Name: Um modelo de orelha de camundongo para avaliação de dermatite alérgica de contato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a induzir dermatite alérgica de contato em orelhas de camundongo usando DNFB. Este protocolo detalhado permite avaliar a severidade da DAC e explorar novos tratamentos pré-clínicos com alta reprodutibilidade.

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Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (NSFC) para N.-N. Y. (81904212); Projeto de Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa de Jiangsu (YB201995); e o Projeto de Financiamento Especial para Pesquisadores de Pós-Doutorado na China (2020T130562).

Todos os cuidados e tratamento dos camundongos estavam de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yangzhou e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais sob a licença de projeto SYXK(SU)2022-0044. Camundongos BALB/c machos e fêmeas com idade entre 6-8 semanas foram usados neste estudo. Cada grupo consistiu de seis camundongos (ver Tabela de Materiais). As gaiolas foram colocadas em câmara com temperatura controlada (22 ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h) com livre acesso a água e ração. Um fluxograma experimental é mostrado na Figura 1.
1. Preparo dos animais
<ol><li>Iniciar a modelagem após 1 semana de aclimatação ao ambiente.</li>
	<li>Use uma lâmpada ultravioleta e desinfetante com álcool 75% para limpar e desinfetar o ambiente e as bancadas antes de manipular os ratos. NOTA: Para evitar a influência de fatores externos, a marcação dos camundongos para identificação não pode ser realizada na orelha do camundongo; A coloração nas costas ou na cauda pode ser usada como alternativa.</li>
	<li>Use um pequeno cotonete para aplicar água e sabão no abdômen dos camundongos (aproximadamente 1-2 cm2 de tamanho). Raspe a área na direção do crescimento do cabelo com uma lâmina ou barbeador (ver Tabela de Materiais) no início da modelagem (dia 0; Figura 2A). NOTA: O uso de uma lâmina de barbear lisa para depilação requer um operador qualificado. Se não for realizada corretamente, pode causar irritação na pele. Considere o uso de creme depilatório, cortadores ou uma navalha de segurança para depilação.</li>
	<li>Pese o rato e compare as variações de peso entre cada grupo.</li>
</ol>2. Estimulação da sensibilização abdominal
<ol><li>Garantir a recuperação completa de qualquer pequena lesão na pele do abdômen induzida pelo barbear. Aplicar sensibilização abdominal 2 dias após o barbear (dia 2).</li>
	<li>Prepare a solução de DNFB a 0,5%: dilua DNFB com uma mistura de acetona:azeite numa proporção de 4:1 (por exemplo, 400 μL de acetona misturada com 100 μL de azeite; ver Tabela de Materiais). Use uma pistola de pipeta para soprar e misture 20 vezes para misturar completamente a solução DNFB. Antes de cada administração da solução de DNFB ao rato, soprar e misturá-lo três a cinco vezes. NOTA: Prepare a solução antes de usar e envolva-a em papel alumínio para protegê-la da luz solar direta.</li>
	<li>Aplicar 25 μL da solução de DNFB a 0,5% na pele da área raspada no abdome dos camundongos com um pipetador (Figura 2B).</li>
	<li>Drible a solução de DNFB sobre o meio da área de barbear abdominal e espalhe levemente com o lado liso da ponta do pipetador para dispersá-la uniformemente.</li>
	<li>Aos 30 s após a estimulação com DNFB, coloque os camundongos em gaiolas vazias sem roupa de cama para evitar que eles esfreguem a solução de DNFB. Quando a solução de DNFB estiver completamente seca (cerca de 2 min), devolva os ratos à sua gaiola original.</li>
