Name: Predição de Farmacologia de Rede e Validação Metabolômica do Mecanismo de Fructus Phyllanthi contra Hiperlipidemia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda a usar farmacologia de rede e metabolômica para investigar os mecanismos do Fructus Phyllanthi contra a hiperlipidemia. Este método integrado identifica compostos ativos e alvos terapêuticos em medicamentos naturais.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Equipe de Desenvolvimento e Inovação de Produtos da TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) e Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".

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<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemical+analysis+using+UPLC-MSn+combined+with+network+pharmacology+approaches+to+explore+the+biomarkers+for+the+quality+control+of+the+anticancer+tannin+fraction+of+Phyllanthus+emblica+L.+habitat+in+Nepal%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791(2021).</li>
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<li>Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+main+components+of+Tibetan+medicine+Phyllanthus+emblica+L%5BTitle%5D)+AND+%22World+Science+and+Technology-Modernization+of+Traditional+Chinese+Medicine+and+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L.</a> World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).</li>
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</ol>

Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Nos últimos anos, a taxa de incidência de hiperlipidemia vem aumentando, principalmente devido a hábitos alimentares não saudáveis a longo prazo. A MTC e seus ingredientes químicos possuem diversas atividades farmacológicas, as quais têm sido amplamente estudadas nos últimos anos37,38. O PF é um tipo de recurso frutífero, utilizado tanto como medicamento quanto como alimento, e tem um importante potencial para o tratamento da hiperlipidemia. Entretanto, o potenci...

