Name: Uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a avaliar a atividade locomotora em Drosophila usando software de código aberto Fiji para análise de vídeo. Este método de baixo custo permite rastrear movimentos de adultos e larvas, quantificando velocidade e distância para estudos de neurociência e comportamento.

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Este trabalho foi apoiado por um fundo de lançamento especial da Universidade Soochow e da Fundação Nacional de Ciência da China (NSFC) (82171414). Agradecemos aos membros do laboratório do Prof. Chunfeng Liu por sua discussão e comentários.

Foram utilizadas 1118 moscas adultas W 1118 e larvas de terceiro ínstar para o presente estudo.
1. Preparação experimental
NOTA: Uma arena de campo aberto para rastreamento de locomoção de Drosophila é feita com sílica gel incolor e inodora.
<ol><li>Misture o reagente A e o reagente B na proporção de 1:10, de acordo com as instruções do fabricante para o kit de sílica (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que o bicarbonato de sódio é adicionado à mistura mexendo até que a cor mude para branco. Transfira a mistura para uma placa de Petri limpa e coloque-a em estufa a 40 °C para secagem por 48 h.</li>
	<li>Configure a câmera HD (consulte Tabela de Materiais) em um tripé, ajustando-a para que a lente da câmera fique perpendicular à superfície da arena de sílica. Ajustando a distância focal e as aberturas da câmera, certifique-se de que a câmera esteja focada na superfície da sílica e que a tela esteja adequadamente iluminada. O arranjo experimental está ilustrado na Figura 1.</li>
	<li>Transfira uma mosca para a arena de campo aberto para gravar um vídeo contínuo de pelo menos 61 s. NOTA: Considerando a natureza lenta das larvas, recomenda-se um tempo de gravação de vídeo de mais de 10 min.<ol><li>Abra o vídeo com Fiji, arraste a barra de progresso para o quadro inicial e aprove tacitamente. Escolha todo o corpo da mosca usando a ferramenta "seleção à mão livre" (Figura 2B,C).</li>
		<li>Clique na imagem > ajustar > brilho e contraste para ajustar o balanço de branco até que o valor de cinza da área selecionada se aproxime do plano de fundo amplo (Figura 2D-F). NOTA: A homogeneização de fundo do primeiro quadro permite que o software distinga o plano de fundo sem nenhum objeto e crie um contraste quando uma mosca está presente, permitindo assim que o software rastreiá-lo.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar todo o experimento em um ambiente de teste definido para 25 °C e 60% de umidade relativa, em uma área silenciosa e desprovida de exposição à luz brilhante.</li>
</ol>2. Gravação e pré-processamento de vídeo
<ol><li>Após um curto período de anestesia usando 95% de dióxido de carbono (CO2), transfira uma mosca para a arena aberta e pressione o botão de gravação no aplicativo da câmera para iniciar a gravação de vídeo. NOTA: Para minimizar o efeito do anestésico na locomoção, permita que as moscas se recuperem por 10 min antes de iniciar a gravação do vídeo. A anestesia por resfriamento também é recomendada.<ol><li>Assim que as moscas se recuperarem da anestesia, coloque o prato de arena contendo a mosca sob a câmera e agite a placa rapidamente de um lado para o outro para garantir que a mosca esteja em movimento quando a gravação começar.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a conclusão da gravação, pressione o botão de parada para encerrar a gravação de vídeo. NOTA: Certifique-se de que o tempo de gravação de vídeo exceda ligeiramente o tempo de rastreamento de destino por uma pequena margem. Além disso, para melhorar a eficiência experimental, é possível rastrear várias moscas espontaneamente. Isso depende da resolução da câmera para permitir um corte de vídeo de alta qualidade.</li>
	<li>Converta os vídeos gravados em formato AVI com codificação MJPEG, para que possam ser abertos e analisados usando Fiji. Enquanto isso, defina a taxa de quadros por segundo (fps) do vídeo para 15 fps para moscas adultas e 12 fps para larvas.</li>
</ol>3. Análise de vídeo
<ol><li>Abra o vídeo que foi transformado com "use virtual stack" e "convert to grayscale", duas opções na janela pop-up ao abrir o vídeo com Fiji (Figura 2A).</li>
	<li>Faça um primeiro quadro em branco, como mencionado acima.</li>
	<li>Obtenha uma janela de processamento usando a ferramenta "set active image" do plugin AnimalTracker e crie uma área de rastreamento que circunda a arena na janela de vídeo original usando a ferramenta "oval" (Figura 3A).</li>
	<li>Defina os filtros (Figura 3A,3) e os parâmetros dos dois filtros (Figura 4A-G) para o primeiro quadro em branco na janela de processamento. Em seguida, selecione o próximo quadro na janela de vídeo original e escolha a superfície filtrada da janela de processamento (Figura 5A-C). NOTA: A etapa de filtragem serve para diminuir o ruído da imagem e/ou remover o fundo, tornando assim mais simples separar o primeiro plano do plano de fundo na binarização dos quadros.</li>
	<li>Uma vez selecionada uma janela de processamento filtrada, gire a mosca rastreada com um perfil vermelho coberto na janela de processamento usando a ferramenta "definir limite" (Figura 3A,4, Figura 5D-E e Figura 6A).</li>
	<li>Use o "set blob-detector" para permitir que o computador reconheça a mosca com um perfil vermelho coberto na janela de processamento (Figura 3A,5 e Figura 6B).</li>
	<li>Defina o quadro 901 como o último quadro para a mosca adulta, calculado pela duração da gravação do vídeo e fps (Figura 3A,6, Figura 6C). NOTA: O seguinte experimento com larvas foi rastreado por 10 min, portanto, o quadro 7200 é definido como o último quadro.</li>
	<li>Use a ferramenta "show blobs" para apresentar um retângulo de rastreamento na janela de vídeo original (Figura 3A,7 e Figura 6D,E). Em seguida, inicie o rastreamento e exporte o arquivo de rastreamento após a conclusão do monitoramento (Figura 3A,8,9 e Figura 7A,B).</li>
