Name: Isolamento e caracterização dos ligamentos uterossacrais murinos e órgãos do assoalho pélvico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:25:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprenda a isolar ligamentos uterossacrais murinos mantendo as conexões anatômicas e recuperando órgãos do assoalho pélvico. Este protocolo estabelece um modelo pré-clínico para estudar como a gravidez e doenças influenciam a mecânica tecidual.

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Este trabalho foi apoiado pela concessão Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) (C.B.), pela NSF Graduate Research Fellowship (L.S.), pela Schmidt Science Fellowship (C.L.), pela University of Colorado Research and Innovation Seed Grant Program (prêmio de 2020 para V.F., S.C. e K.C.), e pela Anschutz Boulder Nexus Seed Grant da Universidade do Colorado (para V.F. e K.C.). Agradecimento especial vai para o Dr. Tyler Tuttle para ajudar com o projeto da câmara de carregamento, bem como para os membros do laboratório Calve para discussões úteis.

Todos os experimentos e procedimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo #2705, aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado em Boulder. Camundongos C57BL/6J fêmeas com seis semanas de idade foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparo dos animais
<ol><li>Eutanásia do animal seguindo o método aprovado institucionalmente. NOTA: O presente estudo utilizou a inalação de CO 2 em alinhamento com as diretrizes da American Veterinary Medical Association (taxa de deslocamento de 30% a 70% do volume da câmara com CO2 por minuto), seguida de luxação cervical, para garantir o sucesso da eutanásia.<ol><li>Trabalhe sob um capô, se possível, para minimizar a propagação de alérgenos de ratos. Quando o mouse parar de se mover e respirar, aguarde 2 min ou mais para verificar a falta de resposta. OBS: Se a rata estiver grávida ou no pós-parto, os filhotes devem ser eutanasiados individualmente. Filhotes E15.5 e mais velhos devem ser decapitados durante a dissecção.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar o arranjo da dissecção com uma almofada de dissecção, bisturi de 11 lâminas, tesoura fina curva afiada, dois pares de pinças, pinça curva, fio de poliglactina 5-0, microscópio dissecante e seis pinos (Figura 1, ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Coloque o mouse sobre a almofada e fixe os membros anteriores para baixo (Figura 2A). Fazer uma incisão de aproximadamente 1-1,5 cm no abdome com tesoura (Figura 2B). Utilizar suavemente a tesoura para separar a pele nas faces cranial, caudal e lateral da incisão (Figura 2C, D).</li>
	<li>Vire o mouse para o seu lado dorsal e descasque suavemente a pele em direção aos membros posteriores para remover a pele para longe do local da dissecção (Figura 2E-H).</li>
	<li>Fixe o camundongo nos membros (Figura 2I) e faça uma incisão de aproximadamente 1 cm no abdome, do tórax à pelve (Figura 2J). NOTA: Certifique-se de não danificar os órgãos subjacentes.</li>
	<li>Empurre suavemente os órgãos em direção ao tórax para limpar o campo de visão (Figura 2K). OBS: Irrigar os tecidos com 1x PBS para manter a hidratação.</li>
	<li>Limpar todo o tecido adiposo do assoalho pélvico (Figura 2L-N). NOTA: Use fórceps para puxar e limpar suavemente a gordura dos órgãos e tecidos de interesse.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig01.jpg"> Figura 1: Um espaço de trabalho limpo com todas as ferramentas necessárias para realizar as dissecações. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig02.jpg"> Figura 2: Retirada da pele e abertura das cavidades pélvica e torácica do camundongo. (A) Fixação de todos os membros. (B) Incisão inicial. (C) Separar a pele da fáscia subjacente com tesoura. (D) Corte da pele e preparação para a remoção. (E-G) Puxando a pele dando a volta no mouse. (H) Remoção completa da pele do lado dorsal. (I) Remoção completa da pele do tronco e refixação dos membros do rato. (J) Abertura do abdome. (K) Vista do abdome aberto. (L) Mover os órgãos para fora do campo de visão. (M) Retirar a gordura. (N) Vista do assoalho pélvico desobstruído. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Colheita USL
<ol><li>Cortar os cornos uterinos dos ovários (Figura 3B), afastar-se do campo de visão e cortar na conexão cervical (Figura 3C). NOTA: Os cornos uterinos podem ser identificados seguindo o esquema da Figura 3A. Irrigar os tecidos com 1x PBS para manter a hidratação.</li>
