Name: Elucidando o metabolismo do 2,4-dibromofenol em plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:25:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a identificar metabolitos de 2,4-dibromofenol em plantas usando cultura de calos vegetais. Este método simplifica a avaliação da degradação metabólica de xenobióticos com menos interferências ambientais.

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Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (21976160) e pelo Projeto de Pesquisa de Aplicação de Tecnologia de Bem-Estar Público da Província de Zhejiang (LGF21B070006).

1. Diferenciação do calo de cenoura
NOTA: Autoclave todos os equipamentos utilizados aqui e realize todas as operações em uma bancada ultralimpa esterilizada por UV.
<ol><li>Vernalizar as sementes imergindo as sementes uniformes de cenoura (Daucus carota var. sativus) em água deionizada a 4 °C por 16 h.</li>
	<li>Esterilizar superficialmente as sementes vernalizadas com etanol 75% por 20 min e, em seguida, enxaguar três vezes com água deionizada estéril em condições assépticas.</li>
	<li>Esterilizar as sementes com 20% H 2 O2por 20 min e lavá-las com água deionizada esterilizada seis vezes em condições assépticas.</li>
	<li>Germinar assepticamente as sementes semeando-as em meio MS livre de hormônios (pH 5,8, autoclavado a 121 °C por 20 min) contendo ágar-gel a 1% e incubando a 26 °C com fotoperíodo de 16 h (350 μmol/m2s) por 15 dias.</li>
	<li>Obter os explantes cortando o hipocótilo e o cotilédone das mudas em pequenos pedaços (0,5 cm).</li>
	<li>Transformar os explantes em placas de Petri (dois a quatro explantes por prato) contendo 15-20 mL de meio MS asséptico suplementado com auximona (ácido 2,4-diclorofenoxiacético; 1 mg/L) e fitocinina (6-benzilaminopurina; 0,5 mg/L) em condições assépticas.</li>
	<li>Incubar os explantes no escuro a 26 °C durante 3-4 semanas para induzir o calo.</li>
	<li>Separe os tecidos do calo (cerca de 1 cm de diâmetro) formados a partir dos explantes iniciais utilizando bisturi estéril e pinças. NOTA: Os tecidos do calo recém-formado são de cor branca a amarelo cremoso e se fixam vagamente aos explantes iniciais.</li>
</ol>2. Tratamento com 2,4-dibromofenol
<ol><li>Dissolver 1 μg de 2,4-dibromofenol em 10 mL de meio MS líquido asséptico (a concentração final de 2,4-dibromofenol é de 100 ppb, pH 5,6-7,0).</li>
	<li>Adicionar 3 g do calo fresco de cenoura (passo 1.8) em frascos de vidro contendo a solução preparada de 2,4-dibromofenol (do passo 2.1) em condições assépticas. Considere isso como o tratamento com 2,4-dibromofenol. OBS: Os frascos de vidro foram autoclavados e selados com filme de parafina.</li>
	<li>Incluir um meio de controlo contendo apenas a solução de 2,4-dibromofenol (preparada no passo 2.1) para avaliar a degradação abiótica do 2,4-dibromofenol.</li>
	<li>Incluir um controlo em branco contendo apenas o calo de cenoura (sem solução de 2,4-dibromofenol) para verificar se existe qualquer contaminação potencial.<ol><li>Preparar o controle em branco contendo cenoura adicionando 3 g de calo de cenoura fresco coletado apenas em 10 mL de meio MS estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar o tratamento com 2,4-dibromofenol e os controles médio e branco a 130 rpm e 26 °C no escuro em estufa por 120 h.</li>
	<li>Retirar os frascos de vidro da incubadora para coletar as amostras do tratamento com 2,4-dibromofenol e controles após 120 h de incubação. OBS: Todas as amostras foram preparadas em triplicata.</li>
</ol>3. Preparo da amostra
<ol><li>Separe cuidadosamente o calo do meio MS por filtração com filtros de fibra de vidro (0,45 μm) para o tratamento com 2,4-dibromofenol e os controles. Recolher o calo após lavar com água ultrapura três vezes.</li>
	<li>Liofilizar o calo coletado com nitrogênio líquido e, posteriormente, homogeneizar o calo coletado (0,2 g) com um moedor de tecido de alto rendimento a 70 Hz por 3 min.</li>
	<li>Cravar o calo homogeneizado adicionando 50 μL de 25 mg/L substituto 4-n-NP-d4 com uma microseringa de vidro e, subsequentemente, vórtice por 1 min.</li>
	<li>Sonicar as amostras com 5 mL de metanol/água (1:1, v/v) em um ultrasonicator (150 W, 40 kHz) preenchido com água gelada por 30 min, para extrair 2,4-dibromofenol e os metabólitos.</li>
	<li>Centrifugar as suspensões a 8.000 x g a 4 °C durante 10 min e recolher os sobrenadantes por pipetagem.<ol><li>Repita os processos de extração para a amostra de calo três vezes e combine os extratos.</li>