</ol>4. Análise de arquivos de rastreamento
<ol><li>Carregue os arquivos de faixa e zona usando o plug-in Animal tracker > Tracking analyzer (Figura 8A).</li>
	<li>Selecione o índice desejado usando as configurações de zona e altere as configurações de parâmetro (Figura 8). Calcule o tempo do intervalo de quadros usando a taxa de quadros. Observação : nessa condição, a taxa de quadros é de 15 fps e o intervalo de quadros é de aproximadamente 0,067 s, que é a configuração padrão (Figura 8D).</li>
	<li>Produzir os gráficos de análise quantitativa utilizando o software de planilhas eletrônicas e o GraphPad Prism após serem analisados no analisador de rastreamento (Figura 9).</li>
</ol>5. Análise por quadro
<ol><li>Execute a análise de velocidade por intervalo de quadros. Analise o arquivo de trilha sem Fiji se uma pesquisa mais detalhada for necessária.<ol><li>Abra o arquivo de controle, copie todas as coordenadas para o Microsoft Office Excel e divida as células usando a chave de espaço. Observação : por exemplo, uma vez que o arquivo foi dividido em colunas "C" e "D", a velocidade de Drosophila por intervalo de quadro é calculada pela fórmula SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2), que é mostrada na coluna "E" (Figura 10A). Os dados na coluna "E" indicam o número de pixels que a mosca moveu entre dois quadros, com o primeiro quadro não sendo considerado. Selecione todos os resultados calculados e insira um gráfico de linhas para exibir uma velocidade de movimento de voo intuitiva por intervalo de quadros, com um pico no gráfico de linhas (Figura 10B).</li>
	</ol></li>
	<li>Calcule o tempo de imobilidade por intervalo de quadros. Depois que o arquivo tiver sido dividido em colunas "C" e "D", calcule o status de imobilidade de Drosophila por intervalo de quadros usando a fórmula IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), que é mostrada na coluna "E". (Figura 10C). NOTA: Ao contrário da análise de velocidade, os resultados do primeiro quadro foram definidos. As moscas que se moviam menos de 20 pixels foram consideradas imóveis e registradas como "0" na coluna "E".<ol><li>Selecione todos os resultados calculados e insira um gráfico de colunas para exibir visualmente o tempo de imobilidade pela margem de todo o gráfico de colunas (Figura 10D).</li>
	</ol></li>
	<li>Certifique-se de que o ângulo de direção mude. NOTA: A análise de mudança de ângulo de direção representa a escolha de direção das moscas. Uma vez que o arquivo foi dividido em colunas "C" e "D", o ângulo de mudança de direção é calculado pela fórmula ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2)) *(SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), que é apresentado na coluna "E" (Figura 10E). Os resultados calculados indicam o ângulo entre três coordenadas.<ol><li>Selecione todos os resultados calculados e insira um diagrama de dispersão para ilustrar o ângulo de mudança de direção do movimento das moscas (Figura 10F).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ham, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+UCHL1+rescues+the+defects+related+to+Parkinson%27s+disease+by+suppressing+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis.</a> Science Advances. 7 (28), (2021).</li>
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<li>Rothenfluh, A., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs%2C+files%2C+and+videotape%3A+the+effects+of+ethanol+and+cocaine+on+Drosophila+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).</li>
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<li>Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%82%AC100+lab%3A+A+3D-printable+open-source+platform+for+fluorescence+microscopy%2C+optogenetics%2C+and+accurate+temperature+control+during+behaviour+of+zebrafish%2C+Drosophila%2C+and+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 15 (7), e2002702(2017).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+the+behavior+of+Drosophila+melanogaster+for+toxicity+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study.</a> Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%3A+their+ability+to+reproduce+the+features+of+clinical+disease+and+model+gene-environment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions.</a> Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).</li>
<li>Coulom, H., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+rotenone+models+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).</li>
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<li>Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnimalTracker%3A+an+ImageJ-based+tracking+API+to+create+a+customized+behaviour+analyser+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program.</a> Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).</li>
<li>Qu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EasyFlyTracker%3A+a+simple+video+tracking+Python+package+for+analyzing+adult+Drosophila+locomotor+and+sleep+activity+to+facilitate+revealing+the+effect+of+psychiatric+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665(2022).</li>
<li>Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+of+Drosophila+movement+behaviour+assays+using+computer+vision+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Innovative+Approaches+in+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python.</a> International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Projetamos um método, baseado no material de código aberto AnimalTracker API compatível com o programa de processamento de imagens de Fiji, que pode permitir que os pesquisadores avaliem sistematicamente a atividade locomotora rastreando larvas adultas e individuais. O AnimalTracke é uma ferramenta escrita em Java que pode ser facilmente integrada a bancos de dados existentes ou outras ferramentas para facilitar a análise do comportamento de rastreamento de animais projetado por aplicativos<sup class="x...