	<li>Cortar os ureteres para longe da conexão vesical (Figura 3D). Observação : isso é para evitar confusão com a USL.</li>
	<li>Cortar o cólon o mais próximo possível do colo do útero (Figura 3E,F). OBS: Irrigar os tecidos com 1x PBS para manter a hidratação.</li>
	<li>Coloque o mouse junto com a almofada de dissecção sob o escopo dissecante para visualizar as USLs (Figura 3G).</li>
	<li>Use suavemente a pinça para limpar a gordura circundante das USLs. NOTA: Use um segundo par de pinças para segurar o colo do útero em um pequeno ângulo para melhorar a visualização de onde o USL se cruza com o colo do útero. Irrigar os tecidos com 1x PBS para manter a hidratação.</li>
	<li>Amarrar uma sutura de poliglactina 5-0 ao redor da extremidade cervical de ambas as USLs (Figura 4B, C). NOTA: As USLs podem ser identificadas usando as imagens esquemáticas e de ampliação (Figura 4I-K)</li>
	<li>Neste estudo, uma USL é usada para análises morfológicas ou bioquímicas (i.e., microscopia Raman, imunohistoquímica, histologia). Cortar a extremidade cervical do USL, deixando um pedaço do colo do útero preso, e cortar um pedaço de músculo do fundo do USL (Figura 4D). Colocar o tecido dissecado em banho com 1x PBS para manter o tecido hidratado (Figura 4G, H).</li>
	<li>Use a USL restante para testes mecânicos e geração de imagens. Cortar a extremidade cervical do USL, deixando um pedaço do colo do útero preso, para facilitar o arranjo mecânico (Figura 4D). OBS: O tecido cervical atuará como âncora para fixar a USL durante o ensaio mecânico.</li>
	<li>Uma vez colhidos todos os tecidos de interesse (passos 3 a 5), deslocar os fêmures da pelve (Figura 4E). OBS: Deve-se ouvir um leve estalido quando a cabeça femoral está desarticulada da taça acetabular.</li>
	<li>Cortar o osso pélvico das extremidades distal e proximal do osso pélvico, deixando cerca de 10 mm de tecido total (Figura 4F). Colocar o tecido dissecado em 1x PBS.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig03.jpg"> Figura 3: Assoalho pélvico desobstruído para dissecção da USL . (A) Esquema da anatomia. (B) Cortar os cornos uterinos na conexão ovariana. (C) Corte dos cornos uterinos. (D) Corte dos ureteres. (E) Corte do cólon. (F) Uma visão clara do reto e das USLs. (G) Colocação do mouse e da mesa de dissecção sob o escopo de dissecação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig04.jpg"> Figura 4: Vista da USL e tecidos circunvizinhos e dissecção das USLs . (A) Esquema dos pontos anatômicos ao redor da USL. (B) Amarrar uma sutura ao redor das extremidades cervicais. (C) Corte das extremidades cervicais da USL. (D) Fatiamento da USL a ser utilizada para as análises bioquímicas na conexão sacral. (E) Corte dos fêmures do osso pélvico. (F) Corte da extremidade proximal da pelve. (G) Dissecar o USL em uma placa de Petri de 35 mm. (H) O LUS com a pelve aderida em uma placa de Petri de 35 mm. (I) USL e reto em aumento de 0,75x. (J) Remoção de gordura da USL. (K) Limpeza das USLs em aumento de 1,0x. Barra de escala = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Colheita da bexiga
<ol><li>Após a eliminação da gordura, segure a bexiga com a pinça e levante-a suavemente em um ângulo de aproximadamente 40° (Figura 5A).</li>
	<li>Com a tesoura, cortar a bexiga do lado distal, logo acima do colo do útero (Figura 5B).</li>
	<li>Colocar o tecido em banho com 1x PBS para manter o tecido hidratado (Figura 5H).</li>
</ol>4. Colheita do reto
<ol><li>Uma vez que as USLs são desconectadas do colo do útero e a bexiga é dissecada, levante o colo do útero em um ângulo de aproximadamente 40° com a pinça. Há a fáscia retovaginal que conecta o reto e o colo do útero. Com o bisturi, corte suavemente essa conexão (Figura 5C, D).</li>
	<li>Cortar o osso púbico na sínfise púbica com tesoura. Amplie suavemente o espaço de trabalho para aumentar o acesso visual às inserções de tecido.</li>
	<li>Com a pinça, puxe suavemente o reto em direção ao tórax e use a tesoura para seguir o reto de sua face posterior até o ânus. Corte o reto no ânus (Figura 5E).</li>
	<li>Colocar o tecido em PBS 1x para manter o tecido hidratado (Figura 5I).</li>
</ol>5. Colheita do complexo colo do útero-vagina
