Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular
3 de março de 2023
Neste trabalho, um protocolo de decelularização foi otimizado para obter matrizes descelularizadas do músculo esquelético fetal de camundongos. Os mioblastos C2C12 podem colonizar essas matrizes, proliferar e diferenciar-se. Este modelo in vitro pode ser utilizado para estudar o comportamento celular no contexto de doenças musculares esqueléticas, como as distrofias musculares.
Até onde sabemos, este protocolo é o primeiro a produzir matrizes decelularizadas a partir do músculo esquelético fetal, fornecendo uma nova abordagem para o estudo de miopatias que começam a se desenvolver no útero. Este protocolo gera uma métrica de desenvolvimento e tecido-específica que pode ser usada para estudar o comportamento das células musculares e interações com a matriz extracelular em um ambiente controlado. A DMC-LAMA2 é uma distrofia muscular congênita que começa a se manifestar ao nascimento.
Esse modelo pode ajudar a desvendar os mecanismos padrão envolvidos em seu início e levar a novas terapias-alvo. Este protocolo pode ser adaptado a diferentes tecidos e modelos de doenças. Diferentes níveis de complexidade podem ser alcançados dependendo da matriz e dos tipos celulares, demonstrando a versatilidade do sistema.
Este é um protocolo muito simples. A parte mais desafiadora é a coleta e o manuseio das amostras. Mas, com a prática, as habilidades técnicas podem ser facilmente melhoradas.
Comece transferindo um feto eutanasiado de cada vez para uma placa de Petri contendo PBS gelado. Depois de excisar a pele e os membros, corte o lado ventral da caixa torácica. Remova o esterno e os órgãos subjacentes.
Posicione os fetos dorsais para cima e remova a porção cervical da coluna vertebral. Em seguida, excise os depósitos de gordura dorsal e o tecido conjuntivo muscular profundo das costas. Agora, ancore a caixa torácica usando pinças cirúrgicas.
Com um microbisturi, raspe cuidadosamente para separar os músculos profundos das costas do tecido circundante. Armazenar os tecidos em PBS em uma placa de cultura celular de 12 poços a quatro graus Celsius para uso futuro. Por um período mais longo, armazene o tecido em um tubo de microcentrífuga vazio a 80 graus Celsius negativos.
No primeiro dia, utilizar massas musculares epaxiais inteiras. Adicionar três mililitros de tampão hipotônico contendo 1% de penicilina e estreptomicina a cada poço de uma placa de 12 poços. Adicione um fragmento de tecido muscular a cada poço e incube durante a noite por 18 horas com agitação.
No segundo dia, remova o tampão com uma pipeta de ponta fina. Agora lave as amostras três vezes com três mililitros de PBS com uma agitação de uma hora de cada vez. Após o descarte do PBS, incubar as amostras em três mililitros de solução detergente SDS a 0,05% por 24 horas com agitação.
No terceiro dia, utilizar uma pipeta fina para retirar o detergente SDS e lavar os fragmentos três vezes com três mililitros de tampão de lavagem hipotônico com agitação de 20 minutos cada vez. Substitua a solução dos poços por dois mililitros de solução de DNase e incube os fragmentos de tecido a 37 graus Celsius por três horas com agitação. Após a remoção da solução de DNase, lave os fragmentos três vezes com três mililitros de PBS com uma agitação de 20 minutos de cada vez, deixando a última lavagem durante a noite.
A um frasco T-25 semeado com células C2C12 subconfluentes, adicionar 500 microlitros de tripsina e ressuspender em um mililitro de meio completo. Misturar 10 microlitros da suspensão com 10 microlitros de corante azul de tripano e carregar em um hemocitômetro para contar o número de células e estimar a viabilidade. Em uma capela de fluxo laminar, colocar as matrizes decelularizadas, ou dECMs, em uma placa de Petri contendo PBS com penicilina a 1% e estreptomicina.
Usando um microbisturi e uma pinça, separe as matrizes em pequenos pedaços. Transfira os fragmentos para os poços de uma placa de 96 poços, colocando de três a quatro pedaços por poço. Adicione 200 microlitros de meio de cultura completo pré-aquecido em cada poço e incube a placa por duas horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Descarte o meio na placa do poço e adicione 200 microlitros de meio de cultura completo contendo 50.000 células C2C12 viáveis a cada poço. Incubar a placa do poço por dois dias. Transfira as dECMs com as células para uma placa de 48 poços contendo 400 microlitros de meio de cultura completo.
Aspirar cuidadosamente o meio a cada dois dias para evitar o descolamento da matriz e reabastecer com o meio fresco até o oitavo dia. Para diferenciação, substituir o meio de cultura completo por um meio de diferenciação e incubar por quatro dias até o 12º dia. O tecido muscular ficou avermelhado imediatamente após o isolamento e ficou esbranquiçado devido à lise celular após incubação em tampão hipotônico.
SDS faz com que os músculos se tornem transparentes. Após o tratamento com DNase, obteve-se uma dECM menor e transparente. A quantificação do DNA revela uma diminuição de quase 100% nas dECMs em comparação com o tecido nativo.
As dECMs e o tecido nativo apresentaram coloração tubular semelhante para laminina alfa dois e proteína laminina. A análise por Western blot do tecido nativo mostrou duas bandas para a subunidade dois da laminina alfa, enquanto três bandas menores foram detectadas na dMEC. Para as lamininas totais, as amostras de dECM apresentaram fragmentação proteica quando comparadas ao tecido nativo.