	<li>Use luvas ao manusear a solução de DNFB, pois é fortemente irritante para a pele humana.</li>
</ol>3. Estimulação da sensibilização auricular
<ol><li>Prepare uma solução de DNFB a 0,2% como acima, a solução do veículo (uma mistura 4:1 de acetona e azeite) e água pura.</li>
	<li>Orientar o corpo do rato e fazer com que a borda externa da aurícula fique virada para baixo durante toda a operação para evitar que a solução entre no canal auditivo durante a estimulação com DNFB.</li>
	<li>Nos dias 4, 6, 8 e 10, use um pipetador para aplicar 20 μL da solução de DNFB a 0,2% ou da solução do veículo lenta e uniformemente na superfície interna das aurículas esquerdas dos camundongos. Para evitar que a solução de DNFB entre no canal auditivo, use o lado liso da ponta do pipetador para distribuir suavemente a solução de DNFB durante a administração. Deixar as orelhas direitas sem tratamento (Figura 2C).</li>
	<li>Aguarde até que a solução de DNFB esteja seca e coloque os ratos de volta na gaiola (cerca de 30 s).</li>
	<li>Use luvas ao manusear a solução DNFB.</li>
</ol>4. Registro do peso do mouse e dos sintomas de DCA
<ol><li>Pese o rato todos os dias, comece no dia 1 e compare com o seu peso correspondente no dia 0; avaliar o efeito da DCA sobre o peso corporal de camundongos quanto à mudança de peso (g) ± erro padrão da média (EPM).</li>
	<li>Tire fotos de alta resolução das orelhas do rato para registrar os sintomas clínicos da DCA a cada 2 dias, começando no dia 1.</li>
</ol>5. Medição da espessura da aurícula
<ol><li>Meça a espessura da aurícula a cada 2 dias, começando no dia 1. Meça e registre as duas orelhas em detalhes.</li>
	<li>Use paquímetros vernier (ver Tabela de Materiais) para medir a espessura da aurícula no mesmo horário todos os dias para obter resultados precisos (Figura 3A). Pare os paquímetros vernier de continuar a pinçar para dentro quando houver um ligeiro bloqueio, para evitar danos teciduais à orelha do rato. Mantenha a posição fixa e registre os dados.</li>
	<li>Coletar a espessura de três locais diferentes em cada aurícula (Figura 3B). Registre a média dos três dados como um valor válido. Avaliar-se o edema da orelha em micrômetros (μm) ± erro padrão da média (EPM).</li>
</ol>6. Avaliação do grau de edema inflamatório
<ol><li>Preparar solução de corante azul de Evans a 0,5% (ver Tabela de Materiais): diluir o corante azul de Evans com solução salina tamponada com fosfato (PBS) no dia 11. Use sempre jaleco e luvas, pois o corante azul Evans é ligeiramente tóxico para os seres humanos.</li>
	<li>Imobilize os ratos com um fixador: abra a tampa do fixador (ver Tabela de Materiais), segure a cauda do rato, faça com que a cabeça do rato fique virada para o fixador e faça o rato subir instintivamente no fixador. Tampe a tampa, faça a cauda do rato sair do orifício da tampa e ajuste o comprimento do fixador para expor toda a cauda do rato.</li>
	<li>Limpe a cauda repetidamente com uma bola de algodão de álcool ou mergulhe-a em água morna por 30 s e aperte suavemente a raiz da cauda para preencher e expandir as veias de ambos os lados. Realizar a injeção sob a irradiação de uma fonte de luz fria.</li>
	<li>Injete lentamente a solução de corante azul de Evans na veia da cauda do rato utilizando uma agulha de insulina de 1 mm. Aguarde 15 min e depois tire fotos das orelhas do mouse. NOTA: Coloque o mouse sobre a mesa e segure-o suavemente para expor a região da orelha para aquisição da imagem. Logo após a injeção com a solução corante azul de Evans e observando as indicações correspondentes, use deslocamento cervical para eutanasiar o camundongo.</li>
</ol>