<ol><li>Depois que as USLs forem removidas do colo do útero, use a pinça para segurar o colo do útero. Cortar o colo do útero o mais próximo possível da vulva com tesoura (Figura 5F, G). NOTA: Certifique-se de cortar a sínfise púbica para ver visualmente a extremidade distal da vagina.</li>
	<li>Colocar o tecido em PBS 1x para manter o tecido hidratado (Figura 5J).</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65074/65074fig05.jpg"> Figura 5: Dissecções da bexiga, do reto e do colo uterino/vagina . (A) Segurar a bexiga em um ângulo. (B) Cortar a bexiga. (C) Corte do tendão que liga o colo uterino e o reto. (D) O tendão em aumento de 1,0x. (E) Corte do reto. (F) Segurar o colo do útero com pinças. (G) Corte na extremidade distal da vagina. (H) A bexiga em uma placa de Petri de 35 mm. (I) O reto em uma placa de Petri de 35 mm. (J) O complexo tecido colo do útero-vagina em uma placa de Petri de 35 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65074/65074fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
6. Preparo da amostra para caracterização tecidual
<ol><li>Análise mecânica e visual da USL<ol><li>Coloque o USL com o acessório pélvico sobre uma parede em forma de T dentro de um poço de coloração personalizado para garantir a imersão total na solução de coloração (desenhos CAD do poço podem ser encontrados em Arquivo de Codificação Suplementar 1 e Arquivo de Codificação Suplementar 2). OBS: Use sutura e pinça para auxiliar na colocação.</li>
		<li>Diluir um corante comercialmente disponível que cora grupos amina livres (5 μL, ver Tabela de Materiais) em 2,5 mL de 1x PBS, adicionar bem a solução à coloração personalizada e manchar o tecido por 2 h em um balancim a 4 °C. NOTA: Vórtice a solução antes de adicioná-la ao poço de coloração.</li>
		<li>Durante os últimos 15 minutos de coloração, adicionar 2,5 μL de uma coloração de núcleos de células mortas disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) à solução. NOTA: Vórtice a solução antes de adicionar ao poço de coloração.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise Raman das USLs<ol><li>Fixe a USL em uma linha reta em um bloco de polidimetilsiloxano (PDMS) que está contido em um poço personalizado. NOTA: O PDMS é usado como um substrato macio para permitir a fixação da amostra na configuração desejada. Blocos de dimensões variadas podem ser feitos misturando os dois componentes seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais), fundição em uma placa de Petri e, após a polimerização, corte do PDMS na geometria necessária com uma lâmina de bisturi.</li>
		<li>Pino com pinos de insetos na alça de sutura e no músculo pélvico. Hidrate o tecido com 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Tecidos remanescentes<ol><li>Congelar rapidamente os tecidos restantes com nitrogênio líquido ou em um composto de incorporação apropriado, dependendo das análises desejadas.</li>
		<li>Guarde os tecidos a -80 °C até análises subsequentes (por exemplo, ensaios imuno-histoquímicos ou bioquímicos).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+uterosacral+ligaments%3A+Current+knowledge%2C+existing+gaps%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions.</a> Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).</li>
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<li>Fischenich, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+articular+cartilage+is+orthotropic+where+microstructure%2C+micromechanics%2C+and+chemistry+vary+with+depth+and+split-line+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).</li>
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<li>Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+to+macaque+uterosacral-cardinal+ligament+complex+and+its+relationship+to+pelvic+organ+prolapse%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Pathology%22%5BJournal%5D)">Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse.</a> Toxicological Pathology. 36 (7), 101(2008).</li>
<li>Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+to+measure+in+vivo+uterine+suspensory+ligament+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).</li>
<li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rodents+as+models+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of rodents as models for human diseases.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).</li>
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Os autores não têm nada a revelar.

