Name: Fluor-respirometria de alta resolução do músculo esquelético equino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprenda fluor-respirometria de alta resolução para avaliar função mitocondrial em músculo esquelético equino. Este método mede consumo de oxigênio, ATP e espécies reativas de oxigênio, permitindo análise precisa da eficiência energética celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer o generoso apoio da John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine e da Grayson Jockey Club Research Foundation.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Oklahoma. Quatro geldings Puro-Sangue (17,5 ± 1,3 anos, 593 ± 45 kg) foram utilizados neste estudo para gerar os resultados representativos.
1. Obtenção de espécime de biópsia de músculo esquelético
<ol><li>Obter biópsias de músculo esquelético (seguir técnica estéril) a partir do centro do músculo semitendíneo (ou outro músculo de interesse), usando uma agulha de biópsia 12G University College Hospital (UCH) (ver Tabela de Materiais) sob sedação leve e usando anestesia local após um relato publicado anteriormente11.</li>
	<li>Transferir os espécimes de biópsia imediatamente para frascos com solução de meio de transporte de biópsia gelada (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazol, 20 mM taurina, 50 mM K-MES, 0,5 mM ditiotreitol, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP e 15 mM fosfocreatina, ajustado para pH 7,1; ver Tabela de Materiais). Transporte ao laboratório para análise. NOTA: Consulte Doerrier et al.15 para obter instruções específicas sobre o preparo do meio de transporte da biópsia.</li>
	<li>Isolar as mitocôndrias das amostras de biópsia usando um kit comercial, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). O tampão de armazenamento final não deve conter substratos como ADP, ATP e succinato, que fazem parte do ensaio de respirometria.</li>
	<li>Ressuspender o pellet final da mitocôndria isolada usando 80 μL de meio de suspensão (manitol 225 mM, sacarose 75 mM e EGTA 1 mM; ver Tabela de Materiais) por 100 mg de músculo usado para isolamento mitocondrial.</li>
	<li>Minimizar o intervalo entre o momento do procedimento de biópsia e o isolamento das mitocôndrias e manter as amostras a 0-4 °C durante as etapas de processamento até serem adicionadas aos respirômetros de alta resolução. NOTA: Estudos preliminares descobriram que as suspensões de mitocôndrias isoladas começam a perder a capacidade funcional após aproximadamente 2 h quando mantidas a 0-4 °C.</li>
</ol>2. Configuração do respirómetro de alta resolução
<ol><li>Respirômetros de alta resolução são usados para quantificar a respiração mitocondrial e processos associados. Use o programa de controle de software fornecido pelo fabricante (consulte a Tabela de Materiais) para controlar o respirômetro, calibrar os sensores e coletar dados brutos. Analisar as amostras em duplicata para cada condição de ensaio. NOTA: Em todos os casos, as titulações recomendadas e as concentrações finais de reagentes descritas neste protocolo são baseadas em uma câmara de respirometria de 2 mL.</li>
	<li>Determine o fluxo de fundo do O 2 e o ponto zero do sensor O 2 a cada2-4 semanas através da titulação em série da ditionita, seguindo as instruções do fabricante. Retenha essas constantes de calibração para ensaios subsequentes até que a calibração seja repetida. OBS: Ao contrário de procedimentos publicados anteriormente utilizando fibras musculares permeabilizadas11,12,13,16, nos quais a hiperóxia (250-500 μM) é necessária para evitar a limitação da difusão do O 2 para a mitocôndria, mitocôndrias isoladas podem ser avaliadas usando uma faixa de 50-200 μM O 2. Isso pode ser obtido simplesmente permitindo que o meio de respiração se equilibre com o ar ambiente antes de adicionar a suspensão mitocondrial (ou seja, seguindo a calibração diária de ponto único). Da mesma forma, a reoxigenação da câmara de respiração pode ser realizada simplesmente abrindo a câmara até que oxigênio ambiente suficiente tenha se dissolvido no meio da respirometria para elevar a concentração de oxigênio ao nível desejado.</li>