<ol><li>Neale, H., Garza-Mayers, A. C., Tam, I., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+allergic+contact+dermatitis.+Part+I%3A+Clinical+features+and+common+contact+allergens+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Pediatric allergic contact dermatitis. Part I: Clinical features and common contact allergens in children.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 84 (2), 235-244 (2021).</li>
<li>Koppes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+knowledge+on+biomarkers+for+contact+sensitization+and+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Dermatitis%22%5BJournal%5D)">Current knowledge on biomarkers for contact sensitization and allergic contact dermatitis.</a> Contact Dermatitis. 77 (1), 1-16 (2017).</li>
<li>Martin, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+chemical-induced+innate+immunity+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis.</a> Allergy. 66 (9), 1152-1163 (2011).</li>
<li>Kimber, I., Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Dearman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Allergic contact dermatitis.</a> International Immunopharmacology. 2 (2-3), 201-211 (2002).</li>
<li>Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+and+regulatory+mechanisms+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis.</a> Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).</li>
<li>Gamradt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+checkpoint+receptors+control+CD8%2B+resident+memory+T+cells+to+prevent+skin+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory checkpoint receptors control CD8+ resident memory T cells to prevent skin allergy.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (6), 2147.e9-2157.e9 (2019).</li>
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<li>Knop, J., Riechmann, R., Neumann, C., Macher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+suppressor+mechanisms+in+allergic+contact+dermatitis%3A+5.+Evidence+that+inhibition+of+suppressor+T+lymphocytes+by+Corynebacterium+parvum+is+mediated+by+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Modulation of suppressor mechanisms in allergic contact dermatitis: 5. Evidence that inhibition of suppressor T lymphocytes by Corynebacterium parvum is mediated by interferon.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 79 (6), 385-388 (1982).</li>
<li>Polak, L., Scheper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+T-cell+lines+in+DNCB-contact+sensitivity+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific T-cell lines in DNCB-contact sensitivity in guinea pigs.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 80 (5), 398-402 (1983).</li>
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<li>Knop, J., Riechmann, R., Macher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+suppressor+mechanism+in+allergic+contact+dermatitis.+IV.+Selective+inhibition+of+suppressor+T-lymphocytes+by+serum+obtained+from+Corynebacterium+parvum+treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Modulation of suppressor mechanism in allergic contact dermatitis. IV. Selective inhibition of suppressor T-lymphocytes by serum obtained from Corynebacterium parvum treated mice.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 77 (6), 469-473 (1981).</li>
<li>Rubic-Schneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR91+deficiency+exacerbates+allergic+contact+dermatitis+while+reducing+arthritic+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">GPR91 deficiency exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice.</a> Allergy. 72 (3), 444-452 (2017).</li>
<li>Stampf, J. L., Benezra, C., Byers, V., Castagnoli Jr, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+to+poison+ivy+urushiol+in+the+guinea+pig+by+epicutaneous+application+of+the+structural+analog+5-methyl-3-n-pentadecylcatechol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance to poison ivy urushiol in the guinea pig by epicutaneous application of the structural analog 5-methyl-3-n-pentadecylcatechol.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 86 (5), 535-538 (1986).</li>
<li>Dhingra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+contact+dermatitis+skin+identifies+allergen-dependent+differences+in+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (2), 362-372 (2014).</li>
<li>Maguire Jr, H. C., Kaidbey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+photoallergic+contact+dermatitis%3A+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Experimental photoallergic contact dermatitis: a mouse model.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 79 (3), 147-152 (1982).</li>
<li>Qiu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dysregulated+sebum-microbial+metabolite-IL-33+axis+initiates+skin+inflammation+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A dysregulated sebum-microbial metabolite-IL-33 axis initiates skin inflammation in atopic dermatitis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 219 (10), e2021397(2022).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+activities+of+Dictamnus+dasycarpus+Turcz.%2C+root+bark+on+allergic+contact+dermatitis+induced+by+dinitrofluorobenzene+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory activities of Dictamnus dasycarpus Turcz., root bark on allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in mice.</a> Journal of Ethnopharmacology. 149 (2), 471-477 (2013).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+6%27-acetylpaeoniflorin+on+dinitrochlorobenzene-induced+allergic+contact+dermatitis+in+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of 6'-acetylpaeoniflorin on dinitrochlorobenzene-induced allergic contact dermatitis in BALB/c mice.</a> Immunologic Research. 64 (4), 857-868 (2016).</li>
<li>Donglang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+different+skin+pruritus+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative study on different skin pruritus mouse models.</a> Frontiers in Medicine. 8, 630237(2021).</li>
<li>Yang, N., Shao, H., Deng, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+pharmacology-based+analysis+to+explore+the+therapeutic+mechanism+of+Cortex+Dictamni+on+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Network pharmacology-based analysis to explore the therapeutic mechanism of Cortex Dictamni on atopic dermatitis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 304, 116023(2023).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.

