Name: Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprenda mapeamento óptico dual-dye para estudar propriedades eletrofisiológicas em corações de camundongos CPVT. Este método permite registrar simultaneamente voltagem transmembrana e cálcio intracelular, revelando mecanismos de arritmias cardíacas.

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Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81700308 para XO e 31871181 para ML, e 82270334 para XT), Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (CN) (2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 e 2022YFS0607 a XT, e 2022NSFSC1602 a TC) e Laboratório Chave Estadual para Química e Engenharia Molecular de Recursos Medicinais (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 a XO), Bolsas MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE em Oxford (ML).

Camundongos selvagens machos de 10 a 14 semanas de idade ou camundongos RyR2-R2474S/+ (fundo C57BL/6) pesando 20-25 g são usados para os experimentos. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais da Southwest Medical University, Sichuan, China (aprovação NO:20160930) em conformidade com as diretrizes nacionais sob as quais a instituição opera.
1. Preparo
<ol><li>Soluções em estoque<ol><li>Solução-mãe de blebbistatina: Adicionar 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 100% no balão original contendo 2,924 mg de (-) blebistatina em pó para atingir uma concentração de 10 mM.</li>
		<li>Solução estoque do indicador de tensão RH237: Adicionar 1 mL de DMSO 100% no balão original com 1 mg de pó RH237 para atingir uma concentração de 2,01 mM.</li>
		<li>Solução estoque Rhod-2 AM indicador de cálcio: Adicionar 1 mL de DMSO 100% em 1 mg de pó Rhod-2 AM para atingir uma concentração de 0,89 mM.</li>
		<li>Solução estoque de Pluronic F127: Adicionar 1 mL de DMSO 100% em 200 mg de Pluronic F127 para atingir uma concentração de 20% p/v (0,66 mM).</li>
		<li>Aliquot as soluções-estoque em tubos de PCR de 200 μL em 21-51 μL (21 μL de RH237, 31 μL de Rhod-2 AM e 51 μL de blebbistatina) para uso simples ou duplo para evitar congelamento e descongelamento repetidos. Em seguida, envolva as soluções com papel alumínio e armazene a -20 °C, exceto para a solução-estoque Pluronic F127 colocada em uma sala escura à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de perfusão<ol><li>Solução de Krebs (em mM): Preparar 1 L de solução de Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 e glicose 10).</li>
		<li>Filtrar a solução com um filtro de agulha asséptico de 0,22 μm e oxigenar com 95% O 2/5% CO2.</li>
		<li>Tomar 40 ml de solução de Krebs num tubo centrífugo de 50 ml e armazená-lo a 4 °C para isolamento cardíaco de acompanhamento.</li>
	</ol></li>
	<li>O sistema de perfusão Langendorff e o dispositivo de mapeamento óptico<ol><li>Montar o sistema de perfusão Langendorff.<ol><li>Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 °C.</li>
			<li>Lavar o sistema de perfusão Langendorff com 1 L de água deionizada.</li>
			<li>Perfundir a solução da via de admissão e ajustar a taxa de saída para 3,5-4 mL/min. Em seguida, oxigenar o perfusato com gás O 2/CO2 (95%/5%) a 37 °C. NOTA: Uma bolha nunca é permitida no sistema de perfusão.</li>
		</ol></li>
		<li>Preparar o sistema de mapeamento óptico.<ol><li>Instale a câmera EMCCD (dispositivo de multiplicação de carga acoplada a elétrons) (512 × 512 pixels), lente (ampliação de 40x), diodos emissores de luz (LEDs) divisores de comprimento de onda, monitor de eletrocardiograma (ECG) e eletrodo de estimulação (Figura 1).</li>
			<li>Ajuste a distância de trabalho adequada da lente para a posição do coração.</li>
			<li>Ajuste dois LEDs na posição diagonal do banho termostático para iluminação uniforme, fornecendo um comprimento de onda de 530 nm para gerar luz de excitação. Use um filtro revestido com sputter ET525/50 para remover qualquer luz fora de banda para os LEDs.</li>
			<li>Ajuste o interruptor da alça para obter um quadrado igual da superfície alvo, fazendo com que as imagens de tensão e cálcio apareçam adequadamente na interface de aquisição.</li>
			<li>Gire a abertura da lente para o diâmetro máximo para evitar qualquer vazamento de tensão ou sinais de cálcio.</li>
			<li>Ajuste a lente da câmera em uma altura adequada, pois serve uma distância de trabalho fina para o banho termostático, 10 cm é usado principalmente.</li>
