Name: BS3 Chemical Crosslinking Assay: Avaliando o Efeito do Estresse Crônico na Apresentação do Receptor GABAA na Superfície Celular no Cérebro de Roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Aprenda a usar o ensaio de reticulação química BS3 para avaliar a expressão do receptor GABA A na superfície celular em cérebros de camundongos submetidos a estresse crônico. Este método revela adaptações moleculares ligadas à ansiedade.

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Os autores agradecem à equipe do biotério do CAMH pelos cuidados com os animais durante todo o estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), pelo Discovery Fund do CAMH (para T.P.), pela National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (prêmio NARSAD #25637 para E.S.) e pelo Campbell Family Mental Health Research Institute (para E.S.). E.S. é o fundador da Damona Pharmaceuticals, uma biofarmacêutica dedicada a trazer novos compostos gabaérgicos para a clínica.

Todo o trabalho com animais neste protocolo foi concluído de acordo com o Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, Capítulo A.22) e o Canadian Council on Animal Care (CCAC) e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais.
1. Preparação dos animais
<ol><li>Determinar o número de animais a serem usados nos experimentos e dividi-los em grupos apropriados ou coortes experimentais. Veja a seção de discussão para uma discussão sobre o tamanho do grupo, sexo e poder estatístico. NOTA: Este protocolo é personalizado para camundongos (cepa C57BL6/J; 2-4 meses de idade; tipicamente 20-30 g de peso corporal; números equivalentes de machos e fêmeas a serem usados).</li>
	<li>Colocar os animais sob condições de SCMS ou controle sem estresse por 5-8 semanas, seguindo o protocolo descrito anteriormente14.</li>
	<li>Após o último procedimento de UCMS, permitir que os animais permaneçam em suas gaiolas domésticas por 1 dia antes de usá-los para o ensaio de reticulação para evitar efeitos agudos de estresse na expressão do receptor.</li>
</ol>2. Preparação das soluções estoque
<ol><li>Prepare e armazene as seguintes soluções conforme instruído antes do ensaio.<ol><li>Preparar 5 M de NaCl dissolvendo 14,6 g de NaCl em 40 mL de água deionizada. Conservar à temperatura ambiente (TR).</li>
		<li>Preparar 1,08 M de KCl dissolvendo 3,22 g de KCl em 40 mL de água deionizada. Loja na RT.</li>
		<li>Preparar 400 mM MgCl 2 dissolvendo 3,25 g de MgCl 2·6H 2O em 40 mL de água deionizada. Loja na RT.</li>
		<li>Preparar 1 M de glicina dissolvendo 3 g de glicina em 40 ml de água deionizada e conservar a 4 °C.</li>
		<li>Preparar 1 M de ditiotreitol (TDT) dissolvendo 1,54 g de TDT em 10 ml de água deionizada. Filtrar-esterilizar através de um filtro com um tamanho de poro de 0,2 μm, e alíquota em tubos de 2 mL. Conservar a -20 °C.</li>
		<li>Preparar 10% Nonidet-P40 (NP-40) diluindo-o na proporção de 1:10 (v/v) em água deionizada. Loja na RT.</li>
		<li>Preparar EDTA 0,5 M (pH = 8,0) e armazenar em RT.</li>
		<li>Preparar tampão HEPES 1 M (pH = 7,2-7,5) e conservar a 4 °C.</li>
		<li>Preparar 2,5 M ou 45% (p/v) de glicose e conservar a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação do posto de trabalho
<ol><li>No dia do ensaio de reticulação BS3, reunir os seguintes materiais na sala de dissecção dos animais (Figura 1), com vários itens pré-resfriados sobre gelo: um balde de gelo, um bloco de temperatura metálico (pré-resfriado sobre gelo), PBS gelado em tubo cônico de 50 mL e PBS congelado em placa de Petri, papel filtro umedecido com PBS e colocado sobre uma superfície plana resfriada ou gelo azul, uma matriz cerebral (intervalo de 1 mm para inserção da lâmina de barbear) pré-resfriada no gelo, lâminas de barbear (~10) pré-resfriadas no gelo, ferramentas de dissecção (tesoura, pinça, sonda curva), um punch de tecido, papel de limpeza com spray de etanol 70% e toalhas de papel, pontas de pipeta (200 μL), um pipetador (P200), um cronômetro, um bloco de notas, uma caneta e tubos de microcentrífuga (1,5 mL).