O protocolo aqui descrito para indução de sintomas semelhantes aos da DAC em orelhas de camundongos pode ser utilizado para estudar a fisiopatologia da DAC e como ferramenta de triagem para o desenvolvimento de novas drogas.
Existem dois passos fundamentais para estabelecer um modelo de DCA: sensibilização inicial e estimulação subsequente. O abdome é geralmente o local de sensibilização inicial, mas o local de estimulação subsequente foi escolhido de forma ligeiramente diferente. Estudos prév...

A dermatite alérgica de contato (DCA) é uma doença cutânea comum que se caracteriza por sintomas semelhantes aos eczemas no local de contato, edema e eritema em casos moderados, e pápulas, erosão, exsudação ou mesmo cicatrizes maciças em casos graves1. Acomete até 20% da população e pode acometer pessoas de qualquer idade2. A DCA ocorre frequentemente em indivíduos que foram expostos a alérgenos repetidamente e pode ser causada pela resposta imune do indivíduo a um ou mais alérgenos em sua casa ou local de trabalho3. A hipersensibilidade tardia tipo IV é considerada o principal tipo de resposta imune naDAC4. Em áreas da pele que têm sido repetidamente expostas a alérgenos, as células T de memória circulantes acumulam-se em grande número e induzem respostas imunes e inflamatórias 3,5,6. O objetivo deste trabalho é propor uma técnica laboratorial confiável para investigação adicional das respostas imunológica e inflamatória no desenvolvimento da DCA.
O início da DCA é geralmente devido à hipersensibilidade de contato causada pela exposição repetida a produtos químicos. Numerosos pesquisadores desenvolveram vários modelos animais de DCA em camundongos domésticos7,8, cobaias 9,10 e outros animais ao longo das últimas décadas, a fim de simular o início da doença. A maioria dos métodos experimentais consiste em duas etapas: sensibilização abdominal (indução) e fornecimento de estímulos no dorso ou no lóbulo da orelha (estimulação). Substâncias químicas comumente usadas incluem principalmente 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB)/1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (DNCB)8,9,11, oxazolona 12, urushiol 13, etc. Dentre elas, DNFB e DNCB são as mais utilizadas, relatadas pela primeira vez em outubro de 195810. O modelo de sensibilização ao níquel14 e a dermatite de contato fotoalérgica modelo15 também são frequentemente utilizados.
Apresentamos um método experimental para a construção do modelo de DCA. Este método é resumido e otimizado com base em estudos anteriores e na comparação com múltiplos experimentos. Comparado com outros modelos de DCA, este modelo tem algumas vantagens, tais como pequenas diferenças individuais, curtos períodos experimentais, uma pequena quantidade de estimulação química, etc. Além disso, este estudo é aplicável a camundongos, que não são apenas econômicos, mas também têm mais opções para knockout gênico ou preparação de camundongos transgênicos16. Também descrevemos os vários métodos usados para monitorar o progresso da DCA no experimento, como medir a espessura da orelha, usar o corante azul de Evans para medir a exsudação inflamatória, etc. Esse modelo pode não apenas analisar orelhas de camundongos, sangue, baço e outras amostras por meios laboratoriais para explorar a patogênese da DAC, mas também é aplicável para a avaliação pré-clínica de novos métodos terapêuticos, o que tem certo significado promocional.

<table><tbody><tr><td>1-Fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB)</td><td>Merck</td><td>200-734-3</td><td>1-Fluoro-2,4-dinitrobenzeno, &ge; 99%</td></tr> <tr><td>Acetona</td><td>Sinopharm Reagente Químico Co. LTD</td><td>10000418</td><td>&ge; 99,5%</td></tr><tr><td>Folha de alumínio&nbsp;</td><td>Cleanwrap</td><td>CF-2</td><td></td></tr><tr><td>Evans corante azul</td><td>Solarbio</td><td>314-13-6</td><td>Conteúdo de corante aprox. 80%</td></tr><tr><td>Fixador de mouse</td><td>ZHUYANBANG</td><td>GEGD-SM1830</td><td></td></tr><tr><td>Azeite</td><td>Solarbio</td><td>8001-25-0</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Ponta de pipeta</td><td>Biofount</td><td>FT-200</td><td>10 - 200 &mu; l</td></tr><tr><td>Pipetador</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000250</td><td>20 - 200 &mu; l</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Shanghai Gillette Co. LTD</td><td>74-S</td><td></td></tr><tr><td>Vernier pinças</td><td>Delixi Electric</td><td>DECHOTVCS1200</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de orelha de camundongo para avaliação de dermatite alérgica de contato