Drosophila melanogaster fornece um excelente organismo modelo para investigar funções celulares e moleculares em modelos de doenças neuronais criadas por modificação gênica1, tratamento medicamentoso2 e senescência3. A alta conservação de vias biológicas, propriedades físicas e genes homólogos associados a doenças entre humanos e Drosophila torna a mosca-da-fruta uma mimética ideal desde o nível molecular até o comportamental4. Em muitos modelos de doenças, a deficiência comportamental é um índice importante, fornecendo um modelo útil para várias neuropatias humanas 5,6. Atualmente, a drosófila é utilizada no estudo de múltiplas doenças humanas, do neurodesenvolvimento e de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica7,8. A detecção da habilidade motora dos modelos de doença é crucial para a compreensão do progresso patogênico e pode fornecer uma correlação fenotípica com os mecanismos moleculares subjacentes ao processo da doença.
Recentemente, ferramentas de software disponíveis comercialmente e programas de baixo custo têm sido desenvolvidos para estratégias de detecção locomotora de Drosophila, tais como testes de alto rendimento em moscas agrupadas9,10 e mensuração da locomoção em tempo real11,12. Uma dessas abordagens convencionais é a geotáxi negativa interativa rápida (RING), também chamada de ensaio de escalada, que inclui múltiplos canais que permitem conter uma grande população de moscas com o mesmo sexo e idade, reduzindo a variação durante a coleta de dados 9,13. Outro método de pré-teste para análise do comportamento locomotor é o TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), um dispositivo que utiliza múltiplos feixes para detectar o movimento da atividade das moscas dentro de um tubo de vidro fino14. O aparelho registra a posição continuamente, o que representa a locomoção automatizada por meio do cálculo dos cruzamentos de feixes para estudar a atividade e o ritmo circadiano das moscas em um período maior de tempo15. Embora esses métodos tenham sido amplamente utilizados na análise de defeitos comportamentais em moscas-das-frutas para determinar mudanças na locomoção comportamental, eles sempre requerem equipamentos especiais de teste ou processos complexos de análise, e restringem sua aplicação em alguns modelos com um dispositivo limitado e simples. Estratégias baseadas em grupos de rastreamento animal para testar a Drosophila adulta, como o FlyGrAM11 e o ensaio da ilha de Drosophila 10, implementam o recrutamento social e o rastreamento individual em uma área predefinida. No entanto, a restrição social individual em áreas desafiadas pode ter um efeito negativo sobre as identificações nas imagens, causadas pela colisão ou sobreposição de moscas. Mesmo que alguns métodos baseados em materiais de código aberto, como TRex16, MARGO 12 e FlyPi17, tenham uma emergência, eles podem rastrear rapidamente as moscas com uso flexível em testes comportamentais. Essas abordagens de teste estão associadas a elaboradas instalações de aparelhos experimentais, requisitos especiais de software ou linguagens de computador profissionais. Para as larvas, a mensuração da distância total percorrida ao longo do número de linhas de borda da grade por unidade de tempo18, ou a contagem aproximada das contrações da parede corporal para os indivíduos manualmente19, são os métodos predominantes para avaliar sua capacidade locomotora. Devido à falta de precisão nos equipamentos ou dispositivos e métodos de análise, algumas locomoções comportamentais das larvas podem escapar à detecção, dificultando a avaliação precisa do movimento comportamental, especialmente o movimentofino15.
O presente método desenvolvido utiliza a interface de programação de aplicativos (API) AnimalTracker , compatível com o programa de processamento de imagens Fiji (ImageJ), para avaliar sistematicamente a atividade locomotora de moscas adultas e larvais, analisando seu comportamento de rastreamento a partir de vídeos de alta definição (HD). Fiji é um software de código aberto ImageJ distribuição que pode combinar bibliotecas de software robustas com inúmeras linguagens de script, resultando em prototipagem rápida de algoritmos de processamento de imagem, tornando-o popular entre os biólogos por suas capacidades de análise de imagem20. Na abordagem atual, a integração de Fiji na API AnimalTracker é explorada para desenvolver um ensaio comportamental exclusivo de Drosophila com inserção de algoritmo personalizado, e fornece uma etapa útil para documentação detalhada e tutoriais para apoiar capacidades analíticas robustas do comportamento locomotor (Figura 1). Para contornar a complicação de identificações objetivas nas imagens causadas pela colisão ou sobreposição de moscas, cada arena é restrita a hospedar apenas uma mosca. Ao avaliar a precisão do rastreamento da abordagem, implementou-se o rastreamento e quantificação dos movimentos locomotores de Drosophila que foram administrados com a droga tóxica rotenona, que geralmente é usada para modelos animais da doença de Parkinson, descobrindo o comprometimento da locomoção no tratamento medicamentoso21. Esta metodologia, que emprega software livre e de código aberto, não necessita de instrumentação de alto custo, podendo analisar de forma precisa e reprodutível a locomoção comportamental da Drosophila .