	</ol></li>
	<li>Passar os extratos através de cartuchos de extração em fase sólida hidrofílica lipofílica balanceada (HLB SPE) com vazão de 1 mL/min. OBS: Os cartuchos de SPE do HLB foram pré-tratados sequencialmente com 6 mL de metanol e 6 mL de água para remover quaisquer interferências.</li>
	<li>Eluir os analitos passando 6 mL de metanol pelos cartuchos HLB SPE. Em seguida, concentrar os eluentes obtidos para 1 mL sob uma corrente suave de gás nitrogênio para análise instrumental.</li>
	<li>Injetar 10 μL dos eluentes resultantes no UPLC-Q-TOF-MS para análise do 2,4-dibromofenol e seus metabólitos15.<ol><li>Filtrar todas as amostras com uma membrana de nylon de 0,22 μm antes da análise instrumental.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise instrumental
NOTA: As análises do 2,4-dibromofenol e seus metabólitos foram realizadas em um cromatógrafo líquido de ultra-eficiência (UPLC) em combinação com um espectrômetro de massas micrOTOF-QII equipado com uma ionização por eletrospray (ESI), operando nos modos de íons positivos e negativos.
<ol><li>Abra a porta do aquecedor de coluna e instale a coluna UPLC conectando a entrada da coluna à válvula de injeção e a saída da coluna à entrada do espectrômetro de massa. NOTA: Uma coluna C18 (50 mm x 2,1 mm; tamanho de partícula de 1,7 μm) foi usada para a separação dos analitos a 40 °C.</li>
	<li>Conecte a fase A móvel (água ultrapura) e a fase B móvel (metanol grau cromatografia) ao instrumento inserindo a extremidade dos tubos de solvente A e B nas garrafas de solvente correspondentes, respectivamente.<ol><li>Filtrar todas as fases móveis (500 mL para cada) através de um filtro de 0,22 μm e sonicar por mais de 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Na janela do software, clique em Instrumento | Método de entrada para editar as condições do cromatograma líquido.<ol><li>Definir as condições de gradiente da fase móvel B da seguinte forma: fluxo de 1,0 mL/min; 0-0,5 min, 5%; 0,5-3,5 min, 5% a 50%; 3,5-6,5 min, 50% a 100%; 6,5-7 min, 100%; 7-10 min, 100% a 5%.</li>
		<li>Ajuste a taxa de injeção das amostras no UPLC-Q-TOF-MS como 0,2 mL/min. NOTA: A injeção da amostra é programada usando um amostrador totalmente automático.</li>
	</ol></li>
	<li>Na janela do software, selecione Método MS e, em seguida, configure os parâmetros de Q-TOF-MS: uma taxa de fluxo de gás de secagem (N2) de 8 L/min, uma temperatura de 300-350 °C; uma tensão capilar de 4.500 V; uma energia de colisão de 5-45 V; e uma faixa de varredura completa de 40-800 Da.</li>
	<li>Coloque os frascos para injetáveis de amostra nos locais correspondentes dos tabuleiros de recolha de amostras por número de série e volte a introduzir os frascos de amostras na câmara de amostras. NOTA: Mantenha os tabuleiros de amostra planos e certifique-se de que a porta da câmara de amostras está fechada.</li>
	<li>Na janela do software, selecione Arquivo | Novo para criar um banco de dados. Nomeie o banco de dados.</li>
	<li>Carregue o programa de exemplo criado acima selecionando Arquivo MS | Arquivo de entrada | Volume de Injetagem.</li>
	<li>Salve o banco de dados na pasta de exemplo do projeto clicando em Arquivo | Salve.</li>
	<li>Selecione Executar | Inicie na janela principal do software e, em seguida, selecione Adquirir dados de exemplo e clique em OK na janela da execução da lista de exemplo inicial para coletar dados. NOTA: O cromatograma em tempo real pode ser visualizado clicando em Cromatograma | Atualização em tempo real durante o processo de aquisição de dados.</li>
	<li>Processe os dados no software selecionando a linha de dados de destino e clicando na janela Cromatograma para visualizar o cromatograma de varredura MS.</li>
	<li>Na janela Cromatograma , clique em Exibir | TIC | ScanWaveDS - Brasil | Adicionar rastreamento | OK para obter a filha digitalizar espectros de massa.</li>
	<li>Identificar os metabolitos comparando os cromatogramas do tratamento com 2,4-dibromofenol e os controlos.</li>
	<li>Elucidar os candidatos a metabólitos pelos padrões de tempo de retenção, massa e fragmentação16,17. NOTA: O erro de precisão de massa entre os valores m/z experimentais dos iões precursores dos candidatos a metabolito para o seu correspondente m/z teórico deve ser inferior a 10 ppm.</li>
</ol>

