Vascularização Eficiente de Organoides Renais através do Transplante Intracelomico em Embriões de Galinha

Os organoides renais cultivados in vitro permanecem imaturos, limitando sua aplicabilidade. E esse método de transplante intracelômico induz a vascularização e aumenta a maturação dos organoides. O procedimento é muito eficiente, permitindo o transplante e análise de grande número de organoides em um experimento.

Depois de preparar organoides renais derivados do HISC e incubar os ovos fertilizados da leghorn, crie uma janela na casca do ovo no terceiro dia de incubação. Coloque um pequeno pedaço de fita transparente na ponta pontiaguda do ovo. Faça um pequeno orifício na casca do ovo no meio da fita transparente batendo com a ponta afiada de uma tesoura dissecante.

Em seguida, insira uma agulha de calibre 19 em uma seringa de cinco mililitros no orifício em um ângulo de 45 graus. Aspirar dois a três mililitros de albumina do ovo para abaixar o embrião dentro do ovo. Esconda o orifício com um segundo pedaço de fita transparente e, em seguida, coloque um pedaço grande de fita transparente no lápis marcado para cima do lado virado para cima do ovo.

Faça um buraco na casca do ovo no meio da fita transparente batendo com a ponta afiada de uma tesoura dissecante. Corte uma pequena janela circular na casca do ovo deste orifício usando uma tesoura de dissecação curva. Olhe através desta janela para localizar o embrião.

Em seguida, amplie a janela para otimizar o acesso ao embrião. Remova todos os pedaços grandes de casca de ovo que possam ter caído em cima do embrião usando fórceps. Remova pedaços menores colocando algumas gotas de DPBS com cálcio e magnésio no embrião com uma pipeta de transferência plástica e, em seguida, aspirando o DPBS com a casca do ovo na pipeta.

Usando uma pipeta de transferência de plástico, adicione três gotas de DPBS, suplementado com 0,5% de estreptomicina de penicilina ao ovo. Sele cuidadosamente a janela com um pedaço grande de fita transparente antes de colocar o ovo de volta na incubadora até o quarto dia de incubação. Corte a fita da janela com uma tesoura de dissecação curva.

Coloque o ovo sob um microscópio dissecante em um suporte de borracha ou caixa de ovo. O embrião de galinha está agora na Etapa 23 a 24 de Hamburger-Hamilton e deitado do lado esquerdo com o lado direito voltado para o espectador. Localizar a asa direita e o broto da perna do embrião, pois o celoma será avaliado entre esses dois brotos de membros.

Na área entre a asa direita e o broto da perna, crie uma abertura consecutivamente na membrana vitelina, no córion e no âmnio, segurando-os com dois pares de pinças dissecantes e puxando-os suavemente em direções opostas. Verifique se há acesso desobstruído à cavidade celômica. Segure suavemente a borda da parede do corpo entre a asa e o botão do membro com um par de pinças dissecantes e puxe-o levemente em direção ao espectador.

A cavidade celômica deve ser claramente visível. Insira cuidadosamente um instrumento contundente, mas fino, na cavidade celômica. Coloque metade de um organoide dentro do ovo em cima do alantois usando uma dura-máter.

Usando pinças dissecantes, segure cuidadosamente a borda da parede do corpo e puxe-a levemente em direção ao espectador para tornar visível a abertura para o coelum. Mova suavemente o organoide em direção e através da abertura na parede do corpo para o celo com um fio de tungstênio rombo e um suporte de microbisturi. Empurre o organoide ligeiramente cranialmente para aloja-lo dentro do coelum.

Agora é visível logo atrás do botão da asa. Adicione três gotas de DPBS ao ovo usando uma pipeta de transferência de plástico. Sele cuidadosamente a janela com um pedaço grande de fita transparente antes de colocar o ovo de volta na incubadora até o 12º dia de incubação.

Corte a fita da janela com uma tesoura de dissecação curva. Coloque o ovo sob um microscópio dissecante em um suporte de borracha. Avaliar a vasculatura e localizar as veias, que podem ser distinguidas das artérias por sua cor vermelha ligeiramente mais brilhante.

Para melhorar o acesso à vasculatura, amplie cuidadosamente a janela, cortando-a com tesoura dissecante curva. Depois de selecionar a veia, insira a ponta da agulha microcapilar na veia em um ângulo de zero a 20 graus. Certifique-se de que a agulha está na veia, movendo suavemente a ponta de um lado para o outro.

Sopre suave e firmemente no sistema de injeção para injetar a lente culinaris aglutinina. E coloque o ovo de volta na incubadora por 10 minutos para deixá-lo circular. Coloque o ovo em um suporte de borracha no banco.

Em seguida, corte as membranas que envolvem o embrião com uma tesoura dissecante curva. Retire o embrião do ovo com uma colher perfurada e decapite imediatamente o embrião usando uma tesoura. Sob o microscópio de dissecção, coloque o corpo do embrião em uma placa de Petri.

Coloque o embrião de costas na placa de Petri e espalhe os membros. Abra cuidadosamente a parede abdominal do embrião ao longo do eixo longitudinal usando pinças. Localize o organoide dentro do embrião.

O organoide mais frequentemente fica aderido ao lobo hepático direito, seja na ponta da criança ou cranialmente, logo abaixo da caixa torácica. Então, é aconselhável começar olhando para esses locais. Uma vez localizado o organoide, retire-o do embrião cortando-o com micro tesoura.

Coloque o organoide no tecido da galinha que está inevitavelmente ligado a ele em uma placa de Petri sob o microscópio dissecante. Remova o máximo possível de tecido de frango com uma lâmina de barbear de aço inoxidável de dois gumes. Imagens de imunofluorescência de um organoide renal não transplantado e de um organoide renal transplantado contêm estruturas glomerulares e tubulares.

Nos organoides não transplantados, algumas células endoteliais humanas estão presentes. No organoide transplantado, uma rede vascular perfundida é visível em todo o organoide. Imagens ampliadas das áreas encaixotadas demonstram os três tipos de células endoteliais que podem ser distinguidas em organoides transplantados: células endoteliais humanas perfundidas, células endoteliais humanas não perfundidas e células endoteliais derivadas de frango perfundidas.

Nos organoides não transplantados, as células endoteliais circundam as estruturas glomerulares, mas não as invadem. Entretanto, nos organoides transplantados, as estruturas glomerulares são vascularizadas por capilares perfundidos. Os organoides transplantados podem ser analisados por diferentes técnicas, dependendo do objetivo do experimento.

A comparação direta com controles não transplantados pode fornecer informações sobre o processo de vascularização e maturação.