Name: Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a medir taxas de lipólise em adipócitos murinos ex vivo e pré-adipócitos diferenciados in vitro usando amostragem serial e ensaios enzimáticos. Este método validado permite comparar condições basais e estimuladas.

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Este trabalho foi apoiado pelo US National Institutes of Health grant R01DK126944 para S.M.R.

O uso de todos os animais foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Weill Cornell Medical College da Cornell University.
1. Preparação de tampões e placas coletoras
<ol><li>Produzir albumina de soro bovino (BSA) a 5% dissolvendo 5 g de BSA em 100 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sem vermelho de fenol. Mexa suavemente o BSA para dissolver (agitar é contraproducente). Uma vez que a BSA esteja totalmente dissolvida, filtre-esterilize o meio com um filtro de 0,2 μm. Conservar o suporte BSA a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.</li>
	<li>Fazer concentrações de trabalho de meios de controle e estimulação. Meios de controle: 5% de mídia BSA com controle veicular. Meio de estimulação: meio BSA 5% com CL-316,243 μM 0,5 μM. Faça novos meios de estimulação para cada experimento.</li>
	<li>Aquecer o meio a ser utilizado a 37 °C. Rotule uma placa de 96 poços para coleta de mídia.</li>
</ol>2. Preparo da amostra
<ol><li>Realizar cultura celular conforme descrito abaixo. Realize todo o trabalho celular em uma capela de fumaça estéril para minimizar a contaminação externa.<ol><li>Isolar e diferenciar pré-adipócitos primários, como em73,74.<ol><li>Pré-adipócitos primários em placa de alta densidade, como 1 x 105 células/poço em placa de 24 poços em meio de cultura de 1 mL/poço (15% de soro fetal bovino (SFB) e 1x penicilina-estreptomicina-glutamina em DMEM/F12).</li>
			<li>Após as células atingirem 100% de confluência, diferenciar com 5 μM de dexametasona, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina, 1 μg/mL de insulina e 1 μM de tiazolidinediona (TZD) em meios de cultura por 3 dias. Em seguida, mude para o meio de cultura com 1 μg/mL de insulina por pelo menos 3 dias para crescer gotículas lipídicas. Utilizar 1 mL/poço de meio na placa de 24 poços.</li>
			<li>Troque o meio de cultura (1 ml/poço) com insulina a cada 2 ou 3 dias. As células podem ser mantidas em meio com insulina por até 2 semanas. Use apenas culturas em que as taxas de diferenciação são superiores a 90% e são semelhantes entre os grupos para este ensaio, pois a diferenciação reduzida pode ser mal interpretada como uma redução na taxa lipolítica.</li>
			<li>Cultivar as células em meio livre de insulina por 24 h antes da dosagem da lipólise. NOTA: A insulina na mídia mantém as gotículas lipídicas, mas também inibe a lipólise. A incubação sem insulina por 24 h permite a ativação lipolítica completa sem perda do volume lipídico das gotículas. Em alguns sistemas, o tempo de cultura sem insulina pode precisar ser encurtado ou prolongado.</li>
		</ol></li>
		<li>Lavar as células com DPBS uma vez para remover o soro residual dos meios de cultura. NOTA: Este protocolo não inclui a inanição de soro, que pode ativar a lipólise. A inanição de soro pode ser empregada a critério do pesquisador.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar cultura ex vivo conforme descrito abaixo.<ol><li>Prepare uma placa de 6 poços, com um poço para cada tecido a ser coletado de cada camundongo. Colocar 4 mL de DMEM à temperatura ambiente em cada poço a ser utilizado. NOTA: BSA na mídia de coleta não é necessário.</li>
		<li>Preparar uma placa de 48 poços para o ensaio de lipólise, com um orifício para cada repetição. Colocar 400 μL de DMEM à temperatura ambiente em cada poço a ser utilizado. Utilizar dois a quatro poços controle e dois a quatro poços estimulados por tecido por camundongo.</li>
		<li>Eutanásia do camundongo por luxação cervical sob anestesia, com um método secundário como pneumotórax bilateral. Utilizou-se um camundongo fêmea C57BL/6J, com 32 g de 7 meses de idade, alimentado com dieta hiperlipídica a 45% por 4 meses. NOTA: Este protocolo também pode ser usado para o sexo masculino, bem como outras cepas, dietas e idades.</li>
		<li>Borrifar com etanol a 70% e usar tesoura para fazer uma pequena incisão lateral (~ 1 cm) no centro da pele abdominal, afastar a pele apertando cada lado com polegar e indicador e dobrar a pele abdominal inferior para revelar os depósitos subcutâneos posteriores. Localizar e remover o linfonodo inguinal e dissecar o tecido adiposo inguinal imediatamente posterior ao linfonodo inguinal usando pinças.</li>