<table><tbody><tr><td>Rastreador de animais</td><td>Versão do Programa de Pesquisa do Cérebro Húngaro</td><td>: 1.7</td><td>Site oficial: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads</td></tr><tr><td>Software da câmera</td><td>Versão da Microsoft</td><td>: 2021.105.10.0</td><td>sistema Windows 10 integrado</td></tr><tr><td>Computador</td><td>DELL</td><td>Vostro-14-5480</td><td>um computador executando o sistema win 10 está disponível</td></tr><tr><td>Estação de trabalho de anestesia com dióxido de carbono Drosophila</td><td>Wu han Yihong technology</td><td>#YHDFPCO2-018</td><td>site oficial: http://www.yhkjwh.com/</td></tr> <tr><td>Fiji software</td><td>Fiji versão da equipe</td><td>: 1.53v</td><td>site oficial: https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>Formato de software de fábrica</td><td>Pcfreetime</td><td>versão: X64 5.4.5</td><td>site oficial: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html</td></tr><tr><td>Graph pad prisma</td><td>GraphPad Versão do software</td><td>: 8.0.2</td><td>site oficial: Câmera de</td></tr><tr><td>alta definição</td> https://www.graphpad-prism.cn <td>TTQ</td><td>Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)</td><td>site oficial: Software http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35</td></tr><tr><td>Office</td><td>Versão da Microsoft</td><td>: Office 2019</td><td>site oficial: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Bkman</td><td>Tamanho 110301003</td><td>: 60 mm</td></tr><tr><td>Gel de sílica</td><td>DOW</td><td>SYLGARD 184 Kit de elastômero de silicone</td><td>Misture bem de acordo com as instruções</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Macklin</td><td>#144-55-8</td><td>Misture bem com gel de sílica</td></tr></tbody></table>

uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em drosophila

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster é um organismo modelo ideal para o estudo de várias doenças devido à sua abundância de técnicas avançadas de manipulação genética e diversas características comportamentais. A identificação de deficiência comportamental em modelos animais é uma medida crucial da gravidade da doença, por exemplo, em doenças neurodegenerativas, onde os pacientes frequentemente experimentam prejuízos na função motora. No entanto, com a disponibilidade de vários sistemas para rastrear e avaliar déficits motores em modelos de moscas, como indivíduos tratados com drogas ou transgênicos, ainda falta um sistema econômico e fácil de usar para avaliação precisa de múltiplos ângulos. Desenvolve-se aqui um método baseado na interface de programação de aplicativos (API) AnimalTracker , compatível com o programa de processamento de imagens de Fiji, para avaliar sistematicamente as atividades de movimento de indivíduos adultos e larvais a partir de vídeos gravados, permitindo assim a análise de seu comportamento de rastreamento. Este método requer apenas uma câmera de alta definição e uma integração de hardware periférico de computador para gravar e analisar o comportamento, tornando-se uma abordagem acessível e eficaz para a triagem de modelos de moscas com deficiências comportamentais transgênicas ou ambientais. Exemplos de testes comportamentais usando moscas tratadas farmacologicamente são dados para mostrar como as técnicas podem detectar mudanças comportamentais em moscas adultas e larvas de maneira altamente repetível.

No presente estudo, déficits locomotores em moscas adultas e larvas de terceiro ínstar tratadas com rotenona foram examinados e comparados em sua atividade motora com a de uma mosca controle alimentada com o solvente dimetilsulfóxido (DMSO). Demonstrou-se que o tratamento com rotenona em Drosophila causa perda de neurônios dopaminérgicos no cérebro22 e leva a déficits locomotores significativos23. Como mostrado na Figura 11 e na Figura 12</stro...

O presente protocolo avalia a atividade locomotora de Drosophila rastreando e analisando o movimento de moscas em uma arena artesanal usando software de código aberto Fiji, compatível com plugins para segmentar pixels de cada quadro com base em gravação de vídeo de alta definição para calcular parâmetros de velocidade, distância, etc.

Uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

O método é baseado em software livre para avaliar sistematicamente as atividades motoras locais para o comportamento de rastreamento de moscas adultas e larvas a partir de vídeo gravado. Este método requer integração de dispositivos de baixo custo para registrar e analisar o comportamento, tornando-se uma abordagem acessível e eficaz para o rastreamento da locomoção de moscas. Essa tecnologia é empregada para identificar modificação comportamental em um modelo de mosca de doença humana com comprometimento de movimento local, mas não é adequada para o tratamento de doenças, deficiências ou dificuldades.É essencial limpar a janela de vídeo relevante durante o processo de análise, ou seja, a janela de vídeo original e a janela de processamento de vídeo. Para começar, misture o reagente A e o reagente B do kit de sílica na proporção de um para 10, de acordo com as instruções do fabricante, para preparar a arena de campo aberto para o rastreamento da locomoção da drosófila. Em seguida, ajuste a câmera HD em um tripé, ajustando-a para que a lente da câmera fique perpendicular à superfície da arena de sílica.Em seguida, abra o vídeo com Fiji. Arraste a barra de progresso para o quadro inicial e aprove tacitamente. Escolha todo o corpo da mosca usando a ferramenta de seleção à mão livre.Clique na imagem, ajuste e brilho e contraste para ajustar o balanço de branco até que o valor de cinza da área selecionada se aproxime do plano de fundo amplo. Transfira a mosca anestesiada para a arena de campo aberto. Assim que a mosca se recuperar da anestesia, coloque o prato de arena com a mosca sob a câmera e agite-o rapidamente de um lado para o outro para garantir que a mosca esteja em movimento quando a gravação começar.Pressione o botão de gravação no aplicativo da câmera para iniciar a gravação de vídeo. Após a conclusão da gravação, pressione o botão de parada para encerrar a gravação de vídeo. Converta os vídeos gravados em formato AVI com codificação pagã M-J para que possam ser abertos e analisados usando Fiji.Também defina os quadros por segundo do vídeo para 15 fps para moscas adultas e 12 fps para larvas. Para abrir o vídeo com Fiji, selecione as duas opções, use a pilha virtual e converta para escala de cinza, na janela pop-up. Obtenha uma janela de processamento usando a ferramenta de configuração de imagem ativa do plug-in de rastreador de animais e crie uma área de rastreamento que circunda a arena na janela de vídeo original, usando a ferramenta oval.Defina os filtros e os parâmetros dos dois filtros para o primeiro quadro em branco na janela de processamento. Em seguida, selecione o próximo quadro na janela de vídeo original e escolha a superfície filtrada da janela de processamento. Depois que uma janela de processamento filtrada for selecionada, use a ferramenta definir limite para girar o trato com um perfil vermelho, coberto na janela de processamento.Em seguida, use o detector de blob definido para permitir que o computador reconheça a mosca com um perfil vermelho, coberto na janela de processamento. Defina o último quadro para a mosca adulta ou larvas, conforme descrito no manuscrito do texto. Use a ferramenta mostrar blobs para apresentar um retângulo de rastreamento na janela de vídeo original.Inicie o rastreamento e exporte o arquivo de rastreamento após a conclusão do monitoramento. Carregue os arquivos de trilha e zona usando o plugin rastreador de animais e analisador de rastreamento. Selecione o índice desejado usando as configurações de zona e altere as configurações de parâmetro.Calcule o tempo do intervalo de quadros usando a taxa de quadros. Produzir os gráficos de análise quantitativa utilizando software de planilha eletrônica e prisma de gráfico pad, após serem analisados no analisador de rastreamento. Abra o arquivo de faixa.Copie todas as coordenadas para o Microsoft Office Excel e divida as células usando a tecla de espaço. Para calcular o tempo de imobilidade por intervalo de quadros, selecione todos os resultados calculados e insira um gráfico de colunas para exibir visualmente o tempo de imobilidade pela margem de todo o gráfico de colunas. Para ilustrar as mudanças no ângulo de direção, selecione todos os resultados calculados e insira um diagrama de dispersão.Moscas adultas e larvas de terceiro ínstar, tratadas com rotenona, apresentaram déficits locomotores significativos em comparação com moscas controle, alimentadas com solvente DMSO. A análise quantitativa do tratamento com rotenona em moscas adultas mostrou uma diminuição significativa na distância percorrida e na velocidade média. E um aumento significativo no tempo de imobilidade.Gráficos representativos mostraram menos picos para a velocidade de movimento por intervalo de quadros em moscas alimentadas com Rotenone em comparação com aquelas no controle, indicando a severidade do déficit de atividade locomotora. A coluna de imobilidade institucional de pixels movidos por quadro também mostrou movimento significativamente menor dentro de um minuto para moscas alimentadas com rotenona em comparação com moscas controle. Gráficos representativos ilustrando as mudanças de direção do ângulo de movimento em animais alimentados com rotenona e controle também revelaram alterações na direção escolhida pelas moscas.Resultados semelhantes foram observados para as larvas do terceiro ínstar. Os resultados revelaram que o movimento comportamental das larvas rastreadoras alimentadas com rotenona foi significativamente prejudicado em relação ao controle. A etapa mais crucial no processo de análise é formar o primeiro quadro em branco, pois evidencia se o software pode verificar de forma eficaz.Essa tecnologia pode permitir que os pesquisadores se aprofundem no mecanismo subjacente de múltiplos defeitos, como lesões nervosas ou musculares.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