<ol><li>Antes do ensaio, rotule os tubos de microcentrífuga com as informações da amostra (por exemplo, número de identificação do animal, tipo de tratamento [SCMS versus sem estresse (NS)], região cerebral, com ou sem BS3, etc.). NOTA: Para os ensaios de reticulação BS3, duas amostras de cada região do cérebro devem ser coletadas; uma amostra será utilizada para reticulação (com BS3) e a outra para reação sem reticulação (sem BS3) como controle. Portanto, para coletar amostras de duas regiões cerebrais (ou seja, o córtex pré-frontal [PFC] e o hipocampo [HPC]) em 12 camundongos, marque 48 tubos para amostragem inicial (= 2 amostras × 2 regiões × 12 camundongos) (a ser usado na seção 6). Rotular dois conjuntos adicionais de 48 tubos para armazenamento posterior (para armazenar dois volumes diferentes [100 μL, 300 μL] de cada amostra) (a utilizar na secção 7). Assim, é necessário rotular 144 tubos no total para este tamanho de coorte.</li>
	</ol></li>
	<li>Além disso, certifique-se de que os seguintes equipamentos estão disponíveis no laboratório: uma microcentrífuga refrigerada de mesa, um sonicador, um rotador de tubo (a utilizar na câmara fria ou no interior do frigorífico [4 °C]), um congelador (-80 °C) para armazenar amostras e um balde de gelo seco para o armazenamento temporário das amostras (a utilizar na secção 7)</li>
</ol>4. Preparação das soluções de trabalho e dos tampões
NOTA: Na manhã do ensaio, prepare as seguintes soluções. Este cálculo é baseado nas soluções necessárias para processar duas regiões cerebrais (ou seja, o PFC e HPC) de 12 camundongos.
<ol><li>Preparar líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF, pH = 7,4) conforme mencionado na Tabela 1. Distribuir 750 μL de aCSF em cada tubo de recolha (os 48 tubos marcados no passo 3.1.1) e colocá-los no bloco de temperatura metálica sobre gelo para pré-arrefecer o tampão.</li>
	<li>Prepare o tampão de lise conforme mencionado na Tabela 2. Conservar no gelo (400 μL a utilizar por amostra).</li>
	<li>Preparar uma solução-mãe BS3 52 mM (26x) em tampão citrato de sódio 5 mM (pH = 5,0).<ol><li>Primeiro, preparar 100 mM de ácido cítrico (estoque A) e 100 mM de citrato de sódio (estoque B).</li>
		<li>Diluir o estoque A e o estoque B na proporção de 1:20 com água deionizada. Adicionar 100 μL cada a 1,9 mL de água para preparar 5 mM de ácido cítrico (estoque C) e 5 mM de citrato de sódio (estoque D), respectivamente.</li>
		<li>Misturar 410 μL de C e 590 μL de cal D para preparar um tampão citrato de sódio 5 mM (pH = 5,0) (solução E, 1 ml).</li>
		<li>Confirmar o pH da solução E utilizando uma tira indicadora de pH.</li>
		<li>Dissolver 24 mg de BS3 em 806,4 μL de solução E por vórtice durante 30 s para preparar a solução-mãe BS3 (26x).</li>
		<li>Preparar mais 1 ml de solução E para utilizar como controlo do veículo para as amostras não reticuladas. NOTA: Prepare a solução de estoque BS3 quando todo o resto estiver pronto e o experimento estiver prestes a começar. O BS3 deve ser armazenado dessecado a 4 °C até à sua utilização. Uma vez reconstituída, a BS3 permanece ativa apenas por aproximadamente ≤3 h. Como o pH do tampão citrato de sódio 5 mM (solução E) aumenta ao longo do tempo, causando hidrólise acelerada do BS3, recomenda-se que a solução E seja preparada fresca a partir das soluções-mãe A e B9. Devido à solubilidade limitada da BS3 a baixas temperaturas, mantenha a BS3 reconstituída em RT. Use a BS3 reconstituída em 3 h e não congele/descongele ou reutilize a BS3 reconstituída.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Dissecção dos tecidos cerebrais
NOTA: A partir desta etapa, pelo menos duas pessoas devem trabalhar juntas de forma coordenada. Enquanto uma pessoa se concentra na dissecção do animal (passos 5.2-5.10 e passo 6.3), a outra pessoa deve trabalhar como cronometrista e ajudar a coordenar o ensaio (passo 5.1, passo 6.1, passo 6.2, passo 6.4 e passo 6.5)