		<li>Para coletar o tecido adiposo gonadal, fazer uma incisão lateral e uma vertical no peritônio para acessar a cavidade peritoneal. Segure o coxim gorduroso gonadal com uma pinça e corte ao longo do útero (ou epidídimo para os machos) para remover o tecido adiposo gonadal. Coloque os depósitos coletados em um prato de 6 poços.</li>
		<li>Retire bem o tecido, coloque em um tapete de silicone e corte em pedaços de 5 a 7 mg com tesoura.</li>
		<li>Pesar 25 a 30 mg (cinco ou seis pedaços) para cada ensaio bem e colocar em uma placa de ensaio de 48 poços. Coloque o tecido em uma toalha limpa antes de pesar para remover qualquer meio. Pesar o barco de peso após a remoção do tecido e registrar o peso de qualquer resíduo deixado para trás. Limpe o barco de peso entre as amostras e re-tar, se necessário. Use um novo barco de peso para cada tecido.</li>
		<li>Depois de pesadas todas as amostras de tecido, colocar a placa de ensaio de 48 poços em uma incubadora de 37 °C e 10% de CO2 por 15 minutos.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ensaio de lipólise
<ol><li>Executar coleta de mídia. Realizar a transferência do meio e posterior coleta de amostras em um exaustor de fumaça estéril para minimizar a contaminação potencial de fontes externas.<ol><li>Em t = 0, remova o meio e adicione 400 μL por poço de controle ou meio de estimulação e coloque a placa em uma incubadora de 37 °C e 10% de CO2 . Para cultura de tecidos ex vivo , remover cuidadosamente o meio usando uma pipeta; A sucção nunca deve ser usada. NOTA: Alternativamente, prepare uma segunda placa com meios de controle e estimulação, e transfira os tecidos.</li>
		<li>Em t = 1, 2, 3 e 4 h, coletar 200 μL de meio, substituir por 200 μL do meio de controle ou estimulação apropriado e retornar a placa de ensaio à incubadora. Conservar a placa de recolha a 4 °C. Para determinar a capacidade de tamponamento FFA da mídia BSA, use uma coleta adicional em 24 h. NOTA: Os experimentos podem ser interrompidos aqui, e o meio coletado pode ser armazenado a -20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Ensaio colorimétrico de AGL
<ol><li>Aqueça os reagentes à temperatura ambiente e dissolva um frasco de reagente de cor A com um frasco de solvente A e um frasco de reagente de cor B com um frasco de solvente B. A partir da data de reconstituição, esses reagentes são melhor utilizados dentro de 1 semana. Descarte 1 mês após a reconstituição.</li>
	<li>Descongele e misture as amostras.</li>
	<li>Crie uma curva padrão FFA. A solução padrão é de 1 mM. Use o seguinte volume com os reagentes para a curva padrão: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (diluição 1:2), 10 μL (diluição 1:4), 10 μL (diluição 1:8) e 10 μL de água para a faixa máxima. Para baixos níveis de AGL, 10 μL de 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0,05 mM podem ser mais aplicáveis.</li>
	<li>Pipetar padrões e amostras em uma placa de ensaio de 96 poços. O volume de amostra recomendado é de 10 μL. Inclua três poços com o mesmo volume de meio BSA que as amostras para correção de fundo. NOTA: Se as concentrações da amostra se situarem fora do intervalo da curva padrão, repetir o ensaio, ajustando o volume da amostra para 2-25 μL.</li>
	<li>Adicionar 150 μL de reagente A a cada poço e misturar. Evite gerar bolhas. Estoure quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino. Incubar a placa de ensaio a 37 °C durante 5 min.</li>
	<li>Leia a absorbância da placa a 550 nm e 660 nm de referência (Leitura A).</li>
	<li>Adicionar 75 μL de reagente B a cada poço e misturar. Evite gerar bolhas. Estoure quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino. Incubar a placa de ensaio a 37 °C durante 5 min.</li>
	<li>Leia novamente a absorbância da placa a 550 nm e 660 nm de referência (Leitura B).</li>
</ol>5. Ensaio colorimétrico de glicerol
<ol><li>Reconstituir o reagente glicerol livre com 36 mL de água ultrapura e aclimatar-se à temperatura ambiente. Esses reagentes são melhor usados dentro de algumas semanas. Descarte 2 meses após a reconstituição.</li>
	<li>Descongele e misture as amostras.</li>
	<li>Crie uma curva padrão de glicerol fazendo uma diluição em série de sete pontos e 2 vezes da solução padrão de glicerol e um branco de água. NOTA: A curva padrão é relativamente linear até 25 μL de glicerol 2,8 mM, mas não linear em concentrações mais elevadas.</li>
	<li>Pipetar 25 μL cada um do padrão e amostras para a placa de ensaio de 96 poços. Inclua três poços com a mídia BSA para correção de fundo.</li>
	<li>Adicionar 175 μL de reagente de glicerol livre a cada poço e misturar. Evite gerar bolhas. Estoure quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino. Incubar a placa de ensaio a 37 °C durante 5 min.</li>