			<li>Ligue a câmara para obter uma temperatura de amostragem estável a -50 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Procedimentos
<ol><li>Colheita, canulação e perfusão do coração de camundongo<ol><li>Injetar intraperitonealmente os animais com solução de avertin (1,2%, 0,5-0,8 mL) e heparina (200 unidades) para minimizar o sofrimento e o reflexo de dor e prevenir a formação de coágulos sanguíneos. Após 15 minutos, sacrificar os animais por deslocamento cervical.</li>
		<li>Abra o peito com uma tesoura, colha o coração cuidadosamente e coloque-o na solução fria de Krebs (4 °C, 95% O 2, 5% CO2) para retardar o metabolismo e proteger o coração.</li>
		<li>Remova o tecido circundante da aorta, canule a aorta usando uma agulha canulante personalizada (diâmetro externo: 0,8 mm, diâmetro interno: 0,6 mm, comprimento: 27 mm) e fixe-a com uma sutura de seda 4-0.</li>
		<li>Perfundir o coração com o sistema Langendorff a uma velocidade constante de 3,5-4,0 mL/min e manter a temperatura em 37 ± 1 °C. NOTA: Todos os procedimentos subsequentes são realizados nesta condição.</li>
		<li>Insira um pequeno tubo de plástico (0,7 mm de diâmetro, 20 mm de comprimento) no ventrículo esquerdo para liberar a congestão da solução na câmara para evitar sobrecarga.</li>
	</ol></li>
	<li>Desacoplador de excitação-contração e carregamento de corante duplo<ol><li>Coloque dois eletrodos no perfusato no banho, ligue as potências da caixa do amplificador de ECG e do controlador de estimulação elétrica e, em seguida, inicie o software de ECG referenciado e monitore o ECG continuamente.</li>
		<li>Execute os passos subsequentes no escuro quando o coração atingir uma condição de estado estável (o coração está batendo ritmicamente a ~400 bpm).</li>
		<li>Misturar 50 μL de solução-mãe de blebistatina 10 mM com 50 ml de solução de Krebs para atingir uma concentração de 10 μM. Perfundir constantemente a mistura de solução de blebbistatina-Krebs no coração por 10 minutos para desacoplar a contração da excitação e evitar artefatos de contração durante a filmagem.</li>
		<li>Use uma lanterna vermelha para verificar se a contração do coração para totalmente, porque a contração influenciará a qualidade do carregamento do corante.</li>
		<li>Após o desacoplamento excitação-contração, misturar 15 μL de solução-mãe Rhod-2 AM com 15 μL de solução-estoque Pluronic F127 em 50 mL de solução Krebs para atingir as concentrações finais de 0,267 μM Rhod-2 AM e 0,198 μM Pluronic F127. Em seguida, perfundir o coração continuamente com a solução de trabalho Rhod-2 AM por 15 minutos no sistema de perfusão Langendorff.</li>
		<li>Manter o suprimento de oxigênio durante a carga intracelular de corante de cálcio. Como as bolhas são facilmente formadas no Pluronic F127, insira uma armadilha de bolhas no sistema de perfusão para evitar embolização gasosa das coronárias.</li>
		<li>Diluir 10 μL da solução-mãe RH237 em 50 mL do perfusato para atingir a concentração final de 0,402 μM e realizar o carregamento por 10 minutos.</li>
		<li>No final do carregamento de corante duplo, tire uma sequência de fotos para garantir que os sinais de tensão e cálcio sejam adequados para análise (sem interação entre dois sinais).</li>
	</ol></li>
	<li>Mapeamento óptico e indução de arritmias NOTA: O mapeamento óptico inicia-se após a cessação da contração e uma carga de corante apropriada, e o coração é perfundido consecutivamente como nas etapas descritas acima em 2.1 (4).<ol><li>Ligue os dois LEDs para luzes de excitação e ajuste sua intensidade em uma faixa adequada (forte o suficiente para iluminação e filmagem relativamente simples, mas não muito robusta para superexposição).</li>
		<li>Coloque o coração sob o dispositivo de detecção, certifique-se de que está sob iluminação adequada de dois LEDs e ajuste o diâmetro do ponto de luz para 2 cm.</li>
		<li>Ajuste a distância de trabalho da lente ao coração para 10 cm, dando uma taxa de amostragem de quase 500 Hz e uma resolução espacial de 120 x 120 μm por pixel.</li>
		<li>Abra o software de amostragem de sinal para controlar a câmera digitalmente para capturar sinais de tensão e cálcio simultaneamente.</li>
		<li>Inicie o estimulador de campo myopacer e defina o padrão de estimulação no Transistor Transistor Logic (TTL), duração de estimulação de 2 ms para cada pulso e 0,3 V como intensidade inicial.</li>