<ol><li>Trazer o primeiro animal para dissecação da área de alojamento para a sala de dissecação. NOTA: Como os estressores agudos (por exemplo, um ambiente novo, o cheiro de sangue) podem afetar a dinâmica das proteínas cerebrais, os animais devem ser mantidos em suas gaiolas domésticas colocadas longe da área de dissecção e, em seguida, ser trazidos individualmente para a sala de dissecção para decapitação imediata.</li>
	<li>Eutanásia do camundongo por deslocamento cervical seguido de decapitação. Remova o cérebro rapidamente para fora do crânio e submerja-o em PBS gelado em uma placa de Petri por 10-15 s (Figura 2). NOTA: Os animais não são anestesiados para experimentos com BS3, pois qualquer agente anestésico poderia potencialmente influenciar o nível de apresentação superficial dos receptores de neurotransmissores9.</li>
	<li>Coloque o cérebro resfriado na matriz cerebral sobre gelo, com o lado ventral do cérebro voltado para cima (Figura 3).</li>
	<li>Inserir a primeira lâmina de barbear através da borda entre o bulbo olfatório e o pedúnculo olfatório para cortar o cérebro coronalmente (Figura 4). Usando três a quatro lâminas de barbear adicionais, corte em série a parte anterior do cérebro coronalmente com intervalos de 1 mm.</li>
	<li>Levante as fatias coronais da matriz cerebral mantendo todas as lâminas de barbear inseridas juntas, deixando a parte posterior do cérebro para trás na matriz cerebral. Use pinças para separar as lâminas de barbear umas das outras e coloque-as na superfície plana e gelada com o corte cerebral voltado para cima (Figura 5).</li>
	<li>Identifique as fatias que contêm a região de interesse. Para amostragem do PFC, escolher o segundo e terceiro cortes posteriores ao primeiro corte contendo o pedúnculo olfatório.</li>
	<li>Remova a região de interesse usando um punch de tecido (Vídeo 1), coloque-a de lado na lâmina de barbear resfriada e divida uniformemente o tecido em dois (por exemplo, tecidos do hemisfério esquerdo versus direito, com uma metade a ser usada para a reação de reticulação BS3 e a outra metade para o controle sem reticulação se a proteína-alvo de interesse for igualmente expressa em ambos os hemisférios).</li>
	<li>Pique cada tecido em pedaços na lâmina de barbear usando a ponta fina da pinça com vários movimentos verticais contra a lâmina (Vídeo 2) em vez de triturar ou triturar os tecidos. Isso maximizará a área de superfície acessível ao BS3 sem comprometer severamente a integridade da membrana das células. Imediatamente após a picagem, transfira os tecidos picados para os tubos apropriados (ver passo 6.3).</li>
	<li>Para a amostragem do HPC, retire a parte posterior do cérebro da matriz e coloque o cérebro em papel de filtro umedecido sobre a superfície plana resfriada, com o lado dorsal voltado para cima (Figura 6).</li>
	<li>Usando uma sonda curva e pinças, e aproximando-se do lado dorsal (Vídeo 3), dissecar o HPC (metade dorsal, metade ventral ou ambos) de ambos os hemisférios (metade para a reticulação BS3 e a outra metade para o controle). Pique cada tecido como no passo 5.8 e transfira o tecido para tubos apropriados (ver passo 6.3). NOTA: Todo o tempo de dissecção para cada animal deve ser mantido em ~5 min para que as condições experimentais e os resultados sejam consistentes.</li>
</ol>6. Reação de reticulação
<ol><li>Levar o próximo animal para dissecção da área de alojamento para a sala de dissecção quando a dissecção do cérebro do rato anterior estiver prestes a terminar (passo 5.10).</li>
	<li>Colocar o tubo pré-refrigerado no gelo (a partir do passo 4.1) com 30 μL de solução BS3 (26x) ou solução E do veículo imediatamente antes de os tecidos picados estarem prontos para serem transferidos para os tubos adequados. Troque as pontas dos tubos entre os tubos para garantir que nenhum BS3 esteja contaminado nos tubos de controle sem reticulação.</li>