A hiperlipidemia é uma doença metabólica comum e de sérios impactos na saúde humana, sendo também o principal fator de risco para doençascardiovasculares1. Recentemente, tem havido uma tendência de queda relacionada à idade para essa doença, e pessoas mais jovens tornaram-se mais suscetíveis devido a estilos de vida irregulares de longo prazo e hábitos alimentares não saudáveis2. Na clínica, vários medicamentos têm sido utilizados para tratar a hiperlipidemia. Por exemplo, uma das drogas mais comumente usadas para pacientes com hiperlipidemia e distúrbios ateroscleróticos relacionados são as estatinas. Entretanto, o uso prolongado de estatinas apresenta efeitos colaterais que não podem ser negligenciados, os quais levam a um prognóstico ruim, como intolerância, resistência ao tratamento e eventos adversos 3,4. Essas deficiências tornaram-se dores adicionais para pacientes com hiperlipidemia. Portanto, novos tratamentos para eficácia hipolipemiante estável e menos efeitos colaterais devem ser propostos.
A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento de doenças devido à sua boa eficácia e poucos efeitos colaterais5. Fructus Phyllanthi (FP), fruto seco de Phyllanthus emblica Linn. (popularmente conhecida como amla berry ou groselha indiana), é um famoso medicamento e material homólogo alimentar dos medicamentos tradicionais chineses e indianos 6,7. Este medicamento tem sido utilizado para limpar o calor, resfriar o sangue e promover a digestão, de acordo com as teorias da MTC8. Estudos farmacológicos modernos têm demonstrado que o FP é rico em compostos bioativos como ácidos gálicos, ácidos elágicos e quercetina9, que são responsáveis por uma gama de propriedades biológicas multifacetadas, atuando como antioxidante, anti-inflamatório, proteção hepática, anti-hipolipidaemic, e assim por diante10. Pesquisas recentes também mostraram que o PF poderia efetivamente regular os lipídios sanguíneos de pacientes com hiperlipidemia. Por exemplo, Variya et al.11 demonstraram que o suco de fruta FP e seu principal ingrediente químico ácido gálico podem diminuir o colesterol plasmático e reduzir a infiltração de óleo no fígado e na aorta. A eficácia terapêutica foi relacionada à regulação do PF em aumentar a expressão do receptor alfa ativado por proliferadores de peroxissoma e diminuir a atividade lipogênica hepática. No entanto, o mecanismo subjacente do PF na melhora da hiperlipidemia deve ser mais investigado, pois seus ingredientes bioativos são bastante extensos. Procuramos explorar o mecanismo potencial da eficácia terapêutica do FP, que pode ser benéfico para o desenvolvimento e utilização deste medicamento.
Atualmente, a farmacologia de redes é considerada uma técnica holística e eficiente para estudar o mecanismo terapêutico da MTC. Em vez de procurar genes causadores de doenças únicas e drogas que tratam apenas um alvo individual, uma rede completa de fármacos-ingredientes-genes-doenças é construída para encontrar o mecanismo multi-alvo do medicamento multiingrediente em relação ao seu tratamento abrangente12. Esta técnica é especialmente adequada para MTC, pois suas composições químicas são maciças. Infelizmente, a farmacologia de rede só pode ser usada para prever alvos afetados por ingredientes químicos em teoria. Os metabólitos endógenos no modelo de doença devem ser observados para validar a eficácia da farmacologia da rede. O método metabolômico, que surge com o desenvolvimento da biologia de sistemas, é uma importante ferramenta para o monitoramento das alterações nos metabólitosendógenos13. As mudanças nos metabólitos refletem as mudanças no estado estacionário do hospedeiro, o que também é um indicador importante para o estudo do mecanismo interno. Alguns pesquisadores conseguiram integrar farmacologia e metabolômica de redes para explorar o mecanismo de interação entre drogas e doenças14,15.
Este artigo explora as bases mecanicistas do PF contra a hiperlipidemia integrando farmacologia de rede e técnicas metabolômicas. A farmacologia de rede foi aplicada para analisar a relação entre os principais princípios ativos do PF e alvos moleculares para hiperlipidemia. Posteriormente, foi realizada metabolômica para observar a alteração de metabólitos endógenos no modelo animal, o que pode explicar as ações da medicina em nível metabólico. Em comparação com a aplicação da farmacologia de rede ou metabonômica isoladamente, esta análise integrada forneceu um mecanismo de pesquisa mais específico e abrangente. Adicionalmente, a estratégia de acoplamento molecular foi utilizada para analisar a interação entre ingredientes ativos e proteínas-chave. Em geral, essa abordagem integrada poderia compensar a falta de evidências experimentais para farmacologia de rede e a falta de um mecanismo endógeno para o método metabolômico, e pode ser usada para a análise do mecanismo terapêutico da medicina natural. O fluxograma esquemático principal do protocolo é mostrado na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>101-3B Forno</td><td>Luyue Instrumento e Fábrica</td> <td>de Equipamentos \</td><td></td></tr> <tr><td>80312 / 80302 Slide de vidro</td><td>Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>80340-1630 Lamínula</td><td>Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>AccucoreTM C18 (3 mm e vezes; 100 mm, 2. 