	<li>Encher as câmaras do respirómetro com meios isentos de magnésio (0,5 mM EGTA, 60 mM K-lactobionato, 20 mM taurina, 10 mMKH 2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacarose e 1 g/L de albumina de soro bovino [BSA] essencialmente isenta de ácidos gordos, ajustada para pH 7,1; ver Tabela de Materiais). NOTA: Consulte Komlodi et al.17 para obter instruções específicas sobre o preparo do meio respiratório.<ol><li>Ajuste a temperatura de incubação do instrumento para 38 °C para representar a temperatura basal do músculo esquelético equino e ajuste a mistura do meio de respiração para 800 rpm usando um agitador magnético girando no fundo da câmara do respirômetro.</li>
		<li>Desligue a iluminação da câmara para evitar interferência com sensores fluorescentes.</li>
		<li>Energize o eletrodo de oxigênio com uma tensão de polarização de 800 mV e amplifice o sinal resultante com uma configuração de ganho de 1.</li>
		<li>Registrar a concentração de oxigênio a cada 2 s, calcular o fluxo de oxigênio como a inclinação negativa da medição de oxigênio nos 40 s anteriores (20 pontos de dados) e relatar como pmol x s-1 x mL de solução de incubação.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibre o sensor de oxigênio permitindo que a mídia se equilibre com o ar ambiente. Calcular a pressão parcial de oxigênio de referência, com base na pressão barométrica medida pelo respirômetro de alta resolução e na concentração padrão de oxigênio atmosférico.</li>
</ol>3. Mensuração do potencial de membrana mitocondrial utilizando TMRM
<ol><li>Use sensores fluorescentes "verdes" (comprimento de onda dominante de 530 nm) para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração. Energize os sensores em 400-500 mV; O sinal resultante é amplificado com um ganho de 1:1.000. NOTA: Configurações específicas devem ser otimizadas para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor.</li>
	<li>Adicionar TMRM (4 μL de solução de 1 mM para uma concentração final de 2 μM; ver Tabela de Materiais) antes da adição de mitocôndrias.</li>
	<li>Calibrar o sinal fluorescente usando uma calibração simples de dois pontos do sinal fluorescente (tensão) versus a quantidade de fluoróforo adicionado (mM), antes da adição da mitocôndria. NOTA: Use a função de calibração de sinal fluorescente no software de controle da máquina para calibrar esse sinal. O sinal bruto da sonda fluorescente pode exigir 30 min ou mais para estabilizar a fim de registrar o segundo ponto da calibração.</li>
	<li>Realizar a calibração final do sinal TMRM após a conclusão do protocolo de titulação da respirometria, fornecendo várias titulações de agente desacoplador (cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona; 2 μL por titulação) até que não sejam observados novos aumentos no sinal fluorescente de TMRM, indicando o colapso completo do potencial de membrana mitocondrial (Figura 1). NOTA: Este valor de sinal fluorescente é considerado igual a 0 mV potencial transmembrana e usado como ponto de referência para valores de potencial de membrana relativo registrados durante o protocolo de titulação da respirometria.</li>
</ol>4. Medição da produção de ATP utilizando verde de magnésio (MgG)
<ol><li>Use sensores fluorescentes "azuis" (comprimento de onda dominante de 465 nm) para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração. Energize esses sensores para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor.</li>
	<li>Realizar a configuração química e calibração do sinal fluorescente MgG após a adição da mitocôndria, mas antes da adição de quaisquer substratos. Adicionar 8 μL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM à câmara de respirometria para quelar cátions (particularmente Ca 2+) que competiriam com Mg2+ para ligação ao MgG e, em seguida, adicionar 4 μL de 1 mM MgG (1,1 μM) à câmara de respiração.</li>