	<li>Transferir os tecidos picados (dos passos 5.8 e 5.10) para os tubos apropriados e, em seguida, começar a dissecar o próximo animal (passo 5.2)</li>
	<li>Inverter e misturar o tubo para quebrar os pedaços de tecido em pedaços menores (Vídeo 4), e começar a incubar as amostras no rotador do tubo na câmara fria por 30 min a 2 h. Registre a hora de início da incubação BS3 para cada tubo. Consulte a seção de discussão para obter o tempo ideal de incubação.</li>
	<li>Atenuar a reacção picando o tubo com 78 μL de glicina 1 M e incubar a amostra durante 10 minutos a 4 °C com rotação constante. Registre o tempo de início e término da têmpera para cada tubo. Continue auxiliando a pessoa com foco na dissecação do animal, trazendo o próximo animal (passo 6.1) e ajudando com ligações cruzadas (passo 6.2). NOTA: Trate cada amostra com o mesmo tempo exato em todas as amostras. Se a sala de dissecção estiver longe da câmara fria, é altamente recomendável que uma terceira pessoa seja recrutada para participar da incubação e têmpera da amostra na câmara fria.</li>
</ol>7. Lise tecidual, preparação de proteínas e western blot
<ol><li>Após 10 min de têmpera (passo 6.5), girar as amostras a 20.000 x g a 4 °C durante 2 min e eliminar o sobrenadante. Se uma terceira pessoa estiver disponível, prossiga para a etapa 7.2; caso contrário, congele rapidamente as amostras em gelo seco e pause o ensaio aqui até que a dissecção cerebral (secção 5) e a ligação cruzada (secção 6) para todos os animais estejam concluídas.</li>
	<li>Adicionar 400 μL de tampão de lise gelado por tubo.</li>
	<li>Sonicar as amostras por 1 s cinco vezes com intervalos de 5 s entre elas, mantendo as amostras no gelo.</li>
	<li>Gire amostras a 20.000 x g por 2 min para desdobrar detritos de tecido insolúveis (pellet) e salvar o sobrenadante.</li>
	<li>Utilizar 5 μL do sobrenadante para medir a concentração de proteínas utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA).</li>
	<li>Divida o restante do sobrenadante em dois tubos; um tubo contém 100 μL de sobrenadante para o western blot subsequente, e o outro tubo contém o resto (~300 μL) para armazenamento a longo prazo a -80 °C. Adicionar uma quantidade adequada de tampão de amostra SDS 4x (suplementado com β2-mercaptoetanol) às amostras e incubar a 70 °C durante 10 min.</li>
	<li>Executar 10-20 μg de proteína por poço em um gel de acrilamida para eletroforese (SDS-PAGE) e, em seguida, transferir proteínas para a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) para análise de western blot.</li>
	<li>Bloquear a membrana de PVDF em leite desnatado a 5% (p/v) dissolvido em solução salina tamponada com Tris contendo Tween-20 a 0,1% (TBS-T) por 1 h no TR.</li>
	<li>Lave brevemente a membrana duas vezes com TBS-T e incube-a com o anticorpo primário diluído em TBS-T durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lavar o anticorpo primário três vezes por 10 min cada em TBS-T na RT.</li>
	<li>Incubar a membrana com anticorpo secundário conjugado à peroxidase de raiz forte diluído em TBS-T por 1 h no TR.</li>
	<li>Lavar o anticorpo secundário três vezes por 10 min cada em TBS-T no TR.</li>
	<li>Incubar a membrana em reagente de quimioluminescência aprimorado e detectar o sinal usando o aparelho de documentação em gel.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Embora o impacto do estresse psicossocial crônico sobre comportamentos (i.e., emocionalidade e déficits cognitivos) e alterações moleculares (i.e., expressão reduzida de genes GABAérgicos e déficits associados na neurotransmissão GABAérgica) estejam bem documentados10, os mecanismos subjacentes a tais déficits precisam ser investigados mais adiante. Em particular, dado o estudo recente mostrando que o estresse crônico afeta significativamente o proteoma neuronal através da sobrecarga nas funções d...