6 &mu; m)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Chemical</td><td>A998</td><td>Versão 1.5.6</td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS T3 Coluna (2,1 mm &vezes; 100 mm, 1,8 &mu; m)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>Aethanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A995</td><td>Versão 3.0</td></tr><tr><td>Solução de amônia</td><td>Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD</td><td>1336-21-6</td><td>Versão 3.9.1</td></tr><tr><td>AutoDockTools</td><td>Scripps Instituição de Oceanografia</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>BS-240VT Sistema de Detecção Bioquímica Animal Totalmente automático Shenzhen</td><td>Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.</td><td>\</td><td></td></tr> <tr><td>Compound Discoverer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>Cytoscape Cytoscape</td><td>Consortium</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>DM500 Microscópio Óptico</td><td>Leica</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>DV215CD Balança Eletrônica</td><td>Ohaus Corporation., Ltd</td><td>T15A63</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Etílico</td><td>Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD</td><td>64-17-5</td><td></td></tr>Kit de ensaio de ácido <tr><td>fórmico</td><td>Fisher Chemical</td><td>A118</td><td></td></tr><tr><td>HDL-C</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>A112-1-1</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração de hematoxilina</td><td>Biosharp</td><td>BL700B</td><td></td></tr><tr><td>Dieta rica em gordura</td><td>ENSIWEIER</td><td>202211091031</td><td></td></tr><tr><td>Hitachi CT15E / CT15RE Centrifuge</td><td>Hitachi., Ltd.</td><td>\</td><td></td></tr> <tr><td>Homogeneizador</td><td>Oulaibo Technology Co., Ltd</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de formação de imagem</td><td>LIOO</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>JB-L5 Freezer</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>JB-L5 Incorporador de tecidos</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>JK-5/6 Micrótomo</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>JT-12S Hidroextrator</td><td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>KQ3200E Limpador Ultrassônico</td><td>Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio LDL-C</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>A113-1-1</td><td></td></tr><tr><td>Macho C57BL/6 Camundongos</td><td>&nbsp; SBF Biotecnologia Co., Ltd.</td><td>\</td> <td>Versão 2.3.2</td></tr><tr><td>Bálsamo neutro</td><td>Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd</td><td>10021190865934</td><td></td></tr><tr><td>água pura</td><td>Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd</td><td>GB19298</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td> <td>\</td> <td>Versão 14.1</td></tr><tr><td>RE-3000 Evaporador Rotativo</td><td>Yarong Biochemical Instrument Factory., Ltd</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>RM2016 Micrótomo patológico</td><td>Shanghai Leica Instruments Co., Ltd</td> <td>\</td> <td>Versão 26.0</td></tr><tr><td>SIMCA-P</td><td>Umetrics AB</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>Sinvastatina</td><td>Merck Afiado e Dohme., Ltd</td><td>14202220051</td><td></td></tr><tr><td>SPSS</td><td>International Business Machines Corporation</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>TC Kit de ensaio</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>A111-1-1</td><td></td></tr><tr><td>TG Kit de ensaio</td><td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td><td>A110-1-1</td><td></td></tr><tr><td>UPLC-Q-Exactive Quadrupole Campo eletrostático Orbital Hidrazina Espectrometria</td> <td>de massa de alta resoluçãoThermo Fisher Scientific</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>Vortex Vibrador</td><td>Beijing PowerStar Technology Co., Ltd.</td><td>LC-Vortex-P1</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