O efeito de danos estruturais nos tecidos reprodutivos femininos é pouco estudado, e um modelo animal de fácil acesso para pesquisa de POP é necessário. O camundongo é um modelo custo-efetivo que pode mimetizar estudos reprodutivos humanos16. Devido ao crescente interesse no estudo do aparelho reprodutor feminino, há necessidade de métodos que auxiliem o estudo desses tecidos. Para suprir essa necessidade, neste trabalho, estabeleceu-se um método para dissecar e preparar tecidos murinos do assoalh...

Aproximadamente 50% das mulheres são acometidas pelo prolapso de órgãos pélvicos (POP)1,2. Cerca de 11% dessas mulheres enquadram-se nos critérios para serem submetidas ao reparo cirúrgico, que apresenta baixa taxa de sucesso (~30%)3,4. A DPO é caracterizada pela descida de algum ou de todos os órgãos pélvicos (bexiga, útero, colo uterino e reto) de sua posição natural devido à falha da USL e dos músculos do assoalho pélvico em fornecer suporte adequado5. Essa condição envolve disfunção anatômica e ruptura do tecido conjuntivo, bem como lesão neuromuscular, além de fatores predisponentes 3,6. A DPO está associada a múltiplos fatores, como idade, peso, paridade e tipo de parto (i.e., partos vaginais ou cesáreos). Acredita-se que esses fatores afetem a integridade mecânica de todos os tecidos do assoalho pélvico, sendo a gravidez e a paridade os principais causadores daDPO5,7,8.
Os ligamentos uterossacrais (USLs) são importantes estruturas de suporte para o útero, colo uterino e vagina e ligam o colo ao sacro4. Danos às USLs colocam as mulheres em maior risco de desenvolver POP. Acredita-se que a gravidez e o parto imponham tensão adicional à USL, o que potencialmente induz lesões e aumenta as chances de DPO. A USL é um tecido complexo composto por células musculares lisas, vasos sanguíneos e linfáticos distribuídos heterogeneamente ao longo do ligamento, que pode ser dividido em três cortes distintos: cervical, intermediário e sacral9. A integridade mecânica da USL é derivada de componentes da matriz extracelular (MEC) como colágenos, elastina e proteoglicanos 5,9,10. Sabe-se que as fibras colágenas tipo I são um importante componente de tração dos tecidos ligamentares e, portanto, provavelmente estão envolvidas na falência da USL e naDPO11.
Há falta de conhecimento sobre as causas, prevalência e efeitos da DPO em mulheres. O desenvolvimento de um modelo animal apropriado de DPO é necessário para avançar no entendimento do assoalho pélvico feminino. Camundongos e humanos têm pontos anatômicos semelhantes dentro da pelve, como ureteres, reto, bexiga, ovários e ligamentos redondos9, bem como pontos de intersecção semelhantes da USL com o útero, colo do útero e sacro. Além disso, camundongos oferecem facilidade de manipulação genética e têm o potencial de ser um modelo facilmente acessível e custo-efetivo para o estudo da POP9. 
Este estudo desenvolveu um método para acessar e isolar a USL e os diferentes tecidos do assoalho pélvico de camundongos nulíparas (ou seja, nunca grávidas). As USLs extraídas foram submetidas à digestão enzimática (isto é, para remover colágenos e glicosaminoglicanos), testadas para determinar a resposta mecânica sob carga de tração e avaliadas quanto à composição bioquímica em um estudo de prova de conceito. A capacidade de isolar tecidos intactos facilitará futuras caracterizações mecânicas e bioquímicas dos componentes do assoalho pélvico, o que é um primeiro passo crucial para melhorar nossa compreensão dos riscos de lesão relacionados ao parto, gravidez e DPO.

