletivo que descreve vários subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempenham papéis cruciais em inúmeros processos fisiológicos e patológicos 1,2. Além disso, os EVs mostram-se promissores como novos biomarcadores para várias doenças, bem como agentes terapêuticos e veículos de liberação de medicamentos. No entanto, realizar todo o seu potencial é difícil, pois ainda existem muitos obstáculos técnicos relacionados à sua aquisição3. Um desses desafios é o isolamento de EVs livres de endotoxinas, que tem sido negligenciado em muitos casos. Uma das endotoxinas mais comuns é o lipopolissacarídeo (LPS), que é um dos principais componentes da parede celular de bactérias gram-negativas e pode causar uma resposta inflamatória aguda, devido à liberação de um grande número de citocinas inflamatórias por várias células 4,5. O LPS induz uma resposta por ligação à proteína ligadora do LPS, seguida de interação com o complexo CD14/TLR4/MD2 em células mieloides. Essa interação leva à ativação das vias de sinalização dependentes de MyD88 e TRIF, que por sua vez desencadeiam o fator nuclear kappa B (NFkB). A translocação do NFkB para o núcleo inicia a produção de citocinas6. Monócitos e macrófagos são altamente sensíveis ao LPS, e sua exposição ao LPS resulta em uma liberação de citocinas inflamatórias e quimiocinas (por exemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 e TNF-α)7,8. A estrutura CD14 permite a ligação de diferentes espécies de LPS com afinidade semelhante e serve como co-receptor para outros receptores toll-like (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 e 9)6. O número de estudos sendo conduzidos sobre os efeitos dos EVs em monócitos/macrófagos ainda está aumentando 9,10,11. Especialmente do ponto de vista do estudo das funções dos monócitos, suas subpopulações e outras células imunes, a presença de endotoxina e mesmo sua presença mascarada em EVs é de grande importância12. A contaminação negligenciada de EVs com endotoxinas pode levar a conclusões enganosas e ocultar sua verdadeira atividade biológica. Em outras palavras, trabalhar com células monocíticas requer confiança na ausência de contaminação por endotoxinas13. Fontes potenciais de endotoxinas podem ser água, meios e soros obtidos comercialmente, componentes e aditivos de meios, vidraria de laboratório e plasticware 5,14,15.
Portanto, este estudo teve como objetivo desenvolver um protocolo para o isolamento de EVs com baixo teor de endotoxinas. O protocolo fornece dicas simples sobre como evitar a contaminação por endotoxinas durante o isolamento de EVs em vez de remover endotoxinas de EVs. Anteriormente, muitos protocolos foram apresentados sobre como remover endotoxinas de, por exemplo, nanopartículas projetadas usadas em nanomedicina; no entanto, nenhum deles é útil para estruturas biológicas como EVs. A despirogenação efetiva das nanopartículas pode ser realizada por enxágue com etanol ou ácido acético, aquecimento a 175 °C por 3 h, irradiação γ ou tratamento com triton X-100; entretanto, esses procedimentos levam à destruição dos EVs16,17.
O protocolo apresentado é um estudo pioneiro focado em evitar impurezas de endotoxinas em EVs, ao contrário de estudos anteriores sobre o efeito de EVs em monócitos9. A aplicação dos princípios propostos à prática laboratorial pode auxiliar na obtenção de resultados confiáveis de pesquisa, o que pode ser crucial quando se considera o potencial uso dos EVs como agentes terapêuticos na clínica12.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Alix (3A9) Mouse mAb&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>2171</td><td></td></tr><tr><td>1250ul Pontas de Pipeta Universais com Filtro, Transparente, Polipropileno, Não Pirogênico</td><td>GoogLab Scientific</td><td>GBFT1250-R-NS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Citômetro de Fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBA Kit de Citocinas Humanas Th1/Th2 II</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>CD9 (D8O1A) Tecnologia</td><td>de Sinalização Celular</td> mAb de Coelho <td>13174</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Imagem ChemiDoc</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>17001401</tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ELX800NB, Leitor Universal de Microplacas</td><td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino América do Sul Ultra Baixa Endotoxina</td><td>&nbsp; Biowest</td><td>&nbsp; S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina, 50 mg/mL</td><td>&nbsp; PAN &ndash; Biotech</td><td>P06-13100</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra- HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra- HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF de imun-borrão</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1620177</tr><tr><td>LPS de Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td><td>&nbsp; Enzo Ciências da Vida, Inc.</td><td>ALX-581-009-L002</td><td></td></tr><tr><td>Mini Célula de Transferência Eletroforética Trans-Blot</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1703930</tr><tr><td>Análise de Rastreamento de Nanopartículas&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampão de Amostra (4X)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>&nbsp; NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Agente Redutor de Amostra NuPAGE (10x)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>filme transparente</td></tr><tr><td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td><td>EURx</td><td>E3141-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit Quant de Endotoxina Cromogênica PierceTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39552</td><td></td></tr><tr><td>PP Oak Ridge Tubo com tampas de vedação</td><td>Thermo Scientific</td><td>3929, 03613</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>RPMI-1640 (Gibco)</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Termociclador</td><td>Aplicado Biosystem</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall wX+ SÉRIE ULTRA Centrífuga com rotor</td> <td>T-1270Sistema</td><td>de</td> Eletroforese Horizontal GT de Subcélula 75000100 <td></td>da Thermo</tr><tr><td></td><td>Scientific Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1704401</tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Substrato Quimioluminescente</td><td>Linha celular Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>SW480</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Linha de células SW480</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Filtro de seringa 0,22 um</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Célula</td> <td>de Transferência Semi-SecaBio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>1703940</td><td>Máquina de transferência</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência, 3,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de vesículas extracelulares de baixo conteúdo de endotoxinas derivadas de linhagens celulares cancerígenas