predição de farmacologia de rede e validação metabolômica do mecanismo de fructus phyllanthi contra hiperlipidemia

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

A hiperlipidemia tornou-se um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares e lesões hepáticas em todo o mundo. Fructus Phyllanthi (FP) é uma droga eficaz contra a hiperlipidemia nas teorias da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) e da Medicina Indiana, porém o mecanismo potencial requer maior exploração. A presente pesquisa tem como objetivo revelar o mecanismo do PF contra hiperlipidemia a partir de uma estratégia integrada combinando predição farmacológica de rede com validação metabolômica. Um modelo de camundongos induzidos por dieta hiperlipídica (DHL) foi estabelecido avaliando os níveis de lipídios plasmáticos, incluindo colesterol total (CT), triglicérides (TG), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C). A farmacologia de rede foi aplicada para descobrir os princípios ativos do PF e potenciais alvos contra a hiperlipidemia. Metabolômica do plasma e fígado foi realizada para identificar metabólitos diferenciais e suas vias correspondentes entre o grupo normal, grupo modelo e grupo intervenção. A relação entre farmacologia de rede e metabolômica foi construída para obter uma visão abrangente do processo de PF contra hiperlipidemia. As proteínas-alvo obtidas foram verificadas por acoplamento molecular. Esses resultados refletiram que o PF melhorou os níveis de lipídios plasmáticos e a lesão hepática da hiperlipidemia induzida por uma DH. Ácido gálico, quercetina e beta-sitosterol em FP foram demonstrados como os principais compostos ativos. Um total de 16 e seis potenciais metabólitos diferenciais no plasma e fígado, respectivamente, foram encontrados envolvidos nos efeitos terapêuticos do PF contra a hiperlipidemia por metabolômica. Além disso, a análise de integração indicou que os efeitos da intervenção estavam associados com CYP1A1, AChE e MGAM, bem como o ajuste de L-quinurenina, corticosterona, acetilcolina e rafinose, envolvendo principalmente a via do metabolismo do triptofano. O acoplamento molecular garantiu que os ingredientes acima atuando em alvos proteicos relacionados à hiperlipidemia desempenhassem um papel fundamental na redução de lipídios. Em síntese, esta pesquisa proporcionou uma nova possibilidade para a prevenção e tratamento da hiperlipidemia.