Os receptores de neurotransmissores estão localizados na superfície da membrana plasmática neuronal ou intracelularmente nas endomembranas (por exemplo, o endossomo, o retículo endoplasmático [RE] ou o aparelho trans-Golgi) e transitam dinamicamente entre esses dois compartimentos, dependendo de estados fisiológicos intrínsecos nos neurônios ou em resposta a atividades de redes neurais extrínsecas 1,2. Uma vez que os neurotransmissores recém-secretados provocam suas funções fisiológicas principalmente através do pool de receptores localizados na superfície, os níveis de receptores de superfície para um determinado neurotransmissor são um dos determinantes críticos de sua capacidade de sinalização dentro do circuito neural3.
Vários métodos estão disponíveis para monitorar os níveis de receptores de superfície em neurônios cultivados, incluindo o ensaio de biotinilação de superfície4, o ensaio de imunofluorescência com um anticorpo específico em condições não permeabilizadas5 ou o uso de um transgene de receptor geneticamente fundido com um indicador óptico fluorescente sensível ao pH (por exemplo, pHluorin)6. Por outro lado, essas abordagens são limitadas ou impraticáveis ao avaliar os níveis de receptores de superfície in vivo. Por exemplo, o procedimento de biotinilação de superfície pode não ser prático para processar grandes quantidades e números de amostras de tecidos cerebrais in vivo devido ao seu preço relativamente alto e às etapas subsequentes necessárias para purificar as proteínas biotiniladas em esferas conjugadas com avidina. Para neurônios embutidos na arquitetura tridimensional do cérebro, a baixa acessibilidade de anticorpos ou dificuldades na quantificação baseada em microscópio podem representar uma limitação significativa para avaliar os níveis de receptores de superfície in vivo. Para visualizar a distribuição dos receptores de neurotransmissores em cérebros intactos, métodos não invasivos, como a tomografia por emissão de pósitrons, poderiam ser usados para medir a ocupação do receptor e estimar os níveis de receptores de superfície7. No entanto, essa abordagem depende criticamente da disponibilidade de radioligantes específicos, equipamentos caros e conhecimentos especiais, tornando-a menos acessível para uso rotineiro pela maioria dos pesquisadores.
Aqui, descrevemos um método simples e versátil para medir os níveis de receptores de superfície em cérebros de animais experimentais ex vivo usando um reticulante químico solúvel em água, impermeável por membrana, bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3)8,9. BS3 tem como alvo aminas primárias na cadeia lateral de resíduos de lisina e pode covalentemente reticular proteínas em estreita proximidade umas das outras. Quando fatias cerebrais são preparadas na hora a partir de uma região de interesse e incubadas em um tampão contendo BS3, os receptores de superfície celular são reticulados com proteínas vizinhas e, assim, transformam-se em espécies de maior peso molecular, enquanto os receptores intracelulares associados à endomembrana permanecem inalterados. Portanto, os pools de receptores intracelulares e de superfície podem ser separados por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE) e quantificados por western blot usando anticorpos específicos para o receptor a ser estudado.
O estresse crônico leve imprevisível (EMCU) é um paradigma experimental bem estabelecido para induzir estresse psicossocial crônico em roedores10. A SCMC provoca fenótipos comportamentais ansiosos/depressivos e déficits cognitivos por meio da modulação de uma série de sistemas de neurotransmissores, incluindo o GABA e seus receptores10,11. Em particular, o receptor GABA A contendo a subunidade α5 (α5-GABAA R) está implicado na regulação da memória e das funções cognitivas12,13, sugerindo o possível envolvimento de funções alteradas dessa subunidade em déficits cognitivos induzidos pelo SGCU. Neste protocolo, usamos o ensaio de reticulação BS3 para quantificar os níveis de α5-GABAAR expresso na superfície no córtex pré-frontal de camundongos expostos à EMCU em comparação com camundongos controles não estressados.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>2,5 M (45%, p/v) Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>4x tampão de amostra SDS (Laemmli)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3)</td><td>Pierce</td><td>A39266</td><td>Formato sem pesagem; 10 x 2 mg</td></tr><tr><td>Matriz cerebral</td><td>Ted Pella</td><td>15003</td><td>Para camundongo, 30 g adulto, coronal, 1 mm</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Sonda curva</td><td>Fine Science Tools</td><td>10088-15</td><td>Sonda de anatomia bruta; angular 45</td></tr><tr><td>Água deionizada</td><td>milli-Q</td><td>EQ 7000</td><td>Água ultrapura [resistividade 18.2 M&Omega; &middot; cm @ 25 &deg; C; carbono orgânico total (COT) &le; 5 ppb]&nbsp;</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Papel</td><td>de filtro Sigma 10197777001</td><td></td></tr><tr><td>(3MM)</td><td>Fórceps Whatman</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>(grande)</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11152-10</td><td>Fórceps Graefe Extra Fino</td></tr><tr><td>(pequeno)</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11251-10</td><td>Dumont #5 Fórceps</td></tr><tr><td>GABA-A R alfa 5 anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-31163</td><td>IgG policlonal de coelho; detectar sinal errôneo após a reticulação química</td></tr><tr><td>GABA-A R alfa 5 anticorpo C-terminal</td><td>R& D Systems</td><td>PPS027</td><td>IgG policlonal de coelho; reage de forma cruzada com camundongo e rato</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>W328707</td><td></td></tr><tr><td>Cabra conjugada com peroxidase de rábano anti-coelho IgG (H + L)</td> <td>Bio-Rad</td><td>1721019</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40, substituto (NP-40)</td><td>SantaCruz</td><td>68412-54-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel inibidor de protease</td><td>Membrana Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura (grande)</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>14007-14</td><td>Tesoura Cirúrgica - Tesoura Serrilhada</td></tr><tr><td>(pequena)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14060-09</td><td>Tesoura Fina - Cloreto de Sódio Afiado</td></tr><tr><td>(NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Qsonica Sonicator Q55)&nbsp;</td><td>Qsonica</td><td>15338284</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refregenada de mesa</td><td>Eppendorf</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>Punção de tecido (ID 1 mm)</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td>Miltex Punção de biópsia com êmbolo, ID 1,0 mm, OD 1,27 mm</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 5x Buffer de transferência</td><td>Bio-Rad</td><td>10026938</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubo (LabRoller)</td><td>Labnet</td><td>H5000</td><td></td></tr></tbody></table>

