Name: Ferritinofagia: Avaliação da Degradação Seletiva do Ferro por Autofagia em Fibroblastos Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a avaliar a ferritinofagia em fibroblastos humanos primários por imunofluorescência de alto rendimento. Este método permite análise quantitativa da degradação lisossômica de ferritina e diferenciação de vias dependentes e independentes de autofagia.

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<ol><li>Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI+proteins%3A+Essential+PtdIns3P+effectors+at+the+nascent+autophagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome.</a> Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Proikas-Cezanne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI-1%CE%B1+%28WIPI49%29%2C+a+member+of+the+novel+7-bladed+WIPI+protein+family%2C+is+aberrantly+expressed+in+human+cancer+and+is+linked+to+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy.</a> Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).</li>
<li>Bakula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI3+and+WIPI4+%CE%B2-propellers+are+scaffolds+for+LKB1-AMPK-TSC+signalling+circuits+in+the+control+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy.</a> Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).</li>
<li>Hayflick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Propeller+protein-associated+neurodegeneration%3A+A+new+X-linked+dominant+disorder+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation.</a> Brain. 36, 1708-1717 (2013).</li>
<li>Wilson, J. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+clinical+management+guideline+for+beta-propeller+protein-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Medicine+and+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration.</a> Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).</li>
<li>Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+iron+metabolism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular iron metabolism and regulation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).</li>
<li>Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+NCOA4+as+the+cargo+receptor+mediating+ferritinophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy.</a> Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).</li>
<li>Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+oxidation+and+proteasomal+degradation%3A+Protection+by+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants.</a> Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).</li>
<li>Schüssele, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+profiling+in+single+cells+with+open+source+CellProfiler-based+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis.</a> Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).</li>
<li>Goodwin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-independent+lysosomal+targeting+regulated+by+ULK1%2F2-FIP200+and+ATG9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9.</a> Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).</li>
<li>Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCOA4-mediated+ferritinophagy%3A+A+potential+link+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).</li>
<li>Zachari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+of+mitochondria+on+a+ubiquitin-endoplasmic-reticulum+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform.</a> Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><forte>Linhas celulares</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos humanos primários derivados da pele&nbsp;</td><td>Biópsia de pele, doador humano saudável, Biobank University Clinic T&uuml; bingen, Aprovação ética 389/2019BO2</td><td>F-CO-60, passagem 9</td><td></td></tr><tr><td><forte>Tratamentos de cultura celular</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Concentração final (composto)</forte></td></tr><tr><td>Meio de controle</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>(somente DMSO)</td></tr><tr><td>Meio de controle + bafilomicinaA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>100 nM bafilomicina A1</td></tr><tr><td>Meio de controle + deferasiox (DFX)</td><td>DMEM 10% FCS</td><td></td><td>30 e micro; M DFX</td></tr><tr><td>Meio de controle + DFX + bafilomicinaA1</td><td>DMEM 10% FCS</td><td></td><td>30 &micro; M DFX, 100 nM bafilomicina A1</td></tr><tr><td>Meio de controle + citrato de amônio férrico (FAC)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0,05 mg/mL FAC</td></tr><tr><td>Meio de controle + FAC + bafilomicinaA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0,05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomicina A1</td></tr><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina [BSA] Fração V</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 cabra a-coelho</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 cabra um rato</td><td>Life Technologies</td><td>A-11003</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>196000</td><td></td></tr><tr><td>BioLite Cell Culture tratado pratos de 10cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099</td><td></td></tr><tr><td>Deferasiox (ICL-670)</td><td>Selleckchem</td><td>S1712</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sem cálcio nem magnésio</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FCS)</td> <td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de amônio férrico (FAC)</td> <td>Merck</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FERRITIN (Baço Humano)</td> <td>Rockland</td><td>200-401-090-0100</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 (H4B4)</td> <td>Santa Cruz</td><td>Sc-18822</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x Dulbecco' s</td><td>AppliChem</td><td>A0965</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (1,00U / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina)</td> <td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%) com vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>96 placas de fundo de vidro de 96 poços # 0</td><td>Cellvis</td><td>P96-0-N</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > Solução< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,7% de paraformaldeído (PFA)</td><td></td><td></td><td>PFA dissolvido em PBS, pH 7,5;</td></tr><tr><td>Bafilomicina A1 estoque 100 mM</td> Bafilomicina <td></td><td></td><td>A1 diluída em DMSO</td></tr><tr><td>Citrato férrico de amônio (FAC) 100 mg/mL estoque</td><td></td><td></td><td>FAC diluído em água autodestilada dupla</td></tr><tr><td>PBS/T</td><td></td><td></td><td>PBS, suplementado com 10% de Tween20&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS/T + BSA</td><td></td><td></td><td>PBS, suplementado com 10% de Tween20, 1% de BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 4.2.4</td><td>https://cellprofiler.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Versão 16.50</td><td>Microsoft Office Plus 365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ferritinofagia: avaliação da degradação seletiva do ferro por autofagia em fibroblastos humanos