<table><tbody><tr><td>11 Lâminas</td><td>Fisher</td><td>3120030</td><td>Lâmina removível</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>Diluído a partir de concentração 10x</td></tr><tr><td>Condroitinase ABC</td><td>Sigma</td><td>C3667-10UN</td><td>Enzyme&nbsp;</td></tr><tr>Enzima <td>LS004194</td><td>Bioquímica Worthington</td> <td>Tipo I de Colgenase</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 5</td><td>Configuração vertical</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica</td><td>S9E</td><td>Com câmera</td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Fisher</td><td>NC9626652</td><td>Ponta fina</td></tr><tr><td>Camundongos fêmeas C57BL/6J</td><td>Jackson Cepa de laboratório</td><td>#: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>FemtoTools FemtoTools</td><td>FT-RS1002 Célula de</td><td>carga de 100 mN</td></tr><tr><td>Fórceps Curvado</td><td>FST Fisher</td><td>NC9639443</td><td>Ponta Curva</td></tr><tr><td>FST Sharp 9 mm Tesoura&nbsp;</td>Tesoura <td>de</td><td>Dissecção</td>NC9639443 <td>Fisher</td></tr><tr><td>Ghost Dye 780&nbsp;</td><td>Tonbo</td><td>13-0865-T500</td><td>Mancha de amina livre</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td>Caixa de 50 toalhetes</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue Tek</td><td>4583</td><td>Usado para preservação de tecidos</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Thermo Fisher</td><td>044764.AK</td><td>Siga as instruções do fabricante</td></tr><tr><td>Placas de Petri 35 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875711A</td><td>Usado para tecido dissecado</td></tr><tr><td>Poliglactina Sutura 5-0</td><td>Veter.Sut</td><td>VS385VL</td><td>Com agulha</td></tr><tr><td>Microscópio Renishaw InVia Raman</td><td>Renishaw</td><td>PN192(EN)-02-A</td><td>Com objetivas confocais</td></tr><tr><td>Plataforma de balanço</td><td>VWR</td><td>10127-876</td> Luvas cirúrgicas de <td>plataforma de 2 camadas</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>52818</td><td>Para dissecção&nbsp;</td></tr><tr><td>Sytox</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11381</td><td>Mancha nuclear&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinos T</td><td>Fisher</td><td>S99385</td><td>Para dissecação&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Para dissecção&nbsp;</td></tr><tr><td>Underpads</td><td>Fisher</td><td>22037950</td><td>Para cobrir a almofada de dissecação</td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização dos ligamentos uterossacrais murinos e órgãos do assoalho pélvico

Isolation and Characterization of the Murine Uterosacral Ligaments and Pelvic Floor Organs