	<li>Calibrar o sinal bruto de fluorescência com titulações sequenciais de 10 x 2 μL de 100 mM MgCl 2, permitindo 1 min entre as titulações para estabilização do sinal fluorescente (Figura 2). NOTA: Este processo, que é concluído off-line após a conclusão do ensaio e usando modelos fornecidos pelo fabricante da máquina e software associado, produz uma curva de segunda ordem de concentração de magnésio para sinal fluorescente (esperado r2 > 0,98), que será usado com uma quantidade conhecida de ADP adicionado à câmara de respirometria e os valores de Kd previamente determinados para determinar a concentração correspondente de ATP11.</li>
	<li>Determinar a taxa de síntese de ATP, que é a inclinação da concentração de ATP ao longo do tempo ao longo do protocolo (Figura 3).</li>
</ol>5. Medição da produção mitocondrial de ROS usando Amplex UltraRed (AmR)
<ol><li>Use sensores fluorescentes "verdes" (comprimento de onda dominante de 530 nm) para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração. Energize os sensores em 300-400 mV; O sinal resultante é amplificado com um ganho de 1:1.000. Otimize configurações específicas para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor. NOTA: Se usar meios respiratórios sem MgCl 2, então isso deve ser adicionado (20-60 μL de 100 mM MgCl 2 para produzir 1-3 μM MgCl2) antes de adicionar reagentes para o ensaio de AmR.</li>
	<li>Realizar a configuração química e calibração inicial do ensaio de AmR antes da adição da mitocôndria. Adicionar 30 μmoles de DTPA (6 μL de solução de 5 mM) a cátions quelados que possam interferir com a reação, em seguida, adicionar superóxido dismutase (2 μL de uma solução-estoque de 5.000 U/mL para converter ânions superóxido em H 2 O2para uma detecção mais abrangente da geração reativa de oxigênio), peroxidase de raiz forte (5 μL de uma solução-mãe de 500 U/mL), e Amplex UltraRed (2 μL de uma solução-mãe de 10 mM) (ver Tabela de Materiais) para produzir 5 U/mL, 1 U/mL e 10 μM na câmara de respirometria, respectivamente.</li>
	<li>Deixe o sinal fluorescente estabilizar e, em seguida, adicione 0,2 μmoles de peróxido de hidrogênio (5 μL de uma solução de 40 μM feita fresca diariamente) duas vezes, com aproximadamente 5 min de intervalo. NOTA: O sinal fluorescente antes e depois das duas titulações de H 2 O 2 fornece uma curva de calibração linear de três pontos do sistema (esperado r 2 > 0,95), cuja inclinação reflete a capacidade de resposta geral do sistema em relatar a relação entre o sinal fluorescente e a produção (ou adição) de H 2 O 2. Use a função de calibração de sinal fluorescente no software de controle da máquina para calibrar esse sinal.</li>
	<li>Realizar calibrações adicionais de dois pontos (5 μL de uma solução de 40 μM feita fresca diariamente) durante todo o ensaio, para permitir o ajuste da responsividade do ensaio à medida que a química da respirometria muda ao longo do ensaio, com o tempo específico desses pontos de calibração a critério do investigador (Figura 4).</li>
</ol>6. Medição da respiração mitocondrial
<ol><li>Adicionar 15 μL de suspensão mitocondrial isolada (passo 1.4) a cada 2 ml de câmara de incubação, de modo a que os resultados representem o rendimento mitocondrial de 18,75 mg de músculo. Sele a câmara de incubação. Vórtice a amostra entre cada titulação para manter uma suspensão uniforme da amostra.</li>
	<li>Medir o consumo residual de oxigénio (ROX) antes da adição de quaisquer substratos. Subtrair esse valor (tipicamente menor que 0,2 pmol O2 x s-1 x mL-1) dos valores de consumo de oxigênio de cada etapa do protocolo de titulação substrato/desacoplador/inibidor (SUIT)11 após a conclusão do protocolo. NOTA: É fundamental que os sinais do sensor de oxigênio e do sensor de fluorescência se estabilizem por pelo menos 1 min (conforme avaliado pela inclinação estável calculada dos sinais do sensor primário), pois o estado geral da respiração é alterado pelas titulações, a fim de obter resultados confiáveis. Isso se aplica a todas as etapas de titulação.</li>