bs3 chemical crosslinking assay: avaliando o efeito do estresse crônico na apresentação do receptor gabaa na superfície celular no cérebro de roedores

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Evaluating the Effect of Chronic Stress on Cell Surface GABAA Receptor Presentation in the Rodent Brain

A ansiedade é um estado de emoção que afeta variavelmente os comportamentos dos animais, incluindo as funções cognitivas. Sinais comportamentais de ansiedade são observados em todo o reino animal e podem ser reconhecidos como respostas adaptativas ou mal-adaptativas a uma ampla gama de modalidades de estresse. Roedores fornecem um modelo experimental comprovado para estudos translacionais abordando os mecanismos integrativos da ansiedade nos níveis molecular, celular e de circuito. Em particular, o paradigma do estresse psicossocial crônico provoca respostas desadaptativas mimetizando fenótipos comportamentais semelhantes aos da ansiedade/depressão que são análogos entre humanos e roedores. Enquanto estudos anteriores mostram efeitos significativos do estresse crônico no conteúdo de neurotransmissores no cérebro, o efeito do estresse nos níveis de receptores de neurotransmissores é pouco estudado. Neste artigo, apresentamos um método experimental para quantificar os níveis de superfície neuronal de receptores de neurotransmissores em camundongos sob estresse crônico, especialmente com foco nos receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA), que estão implicados na regulação da emoção e cognição. Usando o reticulador químico irreversível impermeável à membrana, bissulfosuccinimidil suberato (BS3), mostramos que o estresse crônico diminui significativamente a disponibilidade superficial dos receptores GABAA no córtex pré-frontal. Os níveis de superfície neuronal dos receptores GABAA são o processo limitante da taxa para a neurotransmissão GABA e poderiam, portanto, ser usados como um marcador molecular ou um proxy do grau de fenótipos ansiosos/depressivos em modelos animais experimentais. Esta abordagem de reticulação é aplicável a uma variedade de sistemas receptores para neurotransmissores ou neuromoduladores expressos em qualquer região do cérebro e espera-se que contribua para uma compreensão mais profunda dos mecanismos subjacentes à emoção e cognição.

Para demonstrar a viabilidade do ensaio de reticulação BS3 para avaliar os níveis de superfície α5-GABAA R no PFC de camundongos, realizamos 10 μg de cada uma das amostras de proteína BS3-reticulada e não-reticulada em SDS-PAGE e analisamos as proteínas por western blot usando um anticorpo anti-α5-GABAAR (policlonal de coelho) (Figura 7). As amostras de proteína não-reticulada deram a quantidade total de α5-GABA A R em ~55 kDa, enquanto as amostras de proteína reticulad...

O ensaio químico de reticulação BS3 revela expressão reduzida do receptor GABAA na superfície celular em cérebros de camundongos sob condições de estresse psicossocial crônico.

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Avaliando o Efeito do Estresse Crônico na Apresentação do Receptor GABAA na Superfície Celular no Cérebro de Roedores

Anxiety is a state of emotion that variably affects animal behaviors, including cognitive functions. Behavioral signs of anxiety are observed across the ...