		<li>Utilizar 30 estímulos consecutivos de 10 Hz S1 para testar o limiar de voltagem diastólica do coração acionado pelo software de registro de ECG. Aumente gradualmente a amplitude de tensão até que a captura 1:1 seja realizada (verifique a onda QRS do monitor de ECG, os sinais de potencial de ação (AP) e transientes de cálcio (CaT).</li>
		<li>Após a determinação do limiar de voltagem, o coração acelera a uma intensidade de 2x o limiar de voltagem diastólica com um par de eletrodos de platina fixados ao epicárdio do ápice do ventrículo esquerdo (AVE).</li>
		<li>Implemente o protocolo S1S1 para medir o cálcio ou potenciais de ação e propriedades de restituição. Cadenciar o coração consecutivamente em um comprimento de ciclo básico de 100 ms, diminuindo 10 ms do comprimento do ciclo a cada sequência seguinte até atingir 50 ms. Cada episódio inclui 30 estímulos consecutivos com largura de pulso de 2 ms. Ao mesmo tempo, inicie o mapeamento óptico antes da estimulação (o tempo de amostragem inclui ~10 ritmos sinusais e duração do ritmo).</li>
		<li>Para medir o período refratário efetivo ventricular (PRE) usando o protocolo de estímulo S1S2, inicie com um ciclo de estimulação S1S1 de 100 ms com um S2 acoplado a 60 ms com um decremento de passo de 2 ms até que S2 não consiga capturar o complexo QRS ectópico.</li>
		<li>Para indução da arritmia, realizar estimulação burst perpétua de 50 Hz (50 estímulos elétricos contínuos com largura de pulso de 2 ms) e realizar o mesmo episódio de estimulação após um intervalo de 2 s de repouso.</li>
		<li>Observe cuidadosamente os registros de ECG durante o período de estimulação contínua de alta frequência para que os registros simultâneos do mapeamento óptico possam ser iniciados prontamente quando uma onda arrítmica interessante do ECG for gerada (como a maioria das arritmias cardíacas é induzida por estimulação elétrica, os sinais ópticos são amostrados 2-3 s antes da estimulação de explosão em caso de perda de eventos cardíacos importantes).</li>
		<li>Imagem usando a câmera EMCCD (taxa de amostragem: 500 Hz, tamanho do pixel: 64 x 64).</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de dados<ol><li>Carregamento de imagens e processamento de sinais<ol><li>Pressione Select Folder e Load Images para carregar as imagens no software de aquisição de imagens para análise semiautomática massiva de dados de vídeo de acordo com a configuração e protocolo descritos anteriormente15,16.</li>
			<li>Insira os parâmetros de amostragem corretos (como Tamanho do Pixel e Taxa de Quadros).</li>
			<li>Defina o limite da imagem por entrada manual e selecione a região de interesse (ROI).</li>
			<li>Implemente um filtro espacial gaussiano de 3 x 3 pixels, um filtro Savitzky-Goaly e uma correção de linha de base de cartola.</li>
			<li>Pressione Process Images para remover a linha de base e calcular os parâmetros eletrofisiológicos, como APD80 e CaTD50.</li>
		</ol></li>
		<li>Análise de parâmetros eletrofisiológicos<ol><li>Definir o tempo de início da DPA no pico e o ponto terminal em 80% de repolarização (DPA80) para o cálculo da DPA80. Da mesma forma, o tempo de início do CaTD é definido como o pico, e o ponto terminal é definido como o relaxamento de 80%.</li>
			<li>A medida da velocidade de condução (CV) depende do tamanho do pixel e do tempo de condução do potencial de ação entre dois pixels ou mais. Calcule a velocidade média de todos os pixels escolhidos - esta é a velocidade média de condução da região selecionada. Gere mapas isocronais correspondentes simultaneamente para uma visão clara da direção de condução. NOTA: O'Shea et al.15 relataram detalhadamente a medida CV.</li>
			<li>Para a análise de alternans e arritmias, os alternans de cálcio são definidos como um pico contínuo de grande e pequeno pico de amplitude aparecendo alternativamente. Utilizar a razão da amplitude de pico para avaliar a severidade de alternanos dependentes de frequência (1-A2/A1). Aplicar mapas de fase para analisar arritmias complexas, como taquicardia ventricular (TV). Procure os rotores que aparecem distintamente em uma região específica à medida que os rotores mudam.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Nenhum dos autores tem qualquer conflito de interesse a declarar.