	<li>Use um SUIT de uso geral que permita a caracterização inicial da função mitocondrial do músculo esquelético equino. Comece com titulações sequenciais de piruvato (5 μL de solução aquosa 2 M), glutamato (10 μL de solução aquosa 2 M) e malato (10 μL de solução aquosa 0,4 M) (ver Tabela de Materiais) em cada câmara para produzir dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADH) e estimular a respiração não fosforilante (vazamento) suportada por NADH oxidado através do Complexo I (LN) (Figura 1, Figura 3 e Figura 4).</li>
	<li>Adicionar ADP (20 μL de solução aquosa de 500 mM; ver Tabela de Materiais) para estimular a respiração fosforilante através do Complexo I (PN).</li>
	<li>Adicionar succinato (20 μL de solução aquosa de 1 M; ver Tabela de Materiais) para produzir respiração fosforilante através da combinação do Complexo I e do Complexo II (PN+S). NOTA: Com a combinação da respiração através do Complexo I e do Complexo II, o consumo de oxigênio pode ser alto o suficiente para consumir a maior parte do oxigênio dissolvido no meio de incubação. Se a concentração de O 2 diminuir abaixo de 50 μM, reoxigenar o meio de incubação desselando a câmara de incubação até que a concentração de O 2 medida tenha aumentado acima de 150 μM. Repita esta etapa conforme necessário para manter o O2 suficiente para a respiração mitocondrial.</li>
	<li>Adicionar rotenona (2 μL de solução de etanol 0,1 mM; ver Tabela de Materiais) para bloquear o Complexo I. O fluxo de oxigênio resultante representa a capacidade do Complexo II de suportar o consumo de oxigênio mitocondrial via oxidação isolada do succinato (PS). CUIDADO: A rotenona é uma substância venenosa. Use segurança laboratorial padrão e evite ingestão ou inalação.</li>
	<li>Calcular o valor médio para uma dada condição experimental em câmaras de respirometria individuais contendo alíquotas de uma única biópsia. NOTA: Cálculos derivados, como razões de controle de fluxo (FCRs), são valiosos para identificar mudanças relativas em diferentes vias e incluem vazamento de FCR (L N/P N), FCR N (P N/P N+S) eFCR S (P S/PN+S). A eficiência de fosforilação oxidativa calculada (1-L,N/P,N+S) fornece uma estimativa do impacto global da respiração de fuga ajustada para a capacidade respiratória total.</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Science+in+Sports+and+Exercise%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Mitochondrial+Pathways+and+Respiratory+Control.+An+Introduction+to+OXPHOS+Analysis.+4th+edn%22">Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn</a>. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).</li>
<li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li>
<li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li>
<li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li>
<li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li>
<li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li>
<li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890(2012).</li>
<li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal+Supplement%22%5BJournal%5D)">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li>
<li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li>
<li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li>
<li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAPID+COMMUNICATION%3A+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li>
<li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389(2017).</li>
<li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+communication%3A+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li>
<li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells%2C+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle%2C+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li>
<li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li>
<li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenergetic+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li>
<li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrated%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este manuscrito.

