Measuring Embryonic Viability and Brood Size in <em>Caenorhabditis elegans</em>

Ji Kent Kwah; Aimee Jaramillo-Lambert

doi:10.3791/65064

Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

JoVE Journal
Genetics

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JoVE Journal Genetics

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

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February 24, 2023

DOI: 10.3791/65064-v

Ji Kent Kwah¹, Aimee Jaramillo-Lambert¹

¹Department of Biological Sciences,University of Delaware

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a method for determining embryonic viability and brood size in the model organism C. elegans. The protocol is designed for novice researchers and provides clear instructions for assessing developmental processes.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Developmental Biology
Genetics

Background

Brood size and embryonic viability are critical indicators of developmental health.
Defects in these areas can signal issues in myosis, fertilization, and embryogenesis.
Understanding these processes is essential for genetic studies in C. elegans.
Identification of embryos versus unfertilized eggs is a key challenge for researchers.

Purpose of Study

To provide a standardized method for measuring brood size and embryonic viability.
To assist novice researchers in conducting experiments with C. elegans.
To facilitate the identification of genetic factors affecting development.

Methods Used

Transfer of individual L4 stage hermaphrodites to culture plates.
Scoring of embryos and larvae at specified intervals.
Use of differential cell counters for accurate counting.
Recording observations in laboratory notebooks for data accuracy.

Main Results

The viability percentage for the N2 strain was 98.9%.
Strains him-5(e1490) and spo-11(ok79) showed reduced viability at 74.9% and 0.8%, respectively.
The average brood sizes were 217 for N2, 105 for him-5(e1490), and 219 for spo-11(ok79).
Familiarity with C. elegans developmental stages is crucial for accurate data collection.

Conclusions

This method is a valuable first step in genetic studies related to development.
Clear identification of developmental stages enhances data reliability.
Further cytological analyses can follow to explore disrupted processes.

Frequently Asked Questions

What is the significance of brood size in C. elegans?

Brood size is an important indicator of reproductive success and developmental health in C. elegans.

How can I identify embryos versus unfertilized eggs?

Practice is essential; familiarize yourself with the different developmental stages using images and a microscope.

What temperature should be maintained during the experiment?

The standard culturing temperature is 20 degrees Celsius.

What tools are recommended for counting larvae and embryos?

A differential cell counter and a gridded plate are recommended for accurate counting.

How do I record my observations?

Observations should be meticulously recorded in a laboratory notebook for data accuracy.

What challenges might I face when conducting this experiment?

Identifying embryos and ensuring proper mating between hermaphrodites and males can be challenging.

Aqui, apresentamos um método geral para determinar a viabilidade embrionária e o número total de embriões produzidos (ninhada) usando o organismo modelo C. elegans.

Este protocolo para determinar o tamanho da ninhada e a viabilidade embrionária é usado por muitos laboratórios de C.elegans. Diminuições no tamanho bruto e na viabilidade embrionária podem indicar defeitos em processos importantes de desenvolvimento, como miose, fertilização e embriogênese. Esta técnica fornece instruções claras para pesquisadores iniciantes em C.elegans.

É relativamente simples de configurar e executar, e é um ótimo ponto de partida ao trabalhar com novas cepas mutantes. O maior desafio dessa técnica é a identificação embrionária versus embrião não fertilizado. Novos pesquisadores devem praticar a identificação de embriões, ovócitos e os diferentes estágios larvais antes de iniciar esses experimentos.

Para começar, rotule a parte de trás da placa, transfira um hermafrodita de estágio L4 individual para a placa. Certifique-se de que nenhum embrião ou outro verme seja transferido para o prato. Permita que os vermes se desenvolvam em adultos e coloque a autoprogênie por 24 horas na temperatura padrão de cultivo de 20 graus Celsius.

Marque o prato no terceiro dia. No dia seguinte, rotule um conjunto de novas placas e transfira no dia um verme individual para a nova placa. Deixe os vermes depositarem embriões por 24 horas a 20 graus Celsius.

Marque o prato no quarto dia. No terceiro dia, rotule um conjunto de novas placas e transfira os vermes individuais do dia dois para a nova placa. Deixe os vermes depositarem progênie por 24 horas a 20 graus.

Marcar o prato no quinto dia. Desenhe um padrão de grade em uma tampa de 35 milímetros usando um marcador fino. Coloque a tampa quadriculada sob a placa de teste para contagem para acompanhar os vermes previamente contados.

Usando um contador de células diferenciais, conte as larvas vivas e embriões não eclodidos dentro do quadrado individual. Para vermes nas bordas quadradas, conte com base na localização da cabeça do verme. Conte vermes com cabeças tocando as bordas superior e esquerda do quadrado.

Registre o número de larvas vivas e embriões não eclodidos em um caderno de laboratório. No quarto dia, marque a placa do segundo dia contando as larvas vivas e os embriões não eclodidos e registre-os em um caderno de laboratório. No quinto dia, marque a placa do dia três contando as larvas vivas e os embriões não eclodidos e registre-os em um caderno de laboratório.

Depois de rotular a parte de trás da placa, transfira um verme Hermafrodita L4 individual para a placa. Certifique-se de que nenhum embrião ou outro verme seja transferido para o prato. Transfira um único verme macho L4 para a placa contendo um Hermafrodita L quatro.

Deixe os vermes acasalarem e colocarem progênie por 24 horas a 20 graus Celsius. Marcar a placa para larvas vivas versus embriões não eclodidos no terceiro dia. No dia seguinte, rotule um conjunto de novas placas e transfira o hermafrodita e o macho para a nova placa.

Certifique-se de que o hermafrodita atingiu a idade adulta. Deixe os hermafroditas depositarem progênie por 24 horas a 20 graus Celsius. Marcar a placa para larvas vivas versus embriões não eclodidos no quarto dia.

No terceiro dia, rotule um conjunto de novas placas e transfira o hermafrodita e o macho para a nova placa. Deixe os vermes depositarem progênie por 24 horas a 20 graus. Marcar a placa para embriões vivos versus não eclodidos no quinto dia.

Usando um contador de células diferenciais, conte as larvas vivas e os embriões não eclodidos a partir do primeiro dia e registre-os em um caderno de laboratório. No quarto dia, conte a progênie viva e os embriões não eclodidos a partir do segundo dia e registre-os em um caderno de laboratório. Confira o prato do dia um para os machos.

Se o acasalamento ocorreu, a proporção genética esperada de hermafroditas para machos é de 50 a 50. Se no dia um prato não contiver machos, não ocorreu acasalamento entre o macho e o hermafrodita. Descarte esse par de acasalamento e registre a observação no caderno de laboratório.

No quinto dia, conte as larvas vivas e os embriões não eclodidos a partir da placa do terceiro dia e registre-os em um caderno de laboratório. O ensaio de viabilidade embrionária para N2 produziu um percentual de viabilidade de 98,9%, enquanto ele-5(e1490) e spo-11(ok79) mostraram uma redução na viabilidade embrionária com um percentual de 74,9% e 0,8%, respectivamente. O tamanho médio da ninhada de N2, him-5(e1490) e spo-11(ok79) foi determinado como sendo 217, 105 e 219, respectivamente.

O reconhecimento dos vários estágios do desenvolvimento de C.elegans é importante para dados precisos e reprodutíveis. Recomendamos familiarizar-se com o desenvolvimento de vermes usando imagens e um microscópio dissecante. Este procedimento é um ótimo primeiro passo para determinar se um gene está envolvido em um processo de desenvolvimento e pode ser seguido por análises citológicas para determinar qual processo é interrompido.