<ol><li>Chakraborty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+investigation+on+plasticizers%2C+bisphenol+A%2C+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+and+heavy+metals+in+the+surface+soil+of+the+informal+electronic+waste+recycling+workshops+and+nearby+open+dumpsites+in+Indian+metropolitan+cities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities.</a> Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).</li>
<li>Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate+and+environmental+risk+of+anionic+surfactants%2C+bisphenol+A%2C+perfluorinated+compounds+and+personal+care+products+in+sludge+stabilization+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments.</a> Science of the Total Environment. 711, 135048(2020).</li>
<li>Xu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+occurrence+of+bisphenol+A+and+thirteen+structural+analogs+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil.</a> Chemosphere. 277, 130232(2021).</li>
<li>Cai, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+nonylphenol+and+nonylphenol+monoethoxylate+in+soil+and+vegetables+from+vegetable+farms+in+the+Pearl+River+Delta%2C+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Environmental+Contamination+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China.</a> Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).</li>
<li>Wang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Migration+and+health+risks+of+nonylphenol+and+bisphenol+a+in+soil-winter+wheat+systems+with+long-term+reclaimed+water+irrigation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).</li>
<li>Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isomer-specific+approach+to+endocrine-disrupting+nonylphenol+in+infant+food%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).</li>
<li>Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+metabolism+in+plants+and+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Pesticide metabolism in plants and microorganisms.</a> Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).</li>
<li>Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+callus+cultures+to+elucidate+the+metabolism+of+tebuconazole%2C+flurtamone%2C+fenhexamid%2C+and+metalaxyl-M+in+Brassica+napus+L.%2C+Glycine+max+%28L.%29+Merr.%2C+Zea+mays+L.%2C+and+Triticum+aestivum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).</li>
<li>Macherius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolization+of+the+bacteriostatic+agent+triclosan+in+edible+plants+and+its+consequences+for+plant+uptake+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment.</a> Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).</li>
<li>Sun, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+nonylphenol+in+plants%3A+Isomer+selectivity+involved+with+direct+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation.</a> Environmental Pollution. 270, 116064(2021).</li>
<li>Schymanski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).</li>
<li>Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Household+dust+as+a+repository+of+chemical+accumulation%3A+new+insights+from+a+comprehensive+high-resolution+mass+spectrometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study.</a> Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+PBDEs+and+brominated+phenolic+compounds+in+particulate+matters+emitted+during+recycling+of+waste+printed+circuit+boards+in+a+typical+e-waste+workshop+of+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China.</a> Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).</li>
<li>de Wit, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+brominated+flame+retardants+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">An overview of brominated flame retardants in the environment.</a> Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).</li>
<li>Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Uptake+and+Metabolism+of+e%2C4-Dibromophenol+in+Carrot%3A+In+Vitro+Enzymatic+Direct+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).</li>
<li>Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+framework+for+identifying+toxic+transformation+products+in+complex+environmental+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).</li>
<li>Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontarget+screening+with+high+resolution+mass+spectrometry+in+the+environment%3A+ready+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go.</a> Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).</li>
<li>Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplays+between+the+cell+wall+and+phytohormones+in+interaction+between+plants+and+necrotrophic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens.</a> Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+metabolic+pathways+of+2%2C4%2C6-tribromophenol+in+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li>
<li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo foi desenvolvido para identificar eficientemente a biotransformação de xenobióticos em plantas. A etapa crítica deste protocolo é o cultivo do calo vegetal. A parte mais difícil é a diferenciação e manutenção do calo vegetal, pois o calo vegetal é facilmente infectado e desenvolvido para os tecidos vegetais. Portanto, é importante certificar-se de que todos os equipamentos utilizados sejam autoclavados e que todas as operações sejam realizadas em condições assépticas. A diferenciação e manutenção do calo v...