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

Vesículas extracelulares (EVs) são uma população heterogênea de vesículas de membrana liberadas por células in vitro e in vivo. Sua onipresença e seu significativo papel como portadores de informações biológicas os tornam objetos de estudo intrigantes, exigindo protocolos confiáveis e repetitivos para seu isolamento. No entanto, realizar todo o seu potencial é difícil, pois ainda existem muitos obstáculos técnicos relacionados à sua pesquisa (como a aquisição adequada). Este estudo apresenta um protocolo para o isolamento de pequenos EVs (de acordo com a nomenclatura MISEV 2018) a partir do sobrenadante de cultura de linhagens de células tumorais baseado em centrifugação diferencial. O protocolo inclui orientações sobre como evitar a contaminação por endotoxinas durante o isolamento de EVs e como avaliá-los adequadamente. A contaminação por endotoxinas de EVs pode dificultar significativamente experimentos subsequentes ou mesmo mascarar seus verdadeiros efeitos biológicos. Por outro lado, a presença negligenciada de endotoxinas pode levar a conclusões incorretas. Isso é de particular importância quando se refere a células do sistema imunológico, incluindo monócitos, porque os monócitos constituem uma população especialmente sensível a resíduos de endotoxinas. Portanto, é altamente recomendável rastrear EVs para contaminação por endotoxinas, especialmente quando se trabalha com células sensíveis à endotoxina, como monócitos, macrófagos, células supressoras derivadas do mielóide ou células dendríticas.

Um pré-requisito ou etapa obrigatória para este protocolo é a exclusão de possível contaminação por endotoxinas de reagentes. Todos os reagentes utilizados, como FBS, DMEM, RPMI, PBS e até mesmo tubos de ultracentrífuga, devem ser isentos de endotoxinas (&lt;0,005 EU/mL). Manter o regime de ausência de contaminação por endotoxinas não é fácil, pois, por exemplo, o soro regular/padrão para cultura celular pode ser sua rica fonte (0,364 EU/mL; ver Tabela 1).
Embora este protocol...

O protocolo proposto inclui diretrizes sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente.

Isolamento de Vesículas Extracelulares de Baixo Conteúdo de Endotoxinas Derivadas de Linhagens Celulares Cancerígenas