Com base em nossa experiência, as chaves para um mapeamento óptico de corante duplo bem-sucedido de um coração de mouse incluem uma solução e coração bem preparados, carregamento de corante, alcançar a melhor relação sinal-ruído e reduzir o artefato de movimento.
Preparação da solução A solução de Krebs é essencial para um experimento cardíaco bem-sucedido. As soluções-mãe de MgCl 2 e CaCl2 (1 mol/L) são preparadas com antecedência considerando sua abs...

O distúrbio cardíaco hereditário taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVCP) manifesta-se como episódios de taquicardia ventricular polimórfica (TVPo) após atividade física, estresse ou desafio com catecolaminas, que podem se deteriorar para fibrilação ventricular potencialmente fatal 1,2,3,4 . Evidências recentes após seu primeiro relato como síndrome clínica em 1995 implicaram mutações em sete genes, todos envolvidos na liberação de Ca 2+ no armazenamento reticular sarcoplasmático (SR) nessa condição: o RYR2 mais frequentemente relatado que codifica o receptor de rianodina 2 (RyR2) dos canais de liberação de Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 que codifica calsequestrina cardíaca8, TRDN codificando a proteína juncional SRtriadina 9, e CALM1 9, CALM2 10 e CALM3 codificando de forma idêntica a calmodulina 11,12. Esses padrões genotípicos atribuem os eventos arrítmicos à liberação patológica desregulada do estoque de SR Ca2+12.
A liberação espontânea de Ca 2+ do SR pode ser detectada como faíscas de Ca 2+ ou ondas de Ca 2+, que ativam o trocador Na+/Ca 2+ (NCX). O trocador de um Ca2+ por três Na+ gera uma corrente interna, que acelera a despolarização diastólica e direciona a tensão da membrana até o limiar do potencial de ação (AP). Em camundongos knock-in RyR2, o aumento da atividade do RyR2R4496C no nó sinoatrial (SAN) leva a uma diminuição inesperada da automaticidade do SAN pela diminuição dependente de Ca 2+ da depleção de ICa,L e SR Ca2+ durante a diástole, identificando alterações fisiopatológicas subcelulares que contribuem para a disfunção do SAN em pacientes com TVCP13,14. A ocorrência das ondas Ca 2+ citosólicas de cardiomiócitos relacionadas é mais provável após aumentos no citosólico de fundo [Ca2+] após a sensibilização por RyR por catecolamina, incluindo isoproterenol (ISO), desafio.
Mudanças cinéticas detalhadas na sinalização de Ca 2+ após liberação de Ca2+ mediada por RyR2 em resposta à ativação do potencial de ação (PA) que podem ser a causa das arritmias ventriculares observadas em modelos de TVCP cardíaco intacto ainda precisam ser determinadas para toda a gama de genótipos de RyR2 relatados12. Este trabalho apresenta a configuração da instrumentação e o procedimento experimental para o mapeamento de alto rendimento de sinais de Ca2+ e potenciais transmembrana (Vm) em corações murinos selvagens (WT) e heterozigotos RyR2-R2474S/+, combinados com estimulação elétrica programada antes e após o desafio com isoproterenol. Este protocolo fornece um método para o estudo mecanístico da doença por CPVT em corações isolados de camundongos.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; </td><td>Fábrica de equipamentos médicos da Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>N / A</td><td>Para filtrar a solução</td></tr> de <tr><td>tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 mL de pipeta Pasteur</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Tubo de PCR</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. Xangai. China</td><td>F611541-0010</td><td>Alicote as soluções de estoque&nbsp; para evitar o congelamento repetido e descongelamento do</td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td><td>CFT011500</td><td>Armazene a solução de Tyrode em 4 & C para isolamento cardíaco de acompanhamento</td></tr><tr><td>Filtro de 585/40 nm</td><td>Tecnologia Chroma</td><td>N/A</td><td>Filtro para sinal de cálcio</td></tr><tr><td>Filtro passa-longo de 630 nm</td><td>Tecnologia Chroma</td> Filtro <td>G15604AJ</td><td>para sinal de tensão</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoetanol)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Reino Unido</td><td>T48402-100G</td><td>Para minimizar o sofrimento e o reflexo da dor</td></tr><tr><td>Blebistatina</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, Estados Unidos</td><td>SLBV5564</td><td>Desacoplador de excitação-contração para&nbsp; eliminar artefato de movimento