O ensaio químico de reticulação usando BS3 como um reticulante ajudará na determinação do nível de superfície celular do receptor do neurotransmissor, que é um determinante crítico da eficácia da transmissão neuro. Este ensaio é particularmente útil para a avaliação específica da região cerebral da dinâmica do receptor em resposta a vários agentes psicotrópicos ou modalidades de estresse psicogênico em modelos animais. Para começar, remova rapidamente o cérebro do crânio do camundongo C57BL/6J eutanasiado.Submergir em uma placa de Petri contendo PBS gelado por 10 a 15 segundos. Coloque o cérebro resfriado na matriz cerebral no gelo voltado para o lado ventral para cima. Para cortar o cérebro coronalmente, insira a primeira lâmina de barbear através da borda entre o bulbo olfatório e o pedúnculo olfativo.Usando três a quatro lâminas de barbear adicionais, corte em série a parte anterior do cérebro coronalmente em intervalos de um milímetro. Segure as lâminas de barbear inseridas juntas para levantar as fatias coronais da matriz cerebral, deixando a parte posterior para trás. Usando pinças, separe as lâminas de barbear umas das outras e coloque-as na superfície plana e gelada com a fatia cerebral voltada para cima.Para amostrar o córtex pré-frontal, escolha o segundo e o terceiro cortes posteriores ao primeiro corte contendo o pedúnculo olfatório. Usando um punch de tecido ou pinça, remova a região desejada. Coloque o tecido sobre a lâmina de barbear gelada e divida uniformemente em dois pedaços.Use a ponta fina da pinça para picar cada tecido em pedaços na lâmina de barbear com vários movimentos verticais. Cravar o tubo marcado pré-resfriado contendo líquido cefalorraquidiano artificial com 30 microlitros de solução BS3 ou solução veicular E.Em seguida, transfira imediatamente os tecidos picados para o tubo desejado. Para amostrar o hipocampo, remova a parte posterior do cérebro da matriz e coloque-a em papel de filtro umedecido em uma superfície plana resfriada com o lado dorsal voltado para cima.Com uma sonda curva e pinça se aproximando do lado dorsal, disseque o hipocampo de ambos os hemisférios, em seguida, picar o tecido e transferi-lo para tubos pontilhados apropriados, como demonstrado anteriormente. Para reação de reticulação, inverta o tubo contendo tecido e solução para quebrar os pedaços de tecido em pequenos pedaços. Incubar as amostras no tubo rotador a 4 graus Celsius por 30 minutos a 2 horas e registrar o tempo de início da incubação BS3 para cada tubo.Em seguida, extinguir a reação com 78 microlitros de glicina molar. Incubar ainda mais por 10 minutos a 4 graus Celsius com rotação constante e registrar o tempo de início e término para a têmpera. Na análise de western blot após a reticulação BS3, a proteína não-reticulada mostrou a quantidade total de alfa5-subunidade do receptor GABA-A em aproximadamente 55 quilodaltons.No entanto, a proteína reticulada BS3 mostrou a subunidade alfa5-associada à endomembrana do receptor GABA-A migrando a aproximadamente 55 quilodaltons, juntamente com espécies proteicas de maior peso molecular representando complexos proteicos covalentemente reticulados à subunidade alfa5 do receptor GABA-A. Além disso, uma redução significativa e progressiva na subunidade alfa5 de superfície dos níveis do receptor GABA-A foi observada no córtex pré-frontal em três semanas e cinco semanas de UCMS em comparação com os camundongos controle sem estresse. Sabe-se que os receptores transitam entre a superfície da membrana plasmática e a membrana interna à temperatura ambiente.Por isso, a realização da dissecção tecidual em baixa temperatura é importante. Utilizando o ensaio de crosslinking, foi revelado que o estresse psicossocial pode modular significativamente os níveis de superfície de receptores GABA que em parte serve como uma base molecular para ansiedade, comportamento, ou déficits cognitivos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um modelo de rato do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), que revela as alterações persistentes na função neuroendócrina eo atraso de longo prazo, resposta de medo exagerado, característico de pacientes com TEPT. O modelo animal e os métodos descritos aqui são úteis para correlacionar biomarcadores em núcleos do cérebro, que são mecanicista, mas não pode ser medido em pacientes com biomarcadores em células brancas do sangue periférico, os quais podem.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Este vídeo demonstra a reticulação de proteínas de superfície neuronal usando suberato de bis-sulfossuccinimidil ou BS3. O cérebro isolado e resfriado do camundongo é seccionado coronalmente. A região desejada é extraída das seções, picada e tratada com BS3. O BS3 reticula proteínas de superfície como os receptores GABA, deixando as proteínas internas inalteradas. A reação é extinta com glicina antes de processar as amostras para análise posterior.