O prolapso de órgãos pélvicos (DPO) é uma condição que afeta a integridade, a estrutura e o suporte mecânico do assoalho pélvico. Os órgãos do assoalho pélvico são sustentados por diferentes estruturas anatômicas, incluindo músculos, ligamentos e fáscia pélvica. O ligamento uterossacro (USL) é uma estrutura crítica de suporte de carga, e a lesão da USL resulta em um risco maior de desenvolver POP. O presente protocolo descreve a dissecção de USLs murinos e dos órgãos do assoalho pélvico, juntamente com a aquisição de dados únicos sobre a composição bioquímica e função da USL usando espectroscopia Raman e a avaliação do comportamento mecânico. Camundongos são um modelo inestimável para pesquisa pré-clínica, mas dissecar a USL murina é um processo difícil e intrincado. Este procedimento apresenta uma abordagem para guiar a dissecção dos tecidos murinos do assoalho pélvico, incluindo o USL, para possibilitar múltiplas avaliações e caracterização. Este trabalho visa auxiliar a dissecção de tecidos do assoalho pélvico por cientistas e engenheiros básicos, ampliando assim a acessibilidade da pesquisa sobre as condições do USL e do assoalho pélvico e o estudo pré-clínico da saúde da mulher utilizando modelos de camundongos.

Cada passo da dissecção de um mouse selvagem é detalhado no vídeo associado e nas figuras relacionadas ao protocolo. Para este estudo, foram utilizados camundongos fêmeas C57BL/6J com 6 semanas de idade (Tabela Suplementar 1). Três grupos amostrais com USLs tratados com diferentes enzimas foram analisados: grupo controle (sem tratamento), grupo tratado com colagenase e tratado com condroitinase. O músculo liso, os nervos e os linfáticos da USL são circundados por uma MEC rica em colágenos fibrilares e gl...

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para dissecar ligamentos uterossacrais e outros tecidos do assoalho pélvico, incluindo colo uterino, reto e bexiga em camundongos, para expandir o estudo dos tecidos reprodutivos femininos.

Isolamento e caracterização dos ligamentos uterossacrais murinos e órgãos do assoalho pélvico

Pelvic organ prolapse (POP) is a condition that affects the integrity, structure, and mechanical support of the pelvic floor. The organs in the pelvic ...