durante o mapeamento</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>SLBK1794V</td><td>Para a solução de Tyrode</td></tr><tr><td>Banho termostático feito sob medida</td><td>MappingLab, Reino Unido</td><td>TBC-2.1</td><td>Para manter a temperatura da solução</td></tr> <tr><td>de perfusãoDimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td> <td>(RNBT7442)</td> <td>Solvente para corantes</td></tr><tr><td>Pinça Dumont</td><td>Fábrica de equipamentos médicos de Xangai Medical Instruments Co., Ltd., Xangai, China</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>Software ElectroMap</td><td>Universidade de Birmingham</td><td>N / A</td><td>Quantificação de parâmetros elétricos</td></tr><tr><td>Câmera EMCCD</td><td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, Estados Unidos</td><td>A18G150001</td><td>Adquirir imagens para sinais ópticos</td></tr><tr><td>ET525 / 36 filtro revestido por pulverização catódica</td><td>Tecnologia Chroma 319106</td><td></td><td>Filtro de excitação</td></tr><tr><td>Glicose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>SLBT4811V</td><td>Para a solução de Tyrode</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sódica</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td> <td>(H51021209)</td> <td>Para evitar coágulos sanguíneos na artéria coronária</td></tr><tr><td>&nbsp; Fábrica</td><td>de equipamentos médicos de pinça de íris de Xangai Medical Instruments Co., Ltd., Xangai, China</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, Estados Unidos</td><td>HY-B0468 / CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>SLBS5003</td><td>Para a solução de Tyrode</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Reino Unido</td><td>7355/7356</td><td>A luz de excitação das sondas de fluorescência</td></tr><tr><td>Fonte de luz MacroLED Cairn</td><td>Research, Faversham, Reino Unido</td><td>7352</td><td>Controle os LEDs</td></tr><tr><td>Tesoura Mayo</td><td>Fábrica de equipamentos médicos da Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Xangai, China</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N / A</td><td>Amostragem de sinais ópticos</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>BCBS6841V</td><td>Para a solução da Tyrode</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Reino Unido</td><td>M5337</td><td>Conecte o estimulador elétrico e o software Spike2</td></tr><tr><td>Estimulador de campo MyoPacer EP</td><td>Ion Optix Co, Milton, MA, Estados Unidos</td><td>S006152</td><td>Estimulador elétrico</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>SLBS2340V</td><td>Para a solução de Tyrode</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>BCBW9042</td><td>Para a solução de Tyrode</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos</td><td>SLBX3605</td><td>Para a solução de Tyrode</td></tr><tr><td>NeuroLog System</td><td>Digitimer</td><td>NL905-229</td><td>Para amplificador de ECG</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, Reino Unido</td><td>N/A</td><td>Calcium alternans e análise de arritmia</td></tr><tr><td>Tesoura oftálmica</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, Reino Unido</td><td>6970</td><td>Dividir a luz de emissão para detectar Ca2+ e Vm&nbsp; simultaneamente</td></tr><tr><td>Bomba peristálica</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, </td><td>BT100-2J</td><td>Para bombear a solução</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos</td><td>1899021</td><td>Para aumentar a carga com Rhod2AM</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, Estados Unidos</td><td>1971387</td><td>Corante sensível à voltagem</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos</td><td>1890519</td><td>Indicador de cálcio</td></tr><tr><td>Tubo de sílica gel</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td> <td>96402-16</td><td>Conecte-se com a bomba peristáltica</td></tr><tr><td>Sutura de seda</td><td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, China</td><td>20172650032</td><td>Para fixar a aorta</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Reino Unido</td><td>N/A</td><td>Para registrar e analisar dados de ECG</td></tr><tr><td>Estimulação MappingLab de eletrodo</td><td>, Reino Unido</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>312461</td><td>para fonte de luz</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>321343</td><td>Para fonte de luz</td></tr></tbody></table>