Reticulação de proteínas de superfície neuronal no cérebro de camundongos usando um ensaio de reticulação química

Grânulos de estresse (SGs) são grânulos de RNA citoplasmático contendo partículas paralisadas ribonucleoproteínas (RNPs), e importante na resposta celular a várias tensões. Dinâmica da SGS pode ser seguido em células vivas, visualizando a localização de um componente marcado da SGS em células primárias transfectadas após o estresse.

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

O protocolo de estresse leve crônico imprevisível (UCMS) é um método validado para estudar mudanças comportamentais e fisiológicas associadas ao estresse crônico e sintomas depressivos. Oito semanas de imposição do protocolo UCMS induzem mudanças comportamentais e maus resultados de saúde em roedores de ambos os sexos.

Uma crônica Protocolo de estresse leve Imprevisível para sintomas depressivos Instigando, mudanças de comportamento e resultados negativos de saúde em Roedores

Aqui nós apresentamos o protocolo imprevisíveis stress leve crônica em ratos. Este protocolo induz um fenótipo de depressivo, como a longo prazo e permite avaliar a eficácia dos antidepressivos putativos em reverter os défices de depressiva como comportamentais e neuromolecular.

O protocolo de estresse suave crônico imprevisível para induzir Anhedonia em ratos

Aqui, descrevemos o protocolo e a implementação de metil-Seq, uma plataforma de epigenomic, usando um modelo do rato para identificar alterações epigenéticas associadas com exposição de estresse crônico. Os resultados demonstram que a plataforma de metil-Seq rato é capaz de detectar diferenças de metilação que surgem a partir da exposição de estresse em ratos.

Uma plataforma de Metil-Seq de Rato para identificar alterações epigenéticas associadas à exposição ao estresse

Este artigo fornece um protocolo simplificado e estandardizado para a indução do comportamento depressivo-como em ratos cronicamente imobilizados usando um restringidor. Além disso, explicam-se comportamentos e técnicas fisiológicas para verificar a indução da depressão.

Um protocolo de estresse de imobilização crônica para induzir o comportamento semelhante à depressão em camundongos

A tarefa da barreira do labirinto Y é um teste de comportamento que examina a motivação para gastar esforço para recompensa. Aqui, discutimos o teste de múltiplos estressores crônicos bem validados, incluindo corticosterona crônica e estresse de derrota social com esse comportamento, bem como o novo estresse crônico de derrota social não discriminatória (CNSDS), que é eficaz nas mulheres.

Estresse crônico muda comportamento de escolha relacionado ao esforço em uma tarefa de barreira y-maze em camundongos

Este protocolo descreve um modelo de estresse leve imprevisível crônico (CUMS) para depressão baseado na teoria médica mongol, juntamente com métodos para validar testes comportamentais.

Estresse Leve Imprevisível Crônico em Ratos com base na medicina mongol

Ao integrar quatro estressores sociais diários, o presente estudo descreve um modelo de estresse social integrado múltiplo (MISS) para transtornos psiquiátricos em camundongos C57BL / 6J fêmeas. Após dez dias de exposição repetida ao MISS, os camundongos desenvolveram fenótipos depressivos e ansiosos, fornecendo assim um modelo animal natural baseado em etiologia para estudar transtornos psiquiátricos em mulheres.

Um modelo de estresse social integrado múltiplo para transtornos psiquiátricos em camundongos C57BL / 6J fêmeas

Este artigo aborda os procedimentos para induzir respostas ao estresse usando o estresse de contenção física em camundongos e ratos. Considerações adicionais que devem ser observadas ao selecionar e usar o estresse de contenção em modelos de roedores são discutidas.

Contenção para induzir estresse em camundongos e ratos

Aprenda a usar o ensaio de reticulação química BS3 para avaliar a expressão do receptor GABA A na superfície celular em cérebros de camundongos submetidos a estresse crônico. Este método revela adaptações moleculares ligadas à ansiedade.

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Avaliando o Efeito do Estresse Crônico na Apresentação do Receptor GABAA na Superfície Celular no Cérebro de Roedores (Vídeo) | JoVE Journal

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Avaliando o Efeito do Estresse Crônico na Apresentação do Receptor GABA_A na Superfície Celular no Cérebro de Roedores

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