Um número crescente de poluentes orgânicos tem sido descartado no meio ambiente devido às atividades antrópicas 1,2, sendo o solo considerado um importante sumidouro desses contaminantes 3,4. Os contaminantes presentes no solo podem ser absorvidos pelas plantas e potencialmente transferidos para organismos de nível trófico superior ao longo das cadeias alimentares, entrando diretamente no corpo humano por meio do consumo das culturas, levando consequentemente à exposição não intencional 5,6. As plantas utilizam diferentes vias para metabolizar xenobióticos para desintoxicação7; A elucidação do metabolismo dos xenobióticos é importante, pois controla o real destino dos contaminantes nas plantas. Como os metabólitos podem ser excretados pelas folhas (para a atmosfera) ou pelas raízes, a determinação dos metabólitos nas fases iniciais de exposição oferece a possibilidade de testar um número extenso de metabólitos8. No entanto, estudos utilizando plantas intactas requerem experimentos de longa duração e protocolos complexos de preparo de amostras que podem ser afetados por vários fatores.
As culturas de calos vegetais, portanto, são uma boa alternativa para estudar o metabolismo de xenobióticos em planta, pois podem encurtar muito o tempo de tratamento. Essas culturas excluem a interferência microbiana e a degradação fotoquímica, simplificam o efeito de matriz de plantas intactas, padronizam as condições de cultivo e requerem menor esforço experimental. Culturas de calos vegetais têm sido aplicadas com sucesso como uma abordagem alternativa em estudos metabólicos de triclosan9, nonilfenol10 e tebuconazol8. Esses estudos mostraram que os padrões metabólicos nas culturas de calos foram semelhantes aos das plantas intactas. Este trabalho propõe um método para a identificação eficiente e precisa de metabólitos de xenobióticos em plantas sem protocolos complexos e demorados. Neste trabalho, utilizamos culturas de calos vegetais em combinação com espectrometria de massas de alta resolução para a análise de metabólitos com sinais de baixa intensidade11,12.
Para tanto, suspensões de calos de cenoura (Daucus carota var. sativus) foram expostas a 100 μg/L de 2,4-dibromofenol por 120 h em agitador a 130 rpm e 26 °C. O 2,4-dibromofenol foi escolhido devido à sua atividade endócrina disruptiva13 e ampla ocorrência no solo14. Os metabólitos foram extraídos e analisados por espectrometria de massas de alta resolução. O protocolo aqui proposto pode investigar o metabolismo in planta de outros tipos de compostos orgânicos que podem ser ionizados.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2,4-diclorofenoxiacético</td><td>WAKO</td><td>1 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>20% H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>10011218-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP, >99%</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP-d4</td><td>Pointe-Claire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-benzilaminopurina</td><td>WAKO</td><td>0,5 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>1269101-500ML</td><td></td></tr><tr><td>7890A-5975&nbsp; cromatografia gasosa</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQULTY ultra-performance&nbsp; cromatografia líquida</td><td>Frascos</td> de vidro âmbar Waters <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de clima artificial</td><td>Ningbo DongNan Lab Equipment Co., LTD</td><td>RDN-1000A-4</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaves</td><td>STIK</td><td>MJ-Series</td><td></td></tr><tr><td>C18 coluna</td><td>ACQUITY UPLC BEH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna capilar DB-5MS</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40071190-4L</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>SCIENTZ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triturador de tecidos de alto rendimento</td><td>SCIENTZ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr> Espectrômetro de massa <tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicrOTOF-QII</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>MS1922801-4L</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog medium</td><td>HOPEBIO</td><td>HB8469-7</td><td></td></tr><tr><td>N-hexano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H109658-4L</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de sopro de nitrogênio&nbsp;</td><td>Isômeros AOSHENG</td><td>MD200-2</td><td></td></tr><tr><td>NP, >99%</td> <td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartuchos Oasis HLB</td><td>Waters</td><td>60 mg / 3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Pesquisa mais</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>100-1000 e micro; L</td></tr><tr><td>Sementes de cenoura do dedo mindinho (Daucus carota var. sativus)&nbsp;</td><td>Shouguang Seed Industry Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitação&nbsp; Incubadoras</td><td>Shanghai bluepard instruments Co., ltd.</td><td>THZ-98AB</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de fase sólida</td><td>AUTO SCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de ultrassom</td><td>ZKI</td><td>UC-6</td><td></td></tr><tr><td>Bancada ultra-limpa esterilizada por UV</td><td>AIRTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elucidando o metabolismo do 2,4-dibromofenol em plantas