A adição de sinais fluorescentes à saída padrão do respirômetro de alta resolução fornece informações valiosas sobre a fisiologia mitocondrial, mas a calibração meticulosa do sinal fluorescente é crítica para dados de qualidade. Os protocolos originais para o uso de MgG sugerem que as curvas de calibração geradas durante o cálculo das constantes de dissociação magnésio-adenilato poderiam ser aplicadas a ensaios subsequentes4; no entanto, o sinal fluorescente do MgG pode não ser suficientemente rep...

As mitocôndrias das células eucarióticas produzem a maior parte do ATP utilizado pelas células para trabalho e manutenção1. Um passo fundamental na produção mitocondrial de ATP é a conversão de oxigênio em água e, assim, a capacidade metabólica das mitocôndrias e das células associadas é frequentemente quantificada através da medida do consumo de oxigênio2. No entanto, a fisiologia mitocondrial é mais complexa do que o simples processo de consumo de oxigênio, e a confiança nesse desfecho fornece exclusivamente uma avaliação incompleta do impacto da função e disfunção mitocondrial na saúde celular. A caracterização completa da função mitocondrial requer a avaliação não só do consumo de oxigênio, mas também da produção de ATP, bem como de espécies reativas de oxigênio (EROs).
Medidas adicionais das principais funções mitocondriais podem ser realizadas simultaneamente com a medição da respiração através do uso de fluoróforos específicos. O éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) é um fluoróforo catiônico que se acumula na matriz mitocondrial em proporção ao potencial de tensão transmembrana mitocondrial, resultando em diminuição da intensidade fluorescente devido a esse acúmulo3. O TMRM pode ser usado como um indicador de mudanças relativas no potencial de membrana mitocondrial, ou pode ser usado para quantificar mudanças precisas na tensão transmembrana com experimentos adicionais para determinar constantes que permitem a conversão do sinal fluorescente em mV. O verde de magnésio (MgG) é um fluoróforo que fluoresce quando ligado ao Mg2+, e é usado para medidas de síntese de ATP com base na afinidade diferencial de ADP e ATP para cátion divalente de magnésio4. Os investigadores devem determinar as constantes específicas de afinidade/dissociação (Kd) para ADP e ATP sob condições analíticas específicas para converter as mudanças na fluorescência de MgG em uma mudança na concentração de ATP. O Amplex UltraRed (AmR) é o fluoróforo utilizado para medir a produção de peróxido de hidrogênio e outras ERO durante a respiração mitocondrial5. A reação entre H 2O2 e AmR (que é catalisada pela peroxidase de raiz forte) produz resorufina, que é detectável através de fluorescência a 530 nM. Cada um desses ensaios pode ser adicionado individualmente a ensaios de respiração mitocondrial em tempo real, para fornecer medidas simultâneas dos respectivos aspectos da fisiologia mitocondrial, fornecendo assim uma ligação direta entre a respiração e a produção mitocondrial.
Os cavalos são capazes de taxas muito altas de consumo de oxigênio específico em massa, devido, em parte, ao conteúdo mitocondrial muito alto do músculo esquelético equino, tornando este tecido altamente relevante para o estudo da fisiologia mitocondrial. Com o desenvolvimento da respirometria de alta resolução, estudos utilizando essa nova tecnologia têm ajudado a definir as contribuições das mitocôndrias do músculo esquelético equino tanto para a notável capacidade de exercício de equinos quanto para a fisiopatologia das doenças do músculo esquelético 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Estudos da função mitocondrial do músculo esquelético equino são particularmente vantajosos, uma vez que a obtenção de grandes quantidades desse tecido é não-terminal. Assim, indivíduos equinos podem não apenas fornecer tecido suficiente para a caracterização completa da função mitocondrial, mas também servir como controles longitudinais para estudos mecanísticos de alta qualidade sobre a fisiologia mitocondrial. Por esta razão, ensaios adicionais para quantificar o potencial de membrana mitocondrial, a síntese de ATP e a produção de ERO que complementam a medida do consumo de oxigênio neste tecido têm sido desenvolvidos, a fim de fornecer uma caracterização mais robusta da fisiologia mitocondrial no músculo esquelético equino.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Life Technologies</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato</td><td>de cálcio Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>DatLab 7.0</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td>Software para operar fluororrespirômetro O2K</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DTPA</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>D1133</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de rábano</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>516813</td><td>Deve ser feito fresco diariamente antes do ensaio</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich ( MilliporeSigma)</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K-MES</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Magnésio Verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M3733</td><td></td></tr><tr><td>Malato</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma-Aldrich ( MilliporeSigma)</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento mitocondrial</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>MITOISO1</td><td></td></tr><tr><td>O2K fluorrespirômetro</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td>Várias unidades necessárias para executar todo o espectro de ensaios simultaneamente.</td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Lactobionato</td><td>de potássio Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>L2398</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P2256</td><td>Deve ser feito fresco diariamente antes do ensaio</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Superóxido dismutase</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>S8160</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de titulação</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringas de titulação</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Agulha de biópsia Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td> <td>T5428</td><td></td></tr><tr><td>UCH</td><td>Millenium Surgical Corp</td><td>72-238067</td><td>Disponível em uma variedade de tamanhos</td></tr></tbody></table>