	<li>Leia a absorbância da placa a 540 nm.</li>
</ol>6. Cálculo da taxa lipolítica
<ol><li>Comece com valores de densidade óptica (OD). Para glicerol, use A540 OD valores diretamente. Calcular o DO do ensaio de AGL de acordo com a seguinte fórmula: OD = (Leitura B: A 550 - A 660) - (Leitura A: A550 - A660)</li>
	<li>Utilizar a curva padrão para calcular os níveis de AGL e glicerol nas amostras coletadas. Plotar os valores padrão OD no eixo y e, no eixo x, usar concentrações padrão em relação ao volume da amostra (ou seja, a concentração dos poços com 20 μL do padrão FFA 1 mM em uma placa com amostras de 10 μL é igual a 2 mM). Ajuste uma linha de tendência linear: y = mx + b</li>
	<li>Inspecione visualmente a curva padrão e remova quaisquer pontos fora da faixa linear do ensaio. Calcule as concentrações das amostras utilizando a equação: Concentração da amostra: x = (OD - b) ÷ m</li>
	<li>Ajustar e reensaiar amostras que estejam fora do intervalo de ensaio linear. Para obter a concentração final da amostra, subtraia a concentração dos poços de fundo contendo apenas meios BSA da concentração das amostras.</li>
	<li>Calcular os moles de AGL e glicerol produzidos por cada amostra em cada ponto de tempo, de acordo com a fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65106/65106eq01.jpg" style="margin: auto;"> onde C n = concentração no tempo t = n; Vt = volume total no poço; Vs = volume de coleta da amostra; e M, n = moles produzidos no tempo t = n (quando as concentrações estão em mM e os volumes estão em mL, o débito é μMol). Por exemplo, em vários momentos: M 1 = C1 × Vt M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs ou M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s</li>
	<li>Normalizar para o peso do tecido dividindo pelo peso do tecido para cada amostra em gramas para obter unidades de μmol/g. Para células cultivadas, os valores são apresentados como μmol/poço. Certifique-se de que o número de células e a eficiência da diferenciação sejam comparáveis de poço para poço. NOTA: Diferenças na eficiência de proliferação ou diferenciação complicarão a interpretação dos resultados e exigirão outro método de normalização (por exemplo, normalização para proteína; ver discussão).</li>
	<li>Calcular a inclinação do μmol/g produzido (eixo y) versus o tempo (eixo x) para cada amostra individualmente.<ol><li>Em uma planilha, isso pode ser feito usando a função =SLOPE(known_ys,known_xs). Em uma nova célula, digite "=SLOPE" (em seguida, use o cursor para realçar os valores de glicerol ou FFA da amostra em μmol/g e, em seguida, para realçar os valores de tempo correspondentes).</li>
		<li>Verifique a linearidade dos dados. Os valores de R2 são uma maneira rápida de determinar a linearidade das amostras. Em uma planilha, isso pode ser feito usando a função =RSQ(known_ys,known_xs), da mesma maneira descrita na etapa 6.7.1, mas a entrada inicial é =RSQ. Certifique-se de que os valores de R2 estejam &gt; 0,98; valores mais baixos indicam desvio da linearidade. Isso pode resultar de um erro de medição/amostragem ou perda de linearidade.<ol><li>Outra forma de testar a linearidade é realizar uma regressão linear para cada amostra e plotar os resíduos. Em um software de análise estatística, gere uma tabela XY com um único valor Y para cada ponto de tempo. Selecione Analisar &gt; regressão linear simples e selecione a caixa para Gráfico residual antes de pressionar OK. O gráfico residual aparecerá como um novo gráfico.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Use o FFA e a taxa de produção de glicerol (ou seja, inclinação [(μmol/g/h]) para cada amostra como um ponto de dados individual para realizar análise estatística e plotar valores se diferentes condições lipolíticas estiverem sendo comparadas. Se as taxas lipolíticas estiverem sendo comparadas entre genótipos, use duas ou três amostras por animal como réplicas técnicas e use a média para um ponto de dados por animal, de modo que o tamanho da amostra seja igual ao número de animais.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, fornecemos um protocolo básico para medir a taxa de lipólise em adipócitos e tecido adiposo ex vivo . Para quantificar a lipólise, é importante medir a taxa lipolítica na fase linear. Usamos uma técnica de amostragem seriada, onde uma grande fração de meios é coletada e substituída por meios frescos em intervalos regulares. Este método semiconservador permite a adição de BSA fresco com capacidade tamponante de AGL e retarda a inibição do feedback, estendendo a duração da lipólise linear. Este desenho exper...