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

As culturas podem ser extensivamente expostas a poluentes orgânicos, uma vez que o solo é um importante sumidouro de poluentes descartados no meio ambiente. Isso cria exposição humana potencial através do consumo de alimentos acumulados por poluentes. A elucidação da absorção e metabolismo de xenobióticos em culturas é essencial para a avaliação do risco de exposição dietética em humanos. No entanto, para tais experimentos, o uso de plantas intactas requer experimentos de longo prazo e protocolos complexos de preparação de amostras que podem ser afetados por vários fatores. Culturas de calos vegetais combinadas com espectrometria de massas de alta resolução (HRMS) podem fornecer uma solução para a identificação precisa e econômica de metabólitos de xenobióticos em plantas, pois pode evitar a interferência do microambiente microbiano ou fúngico, encurtar a duração do tratamento e simplificar o efeito de matriz de plantas intactas. O 2,4-dibromofenol, um retardante de chama típico e desregulador endócrino, foi escolhido como substância modelo devido à sua ampla ocorrência no solo e ao seu potencial de absorção pelas plantas. Neste trabalho, calos vegetais foram gerados a partir de sementes de assepsia e expostos a meio de cultura estéril contendo 2,4-dibromofenol. Os resultados mostraram que oito metabólitos do 2,4-dibromofenol foram identificados nos tecidos do calo vegetal após 120 h de incubação. Isso indica que o 2,4-dibromofenol foi rapidamente metabolizado nos tecidos do calo vegetal. Assim, a plataforma de cultura de calos vegetais é um método eficaz para avaliar a absorção e o metabolismo de xenobióticos em plantas.

As etapas do protocolo estão representadas na Figura 1. Seguindo o protocolo, comparamos o cromatograma do extrato de calo de cenoura do tratamento com 2,4-dibromofenol com os controles, e encontramos oito picos distintos que estão presentes no tratamento com 2,4-dibromofenol, mas ausentes nos controles (Figura 2). Isso indica que um total de oito metabólitos de 2,4-dibromofenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 e M187) foram detectados com sucesso no ca...

O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para a identificação de metabólitos do 2,4-dibromofenol em plantas.