fluor-respirometria de alta resolução do músculo esquelético equino

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

A função mitocondrial - fosforilação oxidativa e geração de espécies reativas de oxigênio - é crítica tanto na saúde quanto na doença. Assim, a mensuração da função mitocondrial é fundamental na pesquisa biomédica. O músculo esquelético é uma fonte robusta de mitocôndrias, particularmente em animais com uma capacidade aeróbica muito alta, como cavalos, tornando-os sujeitos ideais para o estudo da fisiologia mitocondrial. Este artigo demonstra o uso da respirometria de alta resolução com fluorometria concorrente, com mitocôndrias de músculo esquelético recém-colhidas, para quantificar a capacidade de oxidar substratos sob diferentes estados mitocondriais e determinar as capacidades relativas de distintos elementos da respiração mitocondrial. O éster metílico de tetrametilrodamina é usado para demonstrar a produção de potencial de membrana mitocondrial resultante da oxidação do substrato, incluindo o cálculo da eficiência relativa da mitocôndria através do cálculo do potencial de membrana relativo gerado por unidade de fluxo simultâneo de oxigênio. A conversão de ADP em ATP resulta em uma mudança na concentração de magnésio na câmara de reação, devido às diferentes afinidades dos adenilatos pelo magnésio. Portanto, o verde de magnésio pode ser usado para medir a taxa de síntese de ATP, permitindo o cálculo adicional da eficiência de fosforilação oxidativa (razão entre fosforilação e oxidação [P/O]). Finalmente, o uso do Amplex UltraRed, que produz um produto fluorescente (resorufina) quando combinado com peróxido de hidrogênio, permite a quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio durante a respiração mitocondrial, bem como a relação entre a produção de ERO e a respiração concomitante. Essas técnicas permitem a quantificação robusta da fisiologia mitocondrial sob uma variedade de diferentes condições simuladas, esclarecendo a contribuição deste componente celular crítico para a saúde e a doença.

O estado de referência proposto é o de um puro-sangue sedentário saudável (sem aumento da aptidão devido ao exercício obrigatório) e uma amostra de músculo fresco coletada do centro de um músculo postural, contendo uma alta porcentagem de fibras musculares esqueléticas tipo I ricas em mitocôndrias e incubadas em condições próximas ao metabolismo de repouso (i.e., 38 °C e pH 7,0). Nessas condições, o examinador pode esperar valores de L N de 2,71 ± 0,90, valores deP N de 62,40 ± 26,22, valores de P<s...

Os cavalos têm uma excepcional capacidade de exercício aeróbio, tornando o músculo esquelético equino um tecido importante tanto para o estudo da fisiologia do exercício equino quanto para a fisiologia mitocondrial de mamíferos. Este artigo descreve técnicas para a avaliação abrangente da função mitocondrial no músculo esquelético equino.

