Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica

Este método nos ajudará a revelar as propriedades eletrofisiológicas e os mecanismos da baciloscopia de parada ventricular associada a doenças como a taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica. Usando esta técnica, podemos obter o potencial de membrana e sinais de cálcio intercelular simultaneamente sob vários protocolos de estimulação elétrica programada, o que é especialmente adequado para explorar os mecanismos subjacentes e a dinâmica da doença arrítmica cardíaca, como a TVCP. Para realizar este experimento com sucesso, certifique-se de ter um coração bem perfundido, carga de corante adequada, desacoplamento excitação-contração e configurações cuidadosas da câmera.

Para começar, configure o sistema de mapeamento óptico e ligue a câmera para obter uma temperatura de amostragem estável a 50 graus Celsius negativos. Coloque o coração de rato colhido na solução fria de CREB para retardar o metabolismo e proteger o coração. Remova o tecido circundante da aorta.

Use uma agulha de canulação feita sob medida para canulá-la e fixe-a com uma sutura de seda 4-0. Agora perfunda o coração com o sistema Langendorff a uma velocidade constante de 3,5 a 4,0 mililitros por minuto. Insira um pequeno tubo de plástico no ventrículo esquerdo para liberar a congestão da solução na câmara para evitar a pré-carga excessiva e fixe o tubo de plástico na agulha de canulação.

Em seguida, coloque dois eletrodos no perfusato no banho e ligue as potências da caixa do amplificador do eletrocardiograma e do controlador de estimulação elétrica. Em seguida, inicie o software de eletrocardiograma ou ECG referenciado e monitore continuamente o ECG. Execute as etapas subsequentes no escuro quando o coração atingir uma condição de estado estável.

Perfundir a mistura da solução de blebistatina CREBs constantemente no coração por 10 minutos para desacoplar a contração da excitação e evitar artefatos de contração durante a filmagem. Em seguida, usando uma lanterna vermelha, examine o coração para confirmar a cessação completa das contrações. Perfundir o coração com a solução de trabalho Rhod-2 AM por 15 minutos no sistema de perfusão Langendorff após desacoplar a contração de excitação.

Manter o fornecimento de oxigênio durante a carga intracelular de corante de cálcio. Para evitar a formação de bolhas pelo F-127 plurônico, insira uma armadilha de bolhas no sistema de perfusão. Diluir 10 microlitros da solução-mãe RH 237 em 50 mililitros de perfusato e carregar durante 10 minutos.

Ao completar o carregamento do corante duplo, capture uma sequência de fotos. Confirme se os sinais de tensão e cálcio são adequados para análise. Acenda os dois LEDs para luzes de excitação e ajuste sua intensidade para uma faixa adequada.

Coloque o coração sob o dispositivo de detecção, garantindo que ele esteja bem iluminado pelos dois LEDs ajustando o diâmetro do ponto de luz para dois centímetros. Defina a distância de trabalho entre a lente e o coração em 10 centímetros para alcançar a taxa de amostragem e a resolução espacial desejadas. Abra o software de amostragem de sinal para controlar simultaneamente a câmera e capturar sinais de tensão e cálcio.

Inicie o estimulador de campo MyoPacer e defina o padrão de estimulação para a lógica do transistor transistor com dois milissegundos de duração de estimulação por pulso. Ajuste a intensidade inicial para 0,3 volts. Posicionar um par de eletrodos de platina fixados ao epicárdio do ápice do ventrículo esquerdo.

Aplicar 30 estímulos consecutivos de 10 hertz S1 para testar o limiar de voltagem diastólica do coração usando o software de gravação de ECG. Aumente gradualmente a amplitude de tensão até que a captura um-para-um seja alcançada. Implementar o protocolo S1-S1 para medir alternativas de cálcio ou potencial de ação e propriedades de restituição.

Acelere o coração consecutivamente a partir de um ciclo básico de 100 milissegundos. Diminua a duração do ciclo em 10 milissegundos em cada sequência subsequente até atingir 50 milissegundos. Iniciar simultaneamente o mapeamento óptico antes da estimulação.