Os nutrientes em excesso são armazenados no tecido adiposo branco na forma de triglicerídeos no núcleo lipídico neutro das gotículas lipídicas. Os estoques de triglicérides são mobilizados via lipólise, processo pelo qual as cadeias laterais de ácidos graxos são sequencialmente clivadas por lipase triglicérides do tecido adiposo (ATGL), lipase hormônio-sensível (HSL) e lipase monoglicerídica (MGL), resultando na liberação de ácidos graxos livres (AGL) e da espinha dorsal do glicerol 1,2. A lipólise é ativada pela sinalização de catecolaminas no tecido adiposo. Os terminais nervosos simpáticos liberam localmente catecolaminas, que se ligam aos receptores β-adrenérgicos na membrana plasmática dos adipócitos. Após a ligação do ligante, esses receptores acoplados à proteína G (GPCRs) ativam a adenilil ciclase via Gαs. A ativação subsequente da proteína quinase A (PKA) pelo AMPc resulta na regulação positiva tanto da ATGL quanto da HSL. A fosforilação da perilipina-1 pela PKA causa a dissociação da ABHD5 (também conhecida como CGI-58), que se liga e coativa a ATGL3. O PKA fosforila diretamente a HSL, promovendo sua translocação do citosol para a gota lipídica, onde a interação com a perilipina-1 fosforilada promove ainda mais sua atividade lipase 4,5,6,7. A terceira lipase envolvida na lipólise, a MGL, parece não ser regulada pela sinalização das catecolaminas8. É importante ressaltar que a síntese de triglicérides em adipócitos é mediada pela via de síntese lipídica do glicerol, que não envolve a formação de monoglicerídeos como intermediário; em vez disso, as glicerol-3-fosfato acilo transferases catalisam a formação de ácido lisofosfatídico, que é combinado com outro acil-CoA graxo para formar ácido fosfatídico e, em seguida, isomerizado em diglicerídeos antes da síntese final de triglicérides (Figura 1)9,10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65106/65106fig01.jpg"> Figura 1: Vias de lipólise e síntese lipídica do glicerol. Topo: Via lipolítica; enzimas mostradas em vermelho: lipase triglicerídica do tecido adiposo (ATGL), lipase sensível ao hormônio (HSL) e lipase monoglicerídica (MGL). Fundo: via de síntese lipídica do glicerol; enzimas mostradas em verde: diglicerídeos aciltransferase (DGAT), fosfatase do ácido fosfatídico (PAP), ácido lisofosfatídico aciltransferase (LPAT, também conhecido como LPAATs) e glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT). Lipídios: triglicerídeos (TG), diglicerídeos (DG), monoglicerídeos (MG), ácidos graxos livres (AGL), acil-CoA graxo (FA-CoA), ácido lisofosfatídico (LPA) e ácido fosfatídico (AP). Outros metabólitos: fosfato inorgânico (Pi) e glicerol 3-fosfato (G3P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65106/65106fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A adenosina extracelular é outro importante regulador da lipólise, atuando através de GPCRs acoplados a Gs e Gi para impactar a atividade da adenil ciclase. O receptor de adenosina predominante nos adipócitos, ADORA1, inibe a adenilil ciclase e, assim, a lipólise através da ativação de Gi12. Expressa em níveis mais baixos, e principalmente em adipócitos marrons, a ADORA2A ativa a lipólise via sinalizaçãode G s 13. ADORA1 afeta tanto a lipólise basal quanto a resposta aos agonistas adrenérgicos. O efeito da adenosina na lipólise pode ser controlado pela adição de adenosina desaminase para neutralizar a adenosina, assim como o agonista específico ADORA1 fenilisopropiladenosina14,15. A ativação hormonal de GPCRs acopladas a Gq também pode afetar a lipólise via ativação da fosfolipase C e da proteína quinase C16,17,18,19. Sinais inflamatórios também afetam as taxas lipolíticas. A ativação de TLR4 pelo LPS (e outras endotoxinas) aumenta a taxa lipolítica pela ativação da ERK, que fosforila perilipina-1 e HSL20. O TNF-α também ativa a lipólise via ativação de ERK e NF-κB, bem como downregulation transcricional da fosfodiesterase PDE-3B e CIDEC21,22,23. A IL-6 também tem sido associada ao aumento da lipólise dos adipócitos, especialmente no tecido adiposo mesentérico, cuja liberação de AGL afeta a esteatose hepática e a gliconeogênese24,25,26.
A lipólise é suprimida durante o estado alimentado pela insulina. AKT fosforila e ativa PDE-3B para suprimir a sinalização de AMPc e impedir a ativação de PKA27. A insulina também diminui transcricionalmente a ATGL28. A obesidade promove resistência às catecolaminas através de uma variedade de mecanismos, incluindo a diminuição da regulação dos receptores β-adrenérgicos nos adipócitos 29,30,31,32,33. Os adipócitos expressam os três receptores β-adrenérgicos (β-1, β-2 e β-3). Enquanto os receptores adrenérgicos β-1 e β-2 são expressos de forma ubíqua, o receptor adrenérgico β-3 é predominantemente expresso em adipócitos de camundongos34,35. A expressão de Adrb3 é induzida por C/EBPα durante a adipogênese36. O receptor adrenérgico β-3 é altamente expresso em adipócitos maduros. A ativação dos receptores adrenérgicos β-1 e β-2 é autolimitada devido à inibição por feedback pela β-arrestina37. A inibição por feedback do receptor adrenérgico β-3 é mediada por outras vias de sinalização, que reduzema expressão de Adrb33,38,39.