Farmacologia de rede Um total de 18 ingredientes potenciais em FP foram triados de acordo com suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas a partir do banco de dados e análise de LC-MS (os cromatogramas de íons totais são mostrados na Figura Suplementar 1). Através da literatura pertinente, o teor de ácido gálico é muito superior ao de outros ingredientes e é eficaz na redução de lipídios 9,11. Portanto, este ingredie...

O presente protocolo descreve uma estratégia integrada para explorar os principais alvos e mecanismos de Fructus Phyllanthi contra hiperlipidemia baseada na predição de farmacologia de rede e verificação metabolômica.

Predição de Farmacologia de Rede e Validação Metabolômica do Mecanismo de Fructus Phyllanthi contra Hiperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug ...

Nossa pesquisa inclui técnica experimental seriada e o protocolo tem esses detalhes que são necessários para que os leitores entendam nossos métodos. Nosso método integrado compensa a desvantagem da farmacologia de rede e metabolômica, e pode ser usado para a meta-análise terapêutica da medicina natural. Este método é usado para selecionar o composto ativo do ingrediente da empresa e o traje para corredores com composição química maciça, como uma medicina tradicional chinesa.Para começar, selecione os ingredientes ativos e os principais alvos pesquisando a palavra-chave phyllanthi fructus no banco de dados de farmacologia de sistemas de medicina tradicional chinesa. Para obter a lista dos ingredientes ativos candidatos e alvos do frutus phyllanthi, ou FP, pesquise a palavra-chave hyperlipidemia no banco de dados de cartões gênicos, o banco de dados online de herança mendeliana no homem e o banco de dados de alvos terapêuticos para obter os respectivos alvos candidatos de hiperlipidemia. Baixe as planilhas de alvos da doença e salve-as em uma pasta e exclua as metas repetidas para obter a lista de alvos de hiperlipidemia.Em seguida, copie as listas de ingredientes ativos de PF, alvos de PF e alvos de hiperlipidemia em uma nova planilha. Use a função de identificação de dados duplicados na barra de ferramentas para obter destinos de interseção. Importe a lista de alvos de interseção para a base de conhecimento UniProt para padronizar os nomes de genes e proteínas.Para construir uma rede de interação proteica, cole a lista de alvos de interseção de FP contra hiperlipidemia na caixa de diálogo lista de nomes do banco de dados String 11.5. Selecione o homo sapiens em organismos. Clique em Pesquisar e continue.Quando os resultados estiverem disponíveis, habilite os nós desconectados altos na rede em configurações avançadas. Defina a confiança mais alta para 0,900 na pontuação mínima de interação necessária. Em seguida, clique no botão de atualização.Clique em exportações na barra de título e faça o download do pequeno texto tabular da rede de interação proteica em formato PNG e TSV. Para construir uma rede alvo de doença componente de medicamento, abra o Cytoscape 3.9.1 e importe o arquivo de formato TSV. Otimize a cor, a fonte e o lado dos nós de rede por meio da barra de estilos no painel de controle.Usando a função de rede de análise para análise de topologia de rede, obtenha genes hub no CytoHubba no Cytoscape e estabeleça a rede de doenças alvo do ingrediente do medicamento. Para realizar análises de enriquecimento GO e KEGG, abra os recursos de bioinformática David. Clique em iniciar análise e cole a lista de destino na caixa de diálogo à esquerda.Selecione o símbolo oficial do gene no identificador selecionado e o homo sapiens em espécies selecionadas. Em seguida, habilite a lista de genes no tipo de lista e clique em enviar lista. Em seguida, clique em agrupamento de anotação funcional em analisar a lista de genes acima com uma das ferramentas de David.Habilite o termo GO BP direto, o termo GO CC direto, o termo GO MF direto e a ontologia gênica para análise de enriquecimento da função GO. Habilite a via KEGG em caminhos para análise de enriquecimento da via KEGG. Clique no gráfico de anotações funcionais para exibir os resultados.Utilizar o software SIMCA P para análise estatística multivariada dos valores integrais obtidos a partir dos achados do LCMS. Use a análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais, ou OPLSDA, para os dados de centro médio e a modelagem de classes amostrais. Após o teste OPLSDA, considerar os metabólitos com importância variável integral na projeção, ou valores VIP, maiores que um e um valor de P menor que 0,05 do teste t de Student como potenciais metabólitos diferenciais.Identificar os metabólitos perturbados e vias metabólicas por fontes de banco de dados abertas, incluindo metaboloma humano, enciclopédia de genes e genomas de Kyoto e MetaboAnalyst 5.0. Visualize as visualizações de resultados pelo MetaboAnalyst 5.0 e pela plataforma Wukong. Faça o download da estrutura 3D dos ingredientes FP selecionados do banco de dados de farmacologia dos sistemas de medicina tradicional chinesa.Pesquise os nomes dos ingredientes na caixa de pesquisa de nomes químicos e baixe os arquivos de estrutura 3D correspondentes no formato MOL dois. Em seguida, baixe as estruturas cristalinas dos principais alvos do banco de dados de estrutura de proteínas da dobra alfa. Pesquise os nomes de destino na caixa de pesquisa e baixe os arquivos de estrutura cristalina correspondentes no formato PDB.Em seguida, importe ingredientes e arquivos de estrutura de destino para o software de ferramentas AutoDock. Clique em editar e excluir água para excluir moléculas de água. Em seguida, clique em editar hidrogênios e adicionar para adicionar hidrogênios.Defina os ingredientes como o ligante e execute o acoplamento cego selecionando todos os alvos como o receptor. Digite um valor na caixa atrás do centro e do tamanho para ajustar o espaço recém-desenvolvido, tornando possível abranger totalmente o ligante e o receptor. Salve os arquivos de ligante e receptor no formato PDBQT.Use o AutoDock Vina para realizar o encaixe molecular. Defina a barra do receptor para o nome do ponto receptor PDBQT e a barra do ligante para o nome do ponto do ligante PDBQT. Obter o local ideal para a ligação do ligante ao receptor e registrar o valor da energia de ligação na posição ideal.Importe os arquivos de encaixe para o criador de perfil de interação do ligante de proteína para obter o modelo visual do sistema. Baixe os arquivos de modelo no formato PSC e importe-os para o software PyMOL para construir uma visualização adicional. Através da farmacologia em rede, um total de 19 ingredientes e 134 ingredientes relacionados a ingredientes alvos de PF foram encontrados.Após o pareamento dos alvos relacionados ao PF com os alvos relacionados à hiperlipidemia, 62 foram identificados como potenciais alvos do PF contra hiperlipidemia. A rede de interação proteica foi construída por String e Cytoscape. Os resultados do enriquecimento com GO sugeriram que os processos biológicos e a função molecular do PF contra a hiperlipidemia estavam relacionados principalmente à expressão gênica e à ligação proteica.O enriquecimento de KEGG provou que o PF pode intervir no metabolismo lipídico e na aterosclerose. A análise OPLSDA foi usada para explorar a separação de metabólitos entre os grupos controle negativo, dieta rica em gordura e FP de alta dose, o que mostrou que as amostras do mesmo grupo se agruparam e amostras de grupos diferentes se diferenciaram bem. Um total de 16 e seis metabólitos foram identificados como metabólitos diferenciais em FP afetando camundongos HFD no plasma e fígado.Mapas de calor plotados pelo MetaboAnalyst 5.0 mostraram que todos os metabólitos diferenciais no plasma e fígado foram alterados no grupo dieta hiperlipídica e a maioria foi revertida no grupo FP. O metabolismo do triptofano foi afetado significativamente no plasma. O metabolismo da taurina e hipotaurina foi afetado significativamente no fígado.Metabólitos diferenciais foram importados para o plugin MetScape no Cytoscape e combinados com os genes hub identificados na farmacologia de rede para coletar as redes gênicas de enzimas de reação composta. Além disso, os ingredientes alvos metabólitos vias rede foi construída. O acoplamento molecular foi utilizado para analisar as interações entre o sítio ativo do ligante.Esta tecnologia é um método abrangente de iniciar os ingredientes genéticos farmacológicos da medicina tradicional chinesa. Ele fornece uma nova ideia para a pesquisa envolvendo medicamentos com ingredientes completos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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