mapeamento Óptico de coração de camundongos ryr2r2474s knock-in de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

O distúrbio cardíaco pró-arrítmico taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVCP) manifesta-se como episódios de taquicardia ventricular polimórfica após atividade física, estresse ou desafio com catecolaminas, que podem se deteriorar para fibrilação ventricular potencialmente fatal. O coração de camundongo é uma espécie amplamente difundida para a modelagem de doenças arrítmicas cardíacas hereditárias, incluindo o CPVT. O mapeamento óptico simultâneo de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio (CaT) de corações de camundongos perfundidos por Langendorff tem o potencial de elucidar mecanismos subjacentes à arritmogênese. Comparada com a investigação em nível celular, a técnica de mapeamento óptico pode testar alguns parâmetros eletrofisiológicos, como a determinação da ativação, velocidade de condução, duração do potencial de ação e duração do CaT. Este trabalho apresenta a configuração da instrumentação e o procedimento experimental para o mapeamento óptico de alto rendimento de CaT e Vm em corações murinos selvagens e heterozigotos RyR2-R2474S/+, combinados com estimulação elétrica programada antes e durante o desafio com isoproterenol. Esta abordagem demonstrou um método viável e confiável para estudar mecanisticamente a doença por CPVT em uma preparação ex vivo do coração de camundongos.

O mapeamento óptico tem sido uma abordagem popular no estudo de arritmias cardíacas complexas na última década. A configuração de mapeamento óptico consiste em uma câmera EMCCD, fornecendo uma taxa de amostragem de até 1.000 Hz e uma resolução espacial de 74 x 74 μm para cada pixel. Ele permite uma relação sinal-ruído bastante alta durante a amostragem do sinal (Figura 1). Uma vez que o coração perfundido por Langendorff atinge um estado estável e a carga do corante termina, o coração é colo...

Este protocolo introduz o mapeamento óptico dual-dye de corações de camundongos obtidos de animais selvagens e knock-in afetados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluindo medidas eletrofisiológicas de voltagem transmembrana e transientes intracelulares de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial.

Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Este método nos ajudará a revelar as propriedades eletrofisiológicas e os mecanismos da baciloscopia de parada ventricular associada a doenças como a taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica. Usando esta técnica, podemos obter o potencial de membrana e sinais de cálcio intercelular simultaneamente sob vários protocolos de estimulação elétrica programada, o que é especialmente adequado para explorar os mecanismos subjacentes e a dinâmica da doença arrítmica cardíaca, como a TVCP. Para realizar este experimento com sucesso, certifique-se de ter um coração bem perfundido, carga de corante adequada, desacoplamento excitação-contração e configurações cuidadosas da câmera.Para começar, configure o sistema de mapeamento óptico e ligue a câmera para obter uma temperatura de amostragem estável a 50 graus Celsius negativos. Coloque o coração de rato colhido na solução fria de CREB para retardar o metabolismo e proteger o coração. Remova o tecido circundante da aorta.Use uma agulha de canulação feita sob medida para canulá-la e fixe-a com uma sutura de seda 4-0. Agora perfunda o coração com o sistema Langendorff a uma velocidade constante de 3,5 a 4,0 mililitros por minuto. Insira um pequeno tubo de plástico no ventrículo esquerdo para liberar a congestão da solução na câmara para evitar a pré-carga excessiva e fixe o tubo de plástico na agulha de canulação.Em seguida, coloque dois eletrodos no perfusato no banho e ligue as potências da caixa do amplificador do eletrocardiograma e do controlador de estimulação elétrica. Em seguida, inicie o software de eletrocardiograma ou ECG referenciado e monitore continuamente o ECG. Execute as etapas subsequentes no escuro quando o coração atingir uma condição de estado estável.Perfundir a mistura da solução de blebistatina CREBs constantemente no coração por 10 minutos para desacoplar a contração da excitação e evitar artefatos de contração durante a filmagem. Em seguida, usando uma lanterna vermelha, examine o coração para confirmar a cessação completa das contrações. Perfundir o coração com a solução de trabalho Rhod-2 AM por 15 minutos no sistema de perfusão Langendorff após desacoplar a contração de excitação.Manter o fornecimento de oxigênio durante a carga intracelular de corante de cálcio. Para evitar a formação de bolhas pelo F-127 plurônico, insira uma armadilha de bolhas no sistema de perfusão. Diluir 10 microlitros da solução-mãe RH 237 em 50 mililitros de perfusato e carregar durante 10 minutos.Ao completar o carregamento do corante duplo, capture uma sequência de fotos. Confirme se os sinais de tensão e cálcio são adequados para análise. Acenda os dois LEDs para luzes de excitação e ajuste sua intensidade para uma faixa adequada.Coloque o coração sob o dispositivo de detecção, garantindo que ele esteja bem iluminado pelos dois LEDs ajustando o diâmetro do ponto de luz para dois centímetros. Defina a distância de trabalho entre a lente e o coração em 10 centímetros para alcançar a taxa de amostragem e a resolução espacial desejadas. Abra o software de amostragem de sinal para controlar simultaneamente a câmera e capturar sinais de tensão e cálcio.Inicie o estimulador de campo MyoPacer e defina o padrão de estimulação para a lógica do transistor transistor com dois milissegundos de duração de estimulação por pulso. Ajuste a intensidade inicial para 0,3 volts. Posicionar um par de eletrodos de platina fixados ao epicárdio do ápice do ventrículo esquerdo.Aplicar 30 estímulos consecutivos de 10 hertz S1 para testar o limiar de voltagem diastólica do coração usando o software de gravação de ECG. Aumente gradualmente a amplitude de tensão até que a captura um-para-um seja alcançada. Implementar o protocolo S1-S1 para medir alternativas de cálcio ou potencial de ação e propriedades de restituição.Acelere o coração consecutivamente a partir de um ciclo básico de 100 milissegundos. Diminua a duração do ciclo em 10 milissegundos em cada sequência subsequente até atingir 50 milissegundos. Iniciar simultaneamente o mapeamento óptico antes da estimulação.Para medir o período refratário efetivo ventricular usando o protocolo de estímulo S1-S2, inicie com uma duração do ciclo de estimulação S1-S1 de 100 milissegundos. Acoplar S2 a 60 milissegundos e diminuir com um decremento de dois milissegundos até que S2 não consiga capturar o complexo QRS ectópico. Para indução da arritmia, administrar estimulação burst perpétua de 50 hertz e realizar o mesmo episódio de estimulação após aguardar um intervalo de dois segundos de repouso.Monitorar cuidadosamente os registros de eletrocardiograma durante o período de estimulação contínua de alta frequência para iniciar prontamente os registros simultâneos de mapeamento óptico quando uma onda arrítmica interessante