Esse protocolo ampliará a acessibilidade das pesquisas sobre o ligamento uterossacro e as condições do assoalho pélvico, como o prolapso de órgãos pélvicos, ou POP, e facilitará a dissecção do tecido espelhado do assoalho pélvico. Esta técnica permite o isolamento de ambos os ligamentos uterossacrais de um camundongo, mantendo os anexos anatômicos e recuperando os órgãos do assoalho pélvico circundantes. Nosso método estabelece um modelo pré-clínico que permite estudar como a gravidez ou doença influencia o comportamento mecânico tecidual.Esse método estabelece uma nova ferramenta para a pesquisa em saúde da mulher. A principal luta é identificar e manusear o ligamento uterossacro. Meu conselho é ter tempo e cuidados adequados, porque esses tecidos são pequenos e frágeis.Comece colocando um mouse eutanasiado em uma almofada e fixando os quatro membros para baixo. Faça uma incisão de um a 1,5 centímetro de comprimento no abdômen com tesoura. Separe suavemente a pele nos lados cranial, caudal e lateral da incisão.Vire o mouse para encarar o lado dorsal para cima e descasque suavemente a pele em direção aos membros posteriores. Fixe os membros e faça uma incisão de um centímetro de comprimento no abdômen do tórax até a pelve. Empurre suavemente os órgãos em direção ao tórax para uma visão clara.Após a irrigação com PBS usando um par de pinças, truxe e limpe o tecido adiposo pélvico. Identifique os chifres uterinos e, em seguida, corte-os dos ovários. Agora, retire-os do campo de visão e corte a conexão cervical.Separe os ureteres da conexão da bexiga. Corte o cólon o mais próximo possível do colo do útero. Coloque o mouse com a almofada sob um escopo dissecante para visualizar os ligamentos uterossacros.Use pinças para limpar suavemente qualquer gordura circundante dos ligamentos uterossacros. Amarre uma sutura 5-0 ao redor da extremidade cervical de ambos os ligamentos. Corte a extremidade cervical do ligamento uterossacro, deixando um pedaço do colo do útero preso.Agora, corte um pedaço de músculo da parte inferior do ligamento. Colocar o tecido dissecado em um banho contendo PBS para manter a hidratação do tecido. Corte a extremidade cervical do tecido restante, deixando um pedaço do colo do útero preso para testes mecânicos e de imagem.Uma vez que a gordura tenha sido limpa, segure a bexiga com pinças e levemente levante-a em um ângulo de aproximadamente 40 graus. Use uma tesoura para cortar a bexiga no lado distal logo acima do colo do útero. Coloque a bexiga em um banho com PBS para manter a hidratação.Agora, use a pinça para levantar o colo do útero em um ângulo aproximado de 40 graus. Identificar a fáscia retovaginal que conecta o reto e o colo do útero e cortar a conexão com o bisturi. Use uma tesoura para cortar o osso púbico na síntese púbica.Alargar suavemente o assoalho pélvico para aumentar a visibilidade das inserções de tecido. Segure o colo do útero com pinças e corte-o o mais próximo possível da vulva. Coloque o tecido em PBS para manter a hidratação.Use a pinça para puxar suavemente o reto em direção ao tórax. Identifique o reto e corte-o no ânus. Coloque o reto em PBS para manter a hidratação.Uma vez que todos os tecidos de interesse são colhidos, deslocar os fêmures da pelve. Cortar o osso pélvico das extremidades distal e proximal. Colocar o tecido dissecado em PBS.O tratamento enzimático pareceu reduzir o pico axial médio e os estressores relaxados que o ligamento uterossacro experimenta nos deslocamentos globais prescritos, indicando que o colágeno e os glicosaminoglicanos contribuíram para a rigidez axial dos ligamentos. As deformações axiais médias para cada espécime mecanicamente testado indicam que a deformação axial global nas amostras tratadas com enzima foi semelhante ou maior do que a amostra controlada, sugerindo que a redução do estresse macroscópico foi devida ao tratamento enzimático, em vez de cepas menores. A espectroscopia Raman da seção intermediária do ligamento uterossacro sugere que os tratamentos enzimáticos alteraram a composição bioquímica dos ligamentos uterossacrais murinos.Os ligamentos uterossacrais tratados com colagenase apresentaram diminuição do conteúdo de colágeno, bem como diminuição de água e ácido hialurônico. Os ligamentos uterossacrais tratados com condroitinase apresentaram menor teor de ácido hialurônico, além de menor teor de água e colágeno. A atenção aos detalhes é muito importante, especialmente ao limpar o fato de que os depósitos ao redor da USL e órgãos pélvicos aqui são necessários para evitar danificar a USL e seus tecidos circundantes.Investigações adicionais podem ser conduzidas na USL e em outros tecidos do assoalho pélvico usando camundongos que têm variações genéticas que hipotetizam afetar a POP. Nosso protocolo já está possibilitando uma série de novos estudos, incluindo a investigação de como o comportamento mecânico das USLs altera uma função da gravidez, que é um fator de risco chave para POP.

isolation-characterization-murine-uterosacral-ligaments-pelvic-floor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Células adultas isolando-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas com base na velocidade da célula a adesão ao frasco.

Isolar células-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas

Estamos medindo a sensibilidade ea ativação de células mastro mecânico perigenital na próstata masculina de camundongos C57BL / 6 que foram submetidos a um paradigma de estresse precoce - separação materna neonatal, de modo a induzir um modelo pré-clínico de síndrome de dor pélvica / crônica prostatite crônica.

Avaliação da Perigenital Sensibilidade e Prostatic Mast Ativação celular em um rato modelo de Separação Materna Neonatal

Este protocolo descreve a implantação de malha no septo rectovaginal ovino usando uma única técnica de incisão vaginal, com e sem a inserção guiada por trocares de braços de ancoragem.

