Produção de neurônios humanos induzíveis por neurogenina 2 em biorreator de suspensão tridimensional

O uso de biorreatores para traduzir células-tronco pluripotentes induzidas ou protocolos de cultura IPSC de 2D para 3D permite a geração de células em grande número para aplicações em larga escala, como triagens de alto rendimento. Este protocolo de diferenciação neuronal rápida em um ambiente fisiológico 3D melhora as interações da célula inicial e proporciona alto rendimento celular em uma duração mais curta com uma baixa variação lote a lote, reduzindo assim o custo e o tempo. O Banco Europeu de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas está aplicando abordagens semelhantes para a geração rápida e econômica de células diferenciadas em várias linhagens, incluindo outras células cerebrais e cardiomiócitos.

Comece o pré-cultivo quando a célula-tronco pluripotente induzida por humanos, ou cultura humana iPSC, for 60 a 80% confluente. Aspirar completamente o meio das iPSCs humanas e enxaguar suavemente as células com 1X DPBS duas vezes. Adicione dois mililitros de solução de EDTA de tripsina pré-aquecida à placa de Petri de seis centímetros e incube as células por três minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora.

Em seguida, bata suavemente nos pratos para facilitar o descolamento celular ou incube por mais um a dois minutos se as células não estiverem se destacando. Em seguida, ressuspenda as células em cada prato adicionando cinco mililitros de meio de manutenção IPSC sem alimentador com inibidor de ROCK. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mililitros ou 50 mililitros e misture suavemente por pipetagem para garantir a singularização da célula.

Determine os números de células em 100 microlitros de suspensão celular usando um contador de células automatizado e transfira o volume desejado de suspensão de células para um tubo de 50 mililitros. Centrifugar as células a 300 G durante três minutos. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em dois mililitros de meio de manutenção IPSC sem alimentador com inibidor de ROCK.

Encha cada tubo de 50 mililitros com 18 mililitros do meio. Em seguida, distribua 20 mililitros de suspensão celular em cada tubo do biorreator. Coloque os tubos no sistema do biorreator e defina os parâmetros de cultivo por tempo ilimitado.

Inicie o programa de pré-cultivo através do visor do biorreator. Para trocar o meio no dia seguinte, deixe o agregado se acomodar nos tubos do biorreator por cerca de cinco minutos antes de aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 15 mililitros de meio de manutenção IPSC fresco sem alimentador sem inibidor de ROCK por tubo e continue o cultivo no biorreator de bancada por 24 horas.

Para iniciar a diferenciação neuronal, deixe o agregado se acomodar nos tubos do biorreator e aspirar cuidadosamente o sobrenadante das células, deixando cerca de cinco mililitros de sobrenadante no tubo. Em seguida, adicione 35 mililitros de meio de indução neural composto por meio neurobasal e dois microgramas por mililitro de doxiciclina. Coloque os tubos de volta no biorreator de bancada e continue o cultivo.

Realize alterações de mídia todos os dias por dois dias, conforme demonstrado anteriormente. Após aspirar o sobrenadante, conforme mostrado anteriormente, transfira os agregados para um tubo estéril de 15 mililitros ou 50 mililitros e lave suavemente os agregados duas vezes com DPBS. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante tanto quanto possível sem perturbar os agregados.

Em seguida, adicione dois a cinco mililitros de enzima de dissociação celular pré-aquecida ao pellet, dependendo do tamanho do pellet, e incube as células por aproximadamente 10 minutos a 37 graus Celsius em banho-maria. Ressuspender suavemente os agregados sedimentados a cada dois minutos até que os agregados se dissociam. Adicionar meio neurobasal pré-aquecido, três vezes o volume da enzima de dissociação celular adicionada anteriormente, e ressuspender as células cuidadosamente para garantir a singularização celular.

Determine o número de células e transfira o volume correspondente de suspensão celular para criopreservação para um tubo de 15 mililitros ou 50 mililitros. Centrifugar para as células a 300 G durante três minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender suavemente o pellet celular no volume correspondente do meio de congelação contendo 10% de dimetilsulfóxido.

Alíquota a suspensão celular em frascos adequados para criopreservação. Transfira os frascos imediatamente para um recipiente de congelamento pré-refrigerado e de velocidade lenta cheio de 2-propanol e coloque o recipiente a menos 80 graus Celsius durante a noite. Coloque os frascos para injetáveis a menos 150 graus Celsius no dia seguinte para armazenamento a longo prazo.

Depois que as culturas aderentes das iPSCs humanas foram destacadas, singularizadas e transferidas para suspensão, os agregados se formaram em 24 horas e continuaram a crescer. Após dois dias da indução do transgene, os neurônios precoces puderam ser criopreservados para posterior maturação. Observou-se proliferação persistente das iPSCs humanas durante os primeiros dias em suspensão, e o número de cultura celular atingiu o pico após dois dias da indução.

Entretanto, o cultivo prolongado por mais de quatro dias em suspensão não melhorou o rendimento celular, uma vez que os agregados tornaram-se cada vez mais resistentes à singularização enzimática. Além disso, em comparação com o dia zero, o diâmetro agregado aumentou 50% no segundo dia e quase dobrou no quinto dia. Embora o aumento do diâmetro limite o fornecimento de nutrientes aos agregados, a viabilidade das células não foi afetada no segundo ou quinto dia de diferenciação.

O perfil temporal de expressão gênica, bem como a coloração imunoquímica para os marcadores neuronais beta três tubulina e proteína associada a microtúbulos, ou MAP2, confirmaram a identidade celular neuronal das células criopreservadas do segundo dia. Além disso, culturas neuronais foram enriquecidas em transcritos de proteína tau associados a microtúbulos, ou MAPT, e mostraram um declínio concomitante na expressão do fator de transcrição regulador de pluripotência POU5F1 Uma densa rede neurítica foi formada na primeira semana após o descongelamento, o que também sugeriu uma maturação crescente das culturas neuronais. Este protocolo estabelece as bases para a tradução em biorreatores de grande escala e totalmente automatizados, que mostram um aumento significativo na capacidade de produção de células para futuras aplicações em larga escala.

Uma vez comprovado com neurogenina 2, o uso de fatores de transcrição determinantes lineares para acelerar a diferenciação tem sido aplicado a muitos tipos celulares e doenças diferentes para facilitar a modelagem iPSC.