for gerada. Prossiga para a captura de imagens usando a câmera do dispositivo acoplado de carga multiplicadora de elétrons. No software de aquisição de imagens, pressione Select Folder (Selecionar pasta) e carregue as imagens para iniciar o processo semiautomático de análise massiva de dados de vídeo.Insira os parâmetros de amostragem corretos para a análise. Defina manualmente o limite da imagem e selecione a região de interesse. Aplique um filtro espacial gaussiano de três por três pixels, um filtro Savitzky-Golay e uma correção de linha de base de cartola.Em seguida, pressione Process Images para remover a linha de base e calcular parâmetros eletrofisiológicos como APD-80 e CATD-50. Defina o tempo de início da duração do potencial de ação no pico e no ponto terminal em 80% de repolarização para calcular a APD-80. Da mesma forma, defina o tempo de início da duração transitória do cálcio como o pico com o ponto terminal sendo 80% de relaxamento.Traços típicos em mapas de calor de APD-80 e CATD-80 são mostrados. O isoproterenol encurta a APD-80 e os camundongos wild e catecolaminérgicos polimórficos ventriculares ou CPVT, mas nenhuma diferença foi encontrada após o desafio com isoproterenol. Os camundongos CATD-80 e CPVT foram mais longos do que no tipo selvagem após o desafio com isoproterenol, enquanto não houve significância antes do tratamento.De acordo com os sinais de voltagem, os corações do tipo selvagem e do CPVT possuíam a mesma capacidade de condução através do epicárdio no início e após a intervenção com isoproterenol. Mapas de calor demonstraram que camundongos CPVT têm a mesma capacidade de condução que os camundongos selvagens antes e depois do desafio com isoproterenol. A análise de amplitude de cálcio alternada mostrou que os sinais de cálcio em corações selvagens permaneceram estáveis no início do estudo durante a estimulação S1-S1 consecutiva a 14,29 e 16,67 hertz, enquanto os corações CPVT mostraram alternâncias dependentes da frequência.Após o desafio com isoproterenol, os corações com TVCP exibiram alternâncias dependentes da frequência e sinal de cálcio durante a estimulação S1-S1, enquanto os corações selvagens não foram influenciados. A análise de arritmia taquimétrica sugeriu que tanto o coração selvagem quanto o CPVT exibem condução normal durante o ritmo de explosão de 50 hertz no início do estudo. Após a profusão com isoproterenol, os corações com TVCP apresentaram rotores de alta frequência após estimulação de explosão de 50 hertz, enquanto os corações selvagens mantiveram a condução normal.Seguindo este procedimento, tipos adogênicos e camundongos selvagens são usados para ilustrar as propriedades eletrofisiológicas e funcionais nesses modelos ou na invenção de fármacos. O mapeamento óptico é uma ferramenta poderosa para o estudo de arritmias cardíacas, porém não pode ser utilizado clinicamente devido à limitação do corante fluorescente sob o desacoplamento da contração da excitação. Com o desenvolvimento de fluorescentes próprios para diferentes moléculas-alvo sob o desenvolvimento de tecnologia computacional de alta revolução, a técnica de mapeamento óptico cardíaco está fadada a alcançar apenas aplicações.

dual-dye-optical-mapping-hearts-from-ryr2r2474s-knock-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Este relatório fornece uma descrição detalhada da metodologia e os resultados do mapeamento endocárdico e epicárdico simultâneos óptico de excitação elétrica no átrio esquerdo intacto de um coração de ovelha Langendorff-perfundidos durante o alongamento induzida por fibrilação atrial.

Alta Resolução Mapeamento endocárdico e epicárdico óptico em um modelo de Ovinos de Stretch Induzida por Fibrilação Atrial

Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).

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Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.

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Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Aqui, apresentamos um protocolo para o mapeamento óptico da atividade elétrica do átrio direito do mouse e, especialmente, o nó sino-atrial, em uma alta resolução espacial e temporal.

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Este trabalho relata um método de controle do ritmo cardíaco de corações murinos intactos de camundongos transgênicos com canalrodopsina-2 (ChR2) utilizando fotoestimulação local com matriz micro-LED e mapeamento óptico simultâneo do potencial de membrana epicárdica.

Gerenciamento Avançado do Ritmo Cardíaco Aplicando Fotoestimulação Optogenética Multi-Site em Corações Murinos

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Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2^R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica

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