O estudo do comportamento locomotor complexos...

De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Descrevemos os procedimentos para registrar os ritmos diários de atividade locomotora...

Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila</em

Drosophila melanogaster é um sistema modelo de genética e comportamentalmente tratável que tem sido usada para compreender a base molecular e celular de muitos processos biológicos importantes para mais de um século 1. Drosophila tem sido bem explorado para obter insights sobre a base genética do comportamento da mosca.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Este vídeo descreve um método simples para quantificar a locomoção da mosca e mostra o ensaio de escalada realizado. O ensaio de escalada com mosca é um teste geral da função motora que depende de uma resposta negativa da geotaxe.

Ensaio de escalada com mosca: um método para testar a locomoção geral em Drosophila melanogaster

Este vídeo descreve como rastrear moscas que andam livremente para avaliar sua capacidade geral de locomoção. O protocolo apresentado demonstra a configuração do ensaio e a análise de dados usando software de rastreamento de vídeo.

Rastreando moscas que andam livremente: um método para avaliar a locomoção em Drosophila

Este vídeo descreve o sistema de monitoramento de atividade (DAM) da Drosophila usado para rastrear a atividade locomotora. Os pesquisadores usam dados de atividade coletados do DAM para estudar os ritmos circadianos em moscas-das-frutas. O clipe de protocolo em destaque mostra como carregar moscas no dispositivo e registrar dados de atividade para experimentos circadianos.

drosófila Monitor de Atividade (DAM): Um Método para Medir a Atividade Locomotora em Moscas

Aqui nós descrevemos um método para a medição rápida e precisa do desempenho de vôo em Drosophila, permitindo seleção de alto rendimento.

Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster são úteis no estudo de manipulações genéticas ou ambientais que afetam comportamentos, como a atividade locomotora espontânea. Aqui nós descrevemos um protocolo que utiliza monitores com raios infravermelhos e software de análise de dados para quantificar a atividade locomotora espontânea.

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Usando uma webcam e uma combinação de programas de software livre e de baixo custo, os padrões de locomotivas em Drosophila melanogaster podem ser analisadas para detectar diferenças na velocidade, distância e tempo de várias atividades motoras.

Um método de baixo custo para análise de Apreensão-como atividade e movimento em<em&gt; Drosophila</em

Este relatório descreve um método para medir a atividade larval de Drosophila usando o TriKinetics Drosophila Activity Monitor. O dispositivo emprega feixes infravermelhos para detectar movimentos de até 16 animais individuais. Os dados podem ser analisados para representar parâmetros de movimento, incluindo taxas e posições dos animais dentro das câmaras de ensaio.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

O protocolo apresenta um método de alto rendimento e custo-benefício para avaliar a neurotoxicidade na mosca-da-fruta por meio da quantificação da disfunção locomotora como alternativa aos modelos tradicionais de mamíferos. Tem como objetivo avaliar os efeitos neurotóxicos de compostos farmacêuticos, agentes ambientais ou modificações genéticas usando um modelo sensível, reprodutível e eticamente favorável.

Análise comportamental da disfunção locomotora em Drosophila melanogaster como leitura de neurotoxicidade

Aprenda a avaliar a atividade locomotora em Drosophila usando software de código aberto Fiji para análise de vídeo. Este método de baixo custo permite rastrear movimentos de adultos e larvas, quantificando velocidade e distância para estudos de neurociência e comportamento.

Uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em Drosophila

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