Fluor-respirometria de alta resolução do músculo esquelético equino

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Esses protocolos permitem que os pesquisadores vão além de simplesmente medir o consumo de oxigênio mitocondrial e, em vez disso, permitem a medição dos principais produtos finais mitocondriais, ATP e espécies reativas de oxigênio. A principal vantagem dessa técnica é que o investigador pode medir a eficiência mitocondrial comparando diretamente a taxa de consumo de oxigênio com a taxa de produção do produto final. Se o produto final é ATP ou oxigênio reativo.As técnicas exigem muita atenção aos detalhes, principalmente para evitar bolhas. Seja na câmara de respiração ou nas seringas de titulação, as bolhas são inimigas porque tornam as medições menos precisas. Após a obtenção das biópsias do músculo esquelético.Encha as câmaras do respirômetro com meio livre de magnésio e sele a câmara de incubação. Ajuste a temperatura de incubação do instrumento para 38 graus Celsius para representar a temperatura basal do músculo esquelético equino. E ajuste a mistura do meio de respiração para 750 rpm usando uma agitação magnética girando no fundo da câmara do respirômetro.Em seguida, desligue a iluminação da câmara para evitar interferência com sensores fluorescentes. Energize o eletrodo de oxigênio com uma tensão de polarização de 800 milivolts e amplifice o sinal resultante com uma configuração de ganho de um. Registre a concentração de oxigênio a cada dois segundos e calcule o fluxo de oxigênio como a inclinação negativa da medição de oxigênio ao longo dos 40 segundos seguintes.Em seguida, calibre o sensor de oxigênio, permitindo que a mídia se equilibre com o ar ambiente. Calcular a pressão parcial de oxigênio de referência com base na pressão barométrica medida pelo respirômetro de alta resolução e na concentração padrão de oxigênio atmosférico. Use sensores fluorescentes verdes para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração.Energize os sensores em 400 a 500 milivolts e o sinal resultante é amplificado com um ganho de 1 a 1.000. Em seguida, adicione TMRM à câmara de respiração antes de adicionar mitocôndrias e calibre o sinal fluorescente usando uma calibração simples de dois pontos do sinal fluorescente versus a quantidade de fluoróforo adicionado antes da adição da mitocôndria. Realizar a calibração final do sinal TMRM após a conclusão do protocolo de titulação da respirometria, fornecendo várias titulações de agente desacoplador até que nenhum novo aumento no sinal fluorescente TMRM seja observado indicando o colapso completo do potencial de membrana mitocondrial.Use sensores fluorescentes azuis para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração e energize esses sensores para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor. Adicione oito microlitros de EDTA de dois milimolares à câmara respiratória para quelar cátions que competiriam com íons de magnésio para se ligarem ao verde de magnésio. Em seguida, adicione quatro microlitros de um milimolar verde de magnésio à câmara de respiração.Calibrar o sinal fluorescente bruto com titulações sequenciais de 10 por 2 microlitros de cloreto de magnésio de 100 milimolares, permitindo um minuto entre as titulações para estabilizar o sinal fluorescente. Determine a taxa de síntese de ATTP que é a inclinação da concentração de ATP ao longo do tempo ao longo do protocolo. Use sensores fluorescentes verdes para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração.Energize os sensores em 300 a 400 milivolts. E o sinal resultante é amplificado com um ganho de 1 para 1.000. Otimize configurações específicas para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor.Antes de adicionar as mitocôndrias realize a configuração química e calibração inicial do Amplex UltraRed Assay. Adicionar 30 micromoles de DTPA aos cátions quelados que possam interferir com a reação. Em seguida, adicione superóxido dismutase ou serratus peroxidase e Amplex UltraRed na câmara de respirometria.Deixe o sinal fluorescente estabilizar. Em seguida, adicione 0,2 micromoles de peróxido de hidrogênio duas vezes com um intervalo de cinco minutos. Realizar calibrações adicionais de dois pontos ao longo do ensaio para permitir o ajuste da capacidade de resposta do ensaio à medida que a química da respirometria muda ao longo do ensaio com o tempo específico desses pontos de calibração a critério do investigador.Vórtice a amostra para manter uma suspensão uniforme da amostra e adicionar 15 microlitros de suspensão mitocondrial isolada a cada câmara de incubação de dois mililitros para que os resultados representem o rendimento mitocondrial de 18,75 miligramas de músculo. Antes de adicionar qualquer substrato, meça o consumo residual de oxigênio e subtraia esse valor dos valores de consumo de oxigênio de cada etapa da titulação do inibidor desacoplado do substrato ou do protocolo SUIT após o preenchimento. Utilizar um SUIT de uso geral que permita a caracterização inicial da função mitocondrial do músculo esquelético equino.Comece com titulações sequenciais de piruvato, glutamato e malato uns nos outros em cada câmara para produzir nicotinamida adenina dinucleotídeo e estimular a respiração não fosforilante suportada por NADH oxidado através de vazamento complexo de uma base. Em seguida, adicione ADP para estimular a respiração fosforilante através da respiração fosforilante complexa. Adicione succinato para produzir respiração fosforilante combinando respiração fosforilante complexa um e respiração fosforilante complexa dois Adicione rotenona para bloquear o complexo um.O fluxo de oxigênio resultante representa a capacidade do complexo dois de suportar o consumo de oxigênio mitocondrial pela oxidação isolada do succinato. Um traço respiratório de alta resolução da respiração mitocondrial do músculo esquelético equino e do potencial relativo de membrana é mostrado. Os valores respiratórios das mitocôndrias incubadas com TMRM são menores devido a um efeito inibitório desse fluoróforo.A respiração mitocondrial e a síntese de ATTP do músculo esquelético equino contendo uma alta porcentagem de fibras musculares esqueléticas tipo um ricas em mitocôndrias e incubadas sob condições que aproximam o metabolismo de repouso são mostradas. O traço respiratório da respiração mitocondrial do músculo esquelético equino e a produção de peróxido de hidrogênio são mostrados. A respirometria de alta resolução requer muita paciência.A pessoa que executa o ensaio terá vários pontos de tempo em que precisa fazer uma chamada de julgamento sobre se um estado estacionário foi alcançado e o próximo passo pode ocorrer. Demonstramos apenas um único protocolo de titulação. Existem dezenas de outros protocolos que podem ser aplicados da mesma forma para abordar questões específicas sobre o metabolismo mitocondrial.