Elucidando o metabolismo do 2,4-dibromofenol em plantas

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

A cultura de calos vegetais fornece uma solução para a avaliação precisa, eficiente e rápida da degradação metabólica de xenobióticos em plantas. A cultura do calo vegetal pode excluir a interferência do microbioma ou fúngica e a degradação fotoquímica, simplificar o efeito da matriz de plantas intactas, padronizar as condições de cultivo, encurtar a duração do tratamento e exigir menor esforço experimental. O método aqui proposto pode fornecer informações sobre o comportamento de absorção e mecanismos metabólicos de diferentes poluentes orgânicos em culturas e são úteis para esforços de avaliação de risco ambiental.Para começar, autoclave todos os equipamentos e realize todas as operações em uma bancada de trabalho ultra limpa esterilizada por UV. Esterilizar a superfície vernalizada das sementes com etanol 75% por 20 minutos. Enxágue-os com água deionizada estéril três vezes e novamente esterilize-os com peróxido de hidrogênio a 20% por 20 minutos.Após seis vezes lavar as sementes com água deionizada esterilizada, germinar assepticamente em meio de Murashige e Skoog autoclavado, livre de hormônios, pH 5,8, contendo gel de ágar 1% e incubar a 26 graus Celsius com fotoperíodo de 16

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição da lignina polifenólicos.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

Este manuscrito descreve como as taxas de metabolismo do herbicida podem ser efetivamente quantificadas com folhas excisadas de uma erva daninha dicotiledônea, reduzindo assim a variabilidade e removendo quaisquer possíveis efeitos de confusão da absorção ou translocação do herbicida normalmente observados em ensaios de plantas inteiras.

Medindo Taxas de Herbicida Metabolismo em Dicot Weeds com um ensaio extirpado Folha

Os poliésteres lipídicos constituem os componentes estruturais de duas modificações da parede celular, a cutícula da planta e as barreiras de difusão contendo suberina. Neste vídeo, descrevemos um método para despolimerizar a cutina de folhas inteiras deslipidadas. O método pode ser aplicado para investigar mutantes comprometidos na biossíntese de cutina ou suberina.

Isolamento e composicional Análise da cutícula vegetal lipídicas poliéster Monómeros

Os protocolos descritos aqui facilitam a investigação conveniente das respostas bacterianas do etileno utilizando ácido 2-cloroetilfosfônico (CEPA).  O etileno é produzido in situ através da decomposição do CEPA em um meio de crescimento bacteriano aquoso, contornando a necessidade de gás etileno puro.

Utilizando o composto libertador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico, como uma ferramenta para estudar a resposta do etileno em bactérias

Este trabalho apresenta um protocolo para o estabelecimento de uma cultura de suspensão celular derivada de folhas de chá (Camellia sinensis L.) que podem ser utilizadas para estudar o metabolismo de compostos externos que podem ser tomados por toda a planta, como inseticidas.

Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

Este método usa imagens de espectrometria de massa (MSI) para entender processos metabólicos nas folhas de S. alba quando expostos a xenobióticos. O método permite a localização espacial de compostos de interesse e seus metabólitos previstos dentro de tecidos específicos e intactos.

Investigação do metabolismo xenobióticos em folhas de Salix alba via Imagem de Espectrometria de Massa

Apresentamos o processo de isolamento, propagação e caracterização de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos de habitats aquáticos. O protocolo descreve o isolamento bacteriano, a identificação pelo método 16S rRNA e o teste de seu potencial degradador de hidrocarbonetos. Este artigo ajudará os pesquisadores na caracterização da biodiversidade microbiana em amostras ambientais e, especificamente, na triagem de micróbios com potencial de biorremediação.

Isolamento, Propagação e Identificação de Espécies Bacterianas com Propriedades Metabolizadoras de Hidrocarbonetos de Habitats Aquáticos

A secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo descreve como avaliar o impacto de xenobióticos na alfafa através de análise metabolômica não direcionada.

Coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudo do impacto do ftalato de di(2-etilhexil) na produção de metabólitos

O protocolo descreve um novo método para avaliar a citotoxicidade integral de metabólitos de pesticidas triazólicos em plantas.

Avaliação da citotoxicidade de metabólitos de pesticidas triazólicos típicos em plantas

As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão.

Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Em Plantas de tabaco

Aprenda a identificar metabolitos de 2,4-dibromofenol em plantas usando cultura de calos vegetais. Este método simplifica a avaliação da degradação metabólica de xenobióticos com menos interferências ambientais.

Elucidando o metabolismo do 2,4-dibromofenol em plantas

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