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Este protocolo fornece orientações sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente. A principal vantagem deste protocolo é que todo laboratório preocupado com EVs pode limitar a contaminação por endotoxinas mantendo um procedimento asséptico e usando equipamentos simples e amplamente disponíveis. Todo mundo que está tentando esta técnica pela primeira vez deve começar com novos meios, reagentes e plasticware que são de baixa endotoxina, não pirogênicos rotulados.Para este protocolo, utilizar reagentes livres de endotoxinas, água, meios de cultura, PBS filtrado, SFB ultra baixa endotoxina e tubos de ultracentrífuga. Para começar, colete o sobrenadante de linhagens celulares SW480 e SW620 previamente cultivadas em tubos de 15 mililitros devidamente marcados. Remova os restos celulares centrifugando o sobrenadante a 500 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente.Sem perturbar os detritos, colete o sobrenadante em um novo tubo marcado e centrifugue a 3.200 x g por 12 minutos a quatro graus Celsius. Transfira cuidadosamente 45 mililitros do sobrenadante para um tubo estéril de 50 mililitros colocado verticalmente, sem molhar as bordas do tubo. Embrulhe a tampa do tubo com um filme estéril e transparente e armazene-o verticalmente a 80 graus Celsius negativos para posterior isolamento das vesículas extracelulares.Comece o isolamento preparando filtros de seringas, seringas e tubos de 0,22 micrômetros contendo aproximadamente 90 mililitros de sobrenadante. Encha uma seringa com o sobrenadante e fixe o filtro no adaptador da agulha. Filtre o sobrenadante através do filtro em um tubo de 50 mililitros.Pipetar sete mililitros do filtrado para um tubo de ultracentrífuga preparado e centrifugar a 100.000 x g por duas horas a quatro graus Celsius. Use uma pipeta Pasteur estéril para descartar o sobrenadante. Puxe os pellets para dentro de um tubo de ultracentrífuga usando uma ponta de pipeta longa filtrada.Enxaguar as vesículas extracelulares adicionando sete mililitros de PBS livre de endotoxina filtrada. Após a ultracentrifugação, descartar o sobrenadante com pipeta Pasteur estéril e ressuspender o pellet em 200 microlitros de PBS livre de endotoxina. Transfira a suspensão para um tubo de ensaio estéril de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas.Em seguida, transfira 10 microlitros de suspensão para um novo tubo de 1,5 mililitro para análise posterior. Embrulhe a tampa do tubo e guarde-a a 80 graus Celsius negativos. Agora, em um novo tubo, dilua um microlitro de suspensão usando PBS filtrado na proporção de 1 para 1000 para análise de rastreamento de nanopartículas.Para realizar a análise de blotting, primeiro misture 20 microgramas das amostras com um tampão de carga. Incubar as amostras a 70 graus Celsius durante 10 minutos. Em seguida, carregar 20 microgramas da amostra em cada poço de um gel de poliacrilamida de 10 a 14% com SDS e realizar eletroforese por 45 minutos a 150 volts, com tampão de funcionamento.Em seguida, coloque o gel em uma máquina de transferência com tampão Towbin e realize uma transferência semi-seca de proteínas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno a 25 volts por uma hora. Bloqueie a membrana com 1% de BSA incubando-a por uma hora em um balancim. Adicione anticorpos diluídos BSA, anti-CD9 ou anti-Alix, à membrana e incube durante a noite a quatro graus Celsius em um balancim.Após a remoção dos anticorpos, lave a membrana três vezes com 10 mililitros de TBST por 10 minutos. Agora adicione o anticorpo secundário de cabra anti-coelho ou anti-camundongo e incube novamente em um balancim por uma hora à temperatura ambiente. Descarte o anticorpo e lave a membrana conforme demonstrado anteriormente.Deite um mililitro da solução contendo substrato e luminol numa proporção igual sobre a membrana. Coloque imediatamente a membrana em um sistema de imagem e visualize as bandas de proteína na tela. No presente estudo, a análise por western blot confirmou a presença de dois marcadores de vesícula extracelular, CD9 e Alix.O tamanho médio e as concentrações das vesículas isoladas de SW480 e SW620 foram semelhantes. A estimulação de monócitos com diferentes doses de lipopolissacarídeo, ou LPS, mostrou que a menor dose de LPS permitiu a secreção de interleucina 10 e o fator de necrose tumoral em monócitos foi de 50 picogramas por mililitro. O teste de LAL cromogênico indicou que a contaminação por LPS das vesículas extracelulares foi de cerca de 50 picogramas por mililitro para ambas as linhagens celulares.A coisa mais importante a lembrar é o uso de reagentes livres ou esgotados de LPS e a medição rotineira de LPS em cada etapa do procedimento. Prevenir a contaminação por endotoxinas é mais fácil do que eliminá-la. O protocolo proposto limita a possibilidade de falsos resultados devido à contaminação dos EVs com endotoxina e permite avaliar a atividade dos EVs por célula.O protocolo proposto é útil para pesquisadores que trabalham com células sensíveis a endotoxinas, como monócitos, células dendríticas e macrófagos.

isolation-low-endotoxin-content-extracellular-vesicles-derived-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Watson, D. C., et.al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de vesículas extracelulares (EVs) derivadas da membrana externa de bactérias geneticamente modificadas. O processo envolve a cultura das bactérias para liberar EVs, seguido por etapas sequenciais de centrifugação e filtração para remover células e detritos. Finalmente, a ultrafiltração é usada...

Isolamento e Enriquecimento de Vesículas Extracelulares Derivadas da Membrana Externa de Bactérias

Este é um protocolo para isolar vesículas extracelulares do tecido (EVs) do fígado. O protocolo descreve um processo da dois-etapa que envolve a perfusão do colagenase seguida pelo ultracentlee diferencial para isolar EVS do tecido do fígado.

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para isolar pequenas vesículas extracelulares (EVs) de tecidos, incluindo amostras de cérebro e tumor. Este método oferece uma técnica reprodutível para extrair EVs do tecido sólido para mais análises a jusante.

Extração de vesículas extracelulares de todo tecido

O presente relatório destaca os requisitos cronológicos para o isolamento da vesícula extracelular (EV) de microglia ou macrófagos sanguíneos. Os EVs derivados de microglia foram avaliados como reguladores do crescimento do neurite, enquanto os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram estudados no controle da invasão celular C6 glioma em ensaios in vitro. O objetivo é entender melhor essas funções de EV como mediadores imunológicos em microambientes específicos.

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

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In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

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Fluxo de trabalho de biofabricação escalável para produzir e isolar bioterapêuticos de câncer baseados em vesículas extracelulares derivadas de células assassinas naturais

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Isolamento de Vesículas Extracelulares de Baixo Conteúdo de Endotoxinas Derivadas de Linhagens Celulares Cancerígenas

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