Inserção Transvaginal Mesh no Modelo Ovino

Aqui nós apresentamos um protocolo para padronizar a medição do tamanho de hiato do levator ani por ressonância magnética. O objetivo é extrair inferências biomecânicas de análise de imagem, comparando a descansar e sobrecarregar seus valores em pacientes de ambos os sexos com prolapso pélvico, usando pontos ósseos anatômicos consistentes.

Quantificação do Levator Ani hiato alargamento por ressonância magnética em machos e fêmeas com prolapso de órgãos pélvicos

Este protocolo apresenta um método estandardizado para crescer VX2 pilhas na cultura e para criar um modelo VX2 transplantação orthotopic do do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal nos coelhos. Os modelos do cancro endometrial de orthotopic são importantes para o estudo pré-clínico de modalidades novas da imagem latente para o diagnóstico de metástases de nó de linfa.

Um modelo de câncer endometrial ortotópico com linfadenopatia retroperitoneal feita a partir de in vivo propagadas e cultivadas VX2 células

As contrações uterinas são importantes para o bem-estar das fêmeas. No entanto, a contratilidade patologicamente aumentada pode resultar em dismenorreia, especialmente em fêmeas mais jovens. Aqui, nós descrevemos uma preparação ex vivo simples permitindo a avaliação rápida da eficácia de afrouxamento do músculo liso que podem ser usados tratando o dysmenorrhea.

Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados

Os principais gânglios pélvicos contêm neurônios parassimpáticos e simpáticos que inervam os órgãos pélvicos. Aqui descrevemos um método de dissecção e fornecemos esquemas para identificação desses gânglios e seus nervos associados. Esses métodos podem ser aplicados à manipulação experimental desses gânglios in vivo ou à remoção pós-morte para estudos posteriores.

Dissecção de Gânglios Autônomos Pélvicos e Nervos Associados em Ratos Masculinos e Femininos

A técnica robótica aqui descrita visa detalhar uma abordagem stepwise para excisão mesorectal total assistida por robôs e dissecção de linfonodos pélvicos laterais para câncer retal localmente avançado (T3/T4) localizado abaixo da reflexão peritoneal.

Excisão total mesorectal assistida por robô e dissecção de linfonodo pélvico lateral para câncer retal médio-baixo localmente avançado

O prolapso de órgãos pélvicos afeta milhões de mulheres em todo o mundo e, no entanto, algumas intervenções cirúrgicas comuns têm taxas de falha de até 40%. A falta de modelos animais padronizados para investigar essa condição impede o progresso. Propomos o seguinte protocolo como modelo para suspensão do ligamento uterossacro e ensaio de tração in vivo .

Desenvolvimento de um modelo de rato de suspensão do ligamento uterossacro

Aqui, apresentamos uma nova abordagem conhecida como pectopexia de cerclagem laparoscópica sem malha com preservação uterina para prolapso de órgãos pélvicos (LNMCPUP) para pacientes que desejam preservar seu útero. Suturas de cerclagem permanente são usadas para suspender o útero ao ligamento iliopectíneo através do ligamento redondo.

Pectopexia de cerclagem laparoscópica sem malha com preservação uterina para prolapso de órgãos pélvicos

As aderências intrauterinas (AIUs), a consequência patológica mais comum da lesão endometrial, prejudicam gravemente a função reprodutiva. Trauma e infecção são amplamente reconhecidos como fatores de risco importantes para o desenvolvimento de AIU. Estabelecemos com sucesso um modelo de rato reprodutível de AIUs, combinando dois métodos de lesão crítica: curetagem mecânica e indução infecciosa com lipopolissacarídeo.

Estabelecimento de um Modelo de Rato para Aderências Intrauterinas via Lesão Dupla: Curetagem e Infecção

Aprenda a isolar ligamentos uterossacrais murinos mantendo as conexões anatômicas e recuperando órgãos do assoalho pélvico. Este protocolo estabelece um modelo pré-clínico para estudar como a gravidez e doenças influenciam a mecânica tecidual.

Isolamento e caracterização dos ligamentos uterossacrais murinos e órgãos do assoalho pélvico

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