Numerosos compostos podem ser usados para ativar a lipólise dos adipócitos. As catecolaminas são os principais ativadores fisiológicos da lipólise. A noradrenalina (ou noradrenalina) e a epinefrina (ou adrenalina) ativam os três receptores β-adrenérgicos40. A noradrenalina e a adrenalina também afetam a lipólise via ativação da sinalização dos receptores α-adrenérgicos41. Os agonistas dos receptores β-adrenérgicos comumente usados incluem o isoproterenol, que é um agonista não seletivo dos receptores β-adrenérgicos, e os agonistas dos receptores adrenérgicos β-3 CL-316,243 e mirabegron42. Como os adipócitos expressam predominantemente o receptor adrenérgico β-3, utilizamos a CL-316,243 como exemplo. Sua especificidade para o receptor adrenérgico β-3 também o torna um ativador relativamente específico da sinalização de catecolaminas de adipócitos, que também pode ser usado com segurança in vivo. Note-se que a concentração comumente usada de 10 μM CL-316,243 em cultura celular é ordens de magnitude maior do que a dose de ~0,1 μM necessária para atingir uma resposta máxima33. Forskolin contorna o receptor adrenérgico, ativando diretamente adenilil ciclase e sinalização lipolítica a jusante. Existem muito mais ativadores, bem como supressores de lipólise. Ao selecionar um composto para estimular a lipólise, a especificidade do receptor e as vias de sinalização a jusante devem ser cuidadosamente consideradas dentro do planejamento experimental.
A taxa de lipólise no tecido adiposo branco é um importante fator metabólico que afeta a tolerância ao frio e a disponibilidade de nutrientes durante o jejum ou exercício43,44,45,46. O objetivo deste protocolo é medir a taxa de lipólise em adipócitos e tecido adiposo, o que facilitará o entendimento do metabolismo dos adipócitos e como ele pode afetar o fenótipo metabólico de vários modelos murinos. Para quantificar a taxa lipolítica, medimos a aparência dos produtos lipolíticos na mídia (i.e., AGL e glicerol). O método baseia-se na liberação de produtos lipolíticos do adipócito para o meio. Como os adipócitos brancos expressam baixos níveis de glicerol quinase, as taxas de recaptação do glicerol são baixas47. Por outro lado, a produção de AGL e glicerol por outras vias metabólicas que não a lipólise também deve ser considerada. Os adipócitos parecem expressar uma fosfatase com atividade contra o glicerol-3 fosfato, possibilitando a produção de glicerol a partir do glicerol-3-fosfato derivado da glicose48,49,50. A glicólise é uma fonte de glicerol-3-fosfato usado para reesterificação de AGL em adipócitos brancos. Quando os níveis de glicose são limitados, a gliceroneogênese requer outras fontes de carbono 3, como lactato e piruvato51. A canalização dos AGL liberados pela lipólise dentro da célula e seu destino metabólico é pouco compreendido; Os AGL liberados pela lipólise devem ser convertidos em acil-CoA graxo, antes de serem reesterificados ou submetidos à β-oxidação. Parece que os AGL liberados pela lipólise provavelmente saem da célula antes de serem retomados e convertidos em acil-CoA gorduroso 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . Os AGL podem ser sequestrados fora da célula pela albumina. É importante ressaltar que os AGL de cadeia longa são conhecidos por inibir a lipólise se não forem sequestrados pela albumina 63,64,65,66,67. Assim, a otimização da capacidade tampão dos AGL do meio durante o ensaio de lipólise é fundamental. O procedimento aqui descrito é semelhante aos métodos publicados anteriormente para medir a taxa lipolítica em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos e humanos 15,68,69,70,71. Esse protocolo difere pelo uso de amostragem seriada; Ao realizar amostragens seriadas, podemos validar internamente que a lipólise está sendo medida na fase linear e utilizar múltiplas medidas para calcular a taxa de lipólise, reduzindo assim o erro de medição para aumentar a confiança no valor final calculado. A desvantagem da amostragem seriada é que o ensaio requer mais tempo e reagentes; no entanto, o prazo mais longo reduz o impacto do erro de medição no erro padrão das estimativas da taxa. Além disso, esse protocolo mede tanto a liberação de AGL quanto a de glicerol e considera a relação AGL:liberação de glicerol com o objetivo de atingir uma relação de 3:1, como seria esperado a partir da lipólise completa e liberação de produtos lipolíticos na mídia72.