high-resolution-fluoro-respirometry-of-equine-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

Aqui, uma amostra de músculo quadríceps é retirada de um porco anestesiado e as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. Em seguida, as frequências respiratórias dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial são determinadas por meio de respirometria de alta resolução.

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Este protocolo apresenta uma coleção de dados geométricos sarcomere, cálcio e macroscópico de uma trabecula cardíaca ex vivo. Essas medidas simultâneas são possíveis pela integração de três modalidades de imagem.

Brightfield simultâneo, Fluorescência e Imagem Tomográfica de Coerência Óptica de Contrair Trabeculae Cardíaca Ex Vivo

Avaliar a fosforilação oxidativa usando respirômetros de alta resolução tornou-se parte integrante da análise funcional das mitocôndrias e do metabolismo de energia celular. Aqui, apresentamos protocolos para a análise do metabolismo de energia celular usando respirômetros de alta resolução baseados em câmara e microplatos e discutimos os principais benefícios de cada dispositivo.

Respirometria de alta resolução para avaliar bioenergésicos em células e tecidos usando respirômetros baseados em câmara e placas

A fluorometria sítio-dirigida funcional é um método para estudar movimentos do domínio de proteínas em tempo real. A modificação desta técnica para sua aplicação em células nativas agora permite a detecção e rastreamento de movimentos de sensores de voltagem únicos a partir de canais de Ca2+ dependentes de voltagem em fibras musculares esqueléticas isoladas de murino.

Fluorometria Sítio-Dirigida Funcional em Células Nativas para Estudo da Excitabilidade do Músculo Esquelético

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Aprenda fluor-respirometria de alta resolução para avaliar função mitocondrial em músculo esquelético equino. Este método mede consumo de oxigênio, ATP e espécies reativas de oxigênio, permitindo análise precisa da eficiência energética celular.

Fluor-respirometria de alta resolução do músculo esquelético equino

Explorar mais vídeos