Para medir o período refratário efetivo ventricular usando o protocolo de estímulo S1-S2, inicie com uma duração do ciclo de estimulação S1-S1 de 100 milissegundos. Acoplar S2 a 60 milissegundos e diminuir com um decremento de dois milissegundos até que S2 não consiga capturar o complexo QRS ectópico. Para indução da arritmia, administrar estimulação burst perpétua de 50 hertz e realizar o mesmo episódio de estimulação após aguardar um intervalo de dois segundos de repouso.

Monitorar cuidadosamente os registros de eletrocardiograma durante o período de estimulação contínua de alta frequência para iniciar prontamente os registros simultâneos de mapeamento óptico quando uma onda arrítmica interessante for gerada. Prossiga para a captura de imagens usando a câmera do dispositivo acoplado de carga multiplicadora de elétrons. No software de aquisição de imagens, pressione Select Folder (Selecionar pasta) e carregue as imagens para iniciar o processo semiautomático de análise massiva de dados de vídeo.

Insira os parâmetros de amostragem corretos para a análise. Defina manualmente o limite da imagem e selecione a região de interesse. Aplique um filtro espacial gaussiano de três por três pixels, um filtro Savitzky-Golay e uma correção de linha de base de cartola.

Em seguida, pressione Process Images para remover a linha de base e calcular parâmetros eletrofisiológicos como APD-80 e CATD-50. Defina o tempo de início da duração do potencial de ação no pico e no ponto terminal em 80% de repolarização para calcular a APD-80. Da mesma forma, defina o tempo de início da duração transitória do cálcio como o pico com o ponto terminal sendo 80% de relaxamento.

Traços típicos em mapas de calor de APD-80 e CATD-80 são mostrados. O isoproterenol encurta a APD-80 e os camundongos wild e catecolaminérgicos polimórficos ventriculares ou CPVT, mas nenhuma diferença foi encontrada após o desafio com isoproterenol. Os camundongos CATD-80 e CPVT foram mais longos do que no tipo selvagem após o desafio com isoproterenol, enquanto não houve significância antes do tratamento.

De acordo com os sinais de voltagem, os corações do tipo selvagem e do CPVT possuíam a mesma capacidade de condução através do epicárdio no início e após a intervenção com isoproterenol. Mapas de calor demonstraram que camundongos CPVT têm a mesma capacidade de condução que os camundongos selvagens antes e depois do desafio com isoproterenol. A análise de amplitude de cálcio alternada mostrou que os sinais de cálcio em corações selvagens permaneceram estáveis no início do estudo durante a estimulação S1-S1 consecutiva a 14,29 e 16,67 hertz, enquanto os corações CPVT mostraram alternâncias dependentes da frequência.

Após o desafio com isoproterenol, os corações com TVCP exibiram alternâncias dependentes da frequência e sinal de cálcio durante a estimulação S1-S1, enquanto os corações selvagens não foram influenciados. A análise de arritmia taquimétrica sugeriu que tanto o coração selvagem quanto o CPVT exibem condução normal durante o ritmo de explosão de 50 hertz no início do estudo. Após a profusão com isoproterenol, os corações com TVCP apresentaram rotores de alta frequência após estimulação de explosão de 50 hertz, enquanto os corações selvagens mantiveram a condução normal.

Seguindo este procedimento, tipos adogênicos e camundongos selvagens são usados para ilustrar as propriedades eletrofisiológicas e funcionais nesses modelos ou na invenção de fármacos. O mapeamento óptico é uma ferramenta poderosa para o estudo de arritmias cardíacas, porém não pode ser utilizado clinicamente devido à limitação do corante fluorescente sob o desacoplamento da contração da excitação. Com o desenvolvimento de fluorescentes próprios para diferentes moléculas-alvo sob o desenvolvimento de tecnologia computacional de alta revolução, a técnica de mapeamento óptico cardíaco está fadada a alcançar apenas aplicações.