<table><tbody><tr><td>Placa tratada com cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Corning Inc</td><td>3527</td><td>Deve ser tratada com cultura de tecidos para diferenciação de adipócitos</td></tr><tr><td>Placa de fundo plano de 48 poços com tampa</td><td>Corning Inc</td><td>353078</td><td>Pode ser tratada com cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Placa de fundo plano de 6 poços com tampa</td><td>Corning Inc</td><td>353046</td><td>Pode ser tratada com cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Placa PCR de 96 poços</td><td>EUA sceintific</td><td>1402-9100</td><td>Qualquer placa PCR cônica de 0,2 mL será conveniente&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>FFA livre BSA, como A8806, também é comumente usado. O BSA não deve ter FFA detectável, também variações de lote para lote no BSA podem afetar a taxa observada de lipólise</td></tr><tr><td>CL-316,243</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5976</td><td>CAS #: 138908-40-4 disponível de outros fornecedores</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVH</td><td>CO2 deve idealmente ser definido como 10% para tecido adiposo, no entanto, 5% de CO2 também funcionará</td></tr><tr><td>DMEM, baixa glicose, sem vermelho de fenol</td><td>Thermofischer</td><td>11054020</td><td>Qualquer meio livre de vermelho de fenol deve funcionar, DMEM/F12, RPMI, mas deve conter capacidade tampão volátil, ou seja,</td></tr><tr><td>albumina de soro bovino livre de FFA</td> de biocarbonato <td>Equitech-Bio, Inc,&nbsp;</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Glicerol Livre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Solução Padrão de Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7793&nbsp;</td><td>Isso também pode ser feito diluindo o glicerol até a concentração desejada</td></tr><tr><td>HR Series NEFA Standard Solution</td><td>Fujifilm</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>HR Series NEFA-HR (2) Reagente de cor A</td><td>Fujifilm</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR Series NEFA-HR (2) Reagente de cor B</td><td>Fujifilm</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR Series NEFA-HR (2) Solvente A&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>Série HR NEFA-HR (2) Solvente B&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Microbiológica</td><td>Fischer Scientific</td><td>S28668</td><td>Qualquer incubadora a 37C pode ser usada</td></tr><tr><td>Placas Nunc MicroWell de 96 Poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>Qualquer placa de 96 poços opticamente transparente, de fundo plano funciona</td></tr><tr><td>Tapete de Bancada de Laboratório de Silicone</td><td>VWR</td><td>76045-300</td><td>A placa de vidro também pode ser usada. Superfícies absorventes não são recomendadas</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro/Leitor de Microplacas</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>SpectraMax i3x&nbsp;</td><td>Qualquer leitor de placas que possa ler em 540, 550 e 660 mm funcionará</td></tr><tr><td>V Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810531</td><td></td></tr><tr><td>WypAll X70 Wipers</td><td>Kimberly-Clark</td><td>41200</td><td>Qualquer toalha de papel de alta qualidade funcionará</td></tr></tbody></table>

