Usando reagentes de referência para confirmar a robustez dos ensaios de liberação de citocinas para a previsão da segurança do anticorpo monoclonal

O teste de segurança de novos medicamentos é crítico, e este protocolo descreve como usar padrões validados para avaliar a reprodutibilidade, robustez e limitações potenciais de uma plataforma CRS. Essa técnica foi validada com esses reagentes em 11 laboratórios diferentes e um estudo colaborativo internacional com padrões semelhantes de resposta observados, melhorando assim os esforços de harmonização e reprodutibilidade. As aplicações dessa técnica se estendem a melhorar o teste de risco de CRS de novos anticorpos terapêuticos e também ajudará a estar pronto para o gerenciamento clínico de possíveis efeitos colaterais.

Este trabalho visa melhorar a reprodutibilidade e a harmonização, e uma demonstração visual aumenta as chances de reprodutibilidade. Comece reconstituindo o conteúdo das ampolas do reagente de referência em um mililitro de água destilada estéril e aguarde de 5 a 10 minutos de reidratação. Em seguida, misture cada solução de anticorpos adequadamente antes de transferi-la para um tubo com tampa estéril.

Em seguida, dilua cada anticorpo reconstituído e teste o anticorpo a 10 microgramas por mililitro em PBS estéril. Pegue uma placa de microtitulação de polipropileno de 96 poços estéril, não tratada com TC, com fundo em U e adicione 100 microlitros da solução de anticorpos diluídos desejada aos poços designados da placa. Em seguida, incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius antes de realizar o ensaio de fase sólida.

Depois de coletar um mínimo de 30 mililitros de sangue total periférico em um tubo heparinizado, inverta-o várias vezes para garantir a mistura adequada da amostra de sangue com heparina sódica. Reserve 15 mililitros da amostra de sangue total em um tubo separado para uso posterior no ensaio de sangue total da fase aquosa. Dilua os 15 mililitros restantes de sangue total adicionando um volume igual de PBS ou meio RPMI 1640 sem soro.

Coloque suavemente o sangue diluído no topo de 15 mililitros de um meio de gradiente de densidade em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar o tubo utilizando um rotor basculante sem travão e uma aceleração reduzida a 500 G e temperatura ambiente durante 20 minutos para separar o sangue nos seus diferentes componentes. Após a centrifugação, o gradiente de densidade se separará como uma camada superior de plasma, seguida por uma fina camada de revestimento leucocitário contendo PBMCs e uma camada inferior contendo hemácias e granulócitos polimorfonucleares, incluindo neutrófilos e eosinófilos.

Remova cuidadosamente a camada superior de plasma, seguida pela próxima camada, para colher os PBMCs. Para lavar, ressuspenda a camada buffy colhida em 10 mililitros de PBS ou mídia RPMI 1640 sem soro. Centrifugue o tubo a 500 G por 10 minutos para pellet as células.

Rejeitar o sobrenadante e repetir a lavagem novamente. Em seguida, ressuspenda o pellet resultante em dois mililitros de mídia RPMI completa. Conte as células usando um hemocitômetro e ajuste a concentração de PBMC para 1 milhão de células por mililitro em RPMI completo.

Para o ensaio de liberação de citocinas de sangue total em fase aquosa, pegue a amostra de sangue total previamente reservada, adicione 190 microlitros da amostra aos poços de uma placa de poliestireno com fundo em U de 96 poços, anticorpos de tratamento térmico e reagentes de referência pré-diluídos a 100 microgramas por mililitro em PBS e adicione 10 microlitros do anticorpo diluído desejado aos poços designados contendo 190 microlitros de sangue total. Incube a placa por 48 horas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius. Para o ensaio de liberação de citocinas PBMC em fase sólida, obtenha as placas revestidas previamente preparadas.

Usando uma pipeta multicanal, descarte a solução de anticorpos das placas revestidas. Depois de encher um reservatório de reagente com PBS, lave a placa três vezes com 200 microlitros de PBS para remover anticorpos monoclonais não ligados. Adicione 200 microlitros da suspensão PBMC previamente preparada a cada poço.

Incube a placa por 48 horas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 48 horas de incubação com anticorpos monoclonais de controlo e teste, centrifugar as placas a 400 G durante cinco minutos. Colete o meio ou plasma condicionado pela célula sem perturbar o pellet celular.

Congele o sobrenadante ou plasma coletado a menos 20 graus Celsius. Os resultados do ensaio de fase sólida PBMC demonstraram que os anticorpos de controle positivo induziram níveis significativamente altos de citocinas quando comparados aos controles de isotipo correspondentes. Também foi observado que o superagonista anti-CD28 induziu uma mudança significativamente maior na interleucina-2, ou liberação de IL-2, do que seu isotipo correspondente, enquanto o anti-CD3 e o anti-CD52, embora ainda induzam a expressão de IL-2, resultaram em alterações nas dobras inferiores.

No ensaio de fase aquosa de sangue total, o nível de citocinas detectáveis foi relativamente menor do que no ensaio de fase sólida, mas foi caracterizado por uma maior sensibilidade à estimulação por anti-CD52.