A fibronectina e o colágeno I estavam presentes no espaço intersticial entre as células do tecido nativo e as dECMs. Bandas de fibronectina semelhantes estavam presentes em ambas as amostras, indicando que ela não é afetada pela decelularização. Menos bandas de colágeno I foram observadas nas dECMs.
Para colágeno IV, ambas as amostras apresentaram coloração tubular semelhante. Entretanto, o peso molecular das bandas dECM foi menor. As células C2C12 colonizaram e proliferaram nas dECMs e se fundiram em miotubos multinucleados.
Estes expressaram miosina-proteína de cadeia pesada após quatro dias de incubação em meio de diferenciação. Colorações intracelulares e pericelulares foram observadas para laminina alfa de duas cadeias, lamininas totais e fibronectina. Scaffolds esqueléticos fetais de camundongos descelularizados podem ser usados para cultivar células em sistemas de co-cultura, aproximando-as da situação in vivo e, portanto, contribuindo para o entendimento da doença muscular.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um novo protocolo de descelularização para músculo esquelético fetal de camundongo, permitindo a criação de matrizes que suportam a colonização, proliferação e diferenciação de mioblastos C2C12. Este modelo in vitro serve como uma ferramenta valiosa para investigar doenças do músculo esquelético, particularmente aquelas que se desenvolvem in utero.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Fisiologia Muscular
Contexto
- As matrizes descelularizadas fornecem um andarilho para o estudo do comportamento celular.
- As distrofias musculares, como a LAMA2-CMD, manifestam-se precocemente no desenvolvimento.
- Compreender as interações das células musculares com a matriz extracelular é essencial para o desenvolvimento de terapias.
- Este protocolo é adaptável para diversos tecidos e modelos de doenças.
Objetivo do Estudo
- Otimizar um protocolo de descelularização para músculo esquelético fetal.
- Criar um modelo para estudar miopatias que começam in utero.
- Investigar o comportamento de células musculares em um ambiente controlado.
Métodos Utilizados
- Descelularização do músculo esquelético de camundongo fetal.
- Colonização das matrizes com mioblastos C2C12.
- Avaliação da proliferação e diferenciação de mioblastos.
- Avaliação do comportamento celular em relação à matriz extracelular.
Resultados Principais
- Criação bem-sucedida de matrizes descelularizadas a partir de músculo esquelético fetal.
- Os mioblastos C2C12 foram capazes de proliferar e se diferenciar nessas matrizes.
- O modelo pode elucidar os mecanismos subjacentes às distrofias musculares congênitas.
- A versatilidade do protocolo permite sua adaptação para diferentes tecidos e contextos de doenças.
Conclusões
- O protocolo de descelularização otimizado é um avanço significativo para a pesquisa muscular.
- Este modelo pode levar à identificação de novos alvos terapêuticos para as distrofias musculares.
- Estudos futuros podem aproveitar esta abordagem para diversas investigações de miopatias.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Matrizes tridimensionais descelularizadas de músculo esquelético fetal de camundongo permitem a modelagem relevante à doença de interações célula-MEC, abordando uma lacuna crítica na pesquisa de doenças musculares em estágios iniciais. Esta plataforma apoia a redução de riscos mecanicistas e a validação de alvos para miopatias congênitas, como a LAMA2-CMD, ao recapitular microambientes nativos. A abordagem aumenta a confiança preditiva para decisões em estágios translacionais e pré-clínicos em portfólios de doenças musculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos da doença subjacentes aos distúrbios musculares congênitos em um contexto fisiologicamente relevante.
- Apoia a validação funcional de alvos ao modelar interações célula-MEC implicadas no início da doença.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas para alvos candidatos ao fornecer um ambiente matricial controlado e semelhante ao nativo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece um substrato 3D validado para avaliação quantitativa da proliferação e diferenciação de mioblastos.
- Melhora a reprodutibilidade do ensaio e a relevância biológica em comparação com sistemas de cultura 2D.
- Permite a preparação de matrizes padronizadas para fluxos de trabalho de triagem de compostos ou genéticos downstream.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro com a composição e arquitetura da matriz extracelular relevantes para a doença, garantindo continuidade translacional.
- Permite o avanço de hipóteses terapêuticas ajustado ao risco, modelando processos iniciais da doença.
- Oferece adaptabilidade para modelar outras doenças do músculo esquelético com envolvimento da matriz extracelular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de matriz descelularizada conecta a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica ao permitir a realização de testes de hipóteses em um ambiente tridimensional semelhante ao nativo.
- Biologia da Descoberta: Facilita estudos mecanicistas da sinalização célula-MEC e da iniciação de doenças.
- Triagem: Fornece uma plataforma reprodutível para avaliação do comportamento celular e remodelação da matriz.
- Análises: Permite leituras quantitativas de proliferação, diferenciação e expressão de proteínas da MEC.
- Pesquisa Translacional: Aumenta a relevância para doenças no desenvolvimento de modelos pré-clínicos e alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Protocolo adaptável para diversos modelos de doenças musculares e sistemas de co-cultivo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na modelagem de doenças musculares.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação da matriz 3D para fluxos de trabalho reprodutíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do projeto ao fornecer dados funcionais relevantes para a doença no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e modelos para doenças musculares congênitas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecido fetal e técnicas de descelularização.
- Necessita de acesso à infraestrutura de cultura celular, histológica e de análise de proteínas.
- Exige padronização entre equipes para os protocolos de preparação da matriz e semeadura celular.
- Adaptável a diferentes tecidos musculares e modelos de doenças mediante otimização do protocolo.
- O manuseio das amostras e a habilidade técnica são fundamentais para a reprodutibilidade e integridade da matriz.