mensuração da taxa de lipólise em tecido adiposo murino ex vivo e pré-adipócitos primários diferenciados in vitro

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Os adipócitos armazenam energia na forma de triglicerídeos em gotículas lipídicas. Essa energia pode ser mobilizada via lipólise, onde as cadeias laterais dos ácidos graxos são sequencialmente clivadas da espinha dorsal do glicerol, resultando na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Devido à baixa expressão de glicerol quinase em adipócitos brancos, as taxas de recaptação de glicerol são desprezíveis, enquanto a recaptação de ácidos graxos é ditada pela capacidade de ligação de ácidos graxos de componentes do meio, como a albumina. Tanto a liberação de glicerol quanto de ácidos graxos em meios pode ser quantificada por ensaios colorimétricos para determinar a taxa lipolítica. Medindo esses fatores em vários momentos, pode-se determinar a taxa linear de lipólise com alta confiança. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a mensuração da lipólise em adipócitos diferenciados in vitro e tecido adiposo ex vivo de camundongos. Este protocolo também pode ser otimizado para outras linhagens celulares de pré-adipócitos ou tecido adiposo de outros organismos; considerações e parâmetros de otimização são discutidos. Este protocolo foi projetado para ser útil na determinação e comparação da taxa de lipólise de adipócitos entre modelos e tratamentos em camundongos.