Ferritinophagy: Assessing the Selective Degradation of Iron by Autophagy in Human Fibroblasts

Fibroblastos primários derivados da pele humana (F-CO-60) de doadores saudáveis (Figura 1A) foram preparados para avaliações de ferritinofagia usando tratamento com baflomicina A1 seguido de imunomarcação de ferritina endógena e LAMP2, análise automatizada de imagens e análise baseada em CellProfiler (Figura 1B).
A colocalização da ferritina endógena e do LAMP2 aumentou após o bloqueio da degradação lisossômica da ferritina pela adição de bafilomicina A1, compatível com sua capacidade de inibir as enzimas lisossômicas V-ATPase e, assim, bloquear a ferritinofagia7 (Figura 2). Além disso, o reconhecimento celular baseado em software, bem como o reconhecimento de ferritina e LAMP2, são mostrados como exemplo (Figura 2).
A este respeito, deve-se notar que o pipeline do CellProfiler descrito aqui é extremamente versátil e pode ser adaptado a leituras adicionais e/ou alternativas, como para avaliar os efeitos de certas mutações BPAN no crescimento celular, mitocôndrias ou outras organelas no contexto de sistemas funcionais de marcadores de célula única.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral experimental. Representação gráfica de (A) o processo de ferritinofagia e (B) o fluxo de trabalho experimental para avaliar a ferritinofagia em fibroblastos humanos primários derivados da pele, conforme descrito neste protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig02.jpg"> Figura 2: Imagens representativas. Fibroblastos humanos primários derivados da pele em meio de controle (condições alimentadas) na ausência (A) ou (B) presença de bafilomicina A1 foram submetidos a uma análise de imunofluorescência indireta usando anticorpos anti-ferritina e anti-LAMP2, enquanto os núcleos celulares foram corados com DAPI. Imagens de fluorescência exemplares adquiridas com automação de microscopia confocal de varredura a laser são apresentadas (barras de escala: 10 μm). Alterações na abundância e colocalização de ferritina e LAMP2 podem ser observadas após a inibição lisossômica após a administração de bafilomicina A1. A análise baseada no CellProfiler também é exibida, mostrando as sobreposições de imagem derivadas de software de reconhecimento de células (roxo), núcleos (azul), ferritina (verde), LAMP2 (vermelho) e pontos de ferritina/LAMP2 (amarelo) de colocalização. (C) Seções de imagem ampliadas (barra de escala = 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: As configurações de microscopia confocal de varredura a laser usadas neste estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: As configurações numéricas do CellProfiler usadas neste estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo Suplementar 1: O pipeline do CellProfiler usado neste estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Exibição do pipeline do CellProfiler (consulte Arquivo Suplementar 1) com capturas de tela tiradas em ordem consecutiva (consulte a Tabela 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_.Supplemental%20FIle%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Ferritinofagia: Avaliação da Degradação Seletiva do Ferro por Autofagia em Fibroblastos Humanos

Mutations in the autophagy gene WDR45/WIPI4 are the cause of beta-propeller-associated neurodegeneration (BPAN), a subtype of human diseases known as ...

ferritinophagy-assessing-selective-degradation-iron-autophagy-human

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