Medimos a taxa lipolítica basal e estimulada de adipócitos diferenciados in vitro. Os pré-adipócitos primários do tecido adiposo branco inguinal foram diferenciados em adipócitos pelo tratamento de células confluentes com 5 μM de dexametasona, 0,5 mM de IBMX, 1 μg/mL de insulina e 1 μM de troglitazona por 4 dias, seguidos por um tratamento adicional de 3 dias com 1 μg/mL de insulina. As células foram incubadas em meio sem insulina por 24 h antes do ensaio de lipólise. No tempo = 0h, as células foram lavadas uma ...

A lipólise de triglicerídeos em adipócitos é um importante processo metabólico que resulta na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para medir a lipólise basal e estimulada em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos.

Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Este protocolo detalha a determinação da taxa de lipólise dos adipócitos em cultura de adipócitos ou tecido adiposo ex vivo, permitindo a comparação das taxas lipolíticas entre modelos ou tratamentos murinos. Esse protocolo utiliza amostragem seriada, o que permite validar internamente que a lipólise está sendo medida na fase linear e reduz o erro de medição. Com otimização, esse protocolo pode ser usado para medir lipólise em tecido adiposo marrom, tecido adiposo de outros organismos ou linhagens de células adipogênicas.Os tecidos ex vivo devem ser picados em pequenos pedaços de tamanho e forma consistentes para permitir o sequestro dos ácidos gordos livres libertados pela BSA nos meios. Para começar, prepare o meio BSA a 5% dissolvendo cinco gramas de Albumina de Soro Bovino, ou BSA, em 100 mililitros de Meio de Águia Modificado de Dulbecco, ou DMEM, sem vermelho fenol. Mexa suavemente a solução para dissolver a BSA.Em seguida, prepare concentrações de trabalho de meios de controle e estimulação. Antes de usar, aqueça o meio a 37 graus Celsius. Rotule uma placa de 96 poços para coleta de mídia.Dentro de uma capela de fumaça estéril, realizar isolamento e diferenciação de pré-adip

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JoVE Journal

Biology

Biologia

O tecido adiposo (TA) pode influenciar a homeostase de todo o corpo, portanto, entender os mecanismos moleculares de diferenciação e função dos adipócitos é importante. Fornecemos um protocolo para obter novos insights sobre esses processos, analisando a homeostase, diferenciação e exposição à hipóxia dos adipócitos como um modelo para a apoptose induzida de adipócitos.

Mecanismo do Regulamento de Números de adipócitos em adultos Organismos através da diferenciação e apoptose homeostase

Este protocolo descreve o método de determinação da lipólise basal e estimulada com forscolina em almofadas de gordura inguinal obtidas a partir de dieta normal (NCD) ou dieta rica em gordura (HFD) ± capsaicina alimentada com camundongos de tipo selvagem. Como índice de lipólise, a libertação de glicerol foi medida a partir de almofadas de gordura adiposa inguinal.

Medição da lipólise basal e estimulada por Forskolin em almofadas de gordura adiposa inguinal

Este artigo fornece três ensaios fáceis e acessíveis para avaliar o metabolismo lipídico em camundongos.

Avaliando a capacidade de manuseio de lipídios em camundongos

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Aqui, descrevemos um protocolo para isolar, cultivar e fenotipar células endoteliais microvasculares do tecido adiposo subcutâneo humano (hSATMVECs). Além disso, descrevemos um modelo experimental de diafonia hSATMVEC-adipócitos.

Estudando a conversa cruzada de células endoteliais adiposas/adipócitos no tecido adiposo subcutâneo humano

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Usando um modelo explantado ex vivo , pequenos pedaços da porção rostral do tecido adiposo branco visceral de camundongos magros são cultivados por 7 a 10 dias, permitindo a indução e o estudo da inflamação do tecido adiposo conforme ocorre durante a alimentação rica em gordura.

Um modelo de camundongo ex vivo para inflamação do tecido adiposo com dieta rica em gordura

Este procedimento descreve um método para o isolamento e cultura do órgão murino de Corti com ou sem o limbo espiral e neurônios do gânglio espiral. Nós também demonstrar um método para a expressão de um gene exógeno repórter no órgão de Corti explante por eletroporação.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

A trompa de falópio (FT) está emergindo como um local alternativo de origem para o carcinoma de ovário seroso (SOC). Este protocolo descreve um novo método para o isolamento...

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Aprenda a medir taxas de lipólise em adipócitos murinos ex vivo e pré-adipócitos diferenciados in vitro usando amostragem serial e ensaios enzimáticos. Este método validado permite comparar condições basais e estimuladas.

Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro

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