A Mouse Ear Model for Allergic Contact Dermatitis Evaluation

A pele é a primeira linha de defesa do corpo humano e um dos órgãos mais expostos aos produtos químicos ambientais. A dermatite alérgica de contato (DCA) é uma doença de pele comum que se manifesta como erupção cutânea local, vermelhidão e lesões cutâneas. A ocorrência e o desenvolvimento da DCA são influenciados por fatores genéticos e ambientais. Embora muitos estudiosos tenham construído uma série de modelos de DCA nos últimos anos, os protocolos experimentais desses modelos são todos diferentes, o que torna difícil para os leitores estabelecê-los bem. Portanto, um modelo animal estável e eficiente é de grande importância para aprofundar o estudo da patogênese da dermatite atópica. Neste estudo, detalhamos um método de modelagem usando 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB) para induzir sintomas semelhantes aos da DAC em orelhas de camundongos e descrevemos vários métodos para avaliar a gravidade da dermatite durante a modelagem. Este protocolo experimental tem sido aplicado com sucesso em alguns experimentos e tem um certo papel promocional no campo da pesquisa em DCA.

Sob estimulação repetida com DNFB, as orelhas de camundongos do grupo DNFB apresentaram sintomas clínicos evidentes comparáveis aos da DAC, com áreas sensíveis apresentando os sintomas típicos de vermelhidão, ressecamento e até erosão e exsudação. Entretanto, a administração auricular de água pura (grupo controle) ou solvente controle (grupo veículo) não produziu sintomas semelhantes (Figura 4).
Já no grupo DNFB, comparado à orelha direita não tratada, a espessura...

Aqui, descrevemos os métodos de indução de dermatite alérgica de contato em orelhas de camundongos pelo 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB) e como avaliar a gravidade da dermatite alérgica de contato.

Um modelo de orelha de camundongo para avaliação de dermatite alérgica de contato

Skin is the human body&#39;s first line of defense and one of the most exposed organs to environmental chemicals. Allergic contact dermatitis (ACD) is a ...

Esse modelo não só pode ser utilizado para explorar a patogênese da DAC, mas também é aplicável para a evolução pré-clínica de novos métodos terapêuticos, o que tem um significado importante. Este é um modelo animal estável e eficiente com muitas vantagens, como um curto período experimental, fácil operação, sintomas óbvios e uma alta taxa de sucesso. Nosso protocolo experimental é muito detalhado e fácil de operar.Certifique-se de seguir cada etapa do protocolo corretamente. Antes de iniciar a modelagem, aclimate os ratos ao ambiente por uma semana com acesso gratuito a comida e água. No dia da modelagem, utilizando lâmpada ultravioleta e álcool 75%, limpe e desinfete o ambiente e as bancadas.Aplique água e sabão no abdômen dos ratos usando um cotonete e raspe a área na direção do crescimento do cabelo com uma lâmina ou barbeador. Pese o rato e compare as variações de peso entre cada grupo. Antes de realizar a estimulação de sensibilização abdominal, garanta a recuperação completa de qualquer lesão menor na pele do abdômen de camundongo induzida pela depilação.Prepare a solução de DNFB a 0,5% e dilua-a com acetona para mistura de azeite numa proporção de 4 para 1. Usando uma pistola de pipeta, sopre e misture 20 vezes para misturar completamente a solução DNFB. Aplicar 25 microlitros da solução de DNFB a 0,5% sobre o meio da área de barbear abdominal com um pipetter e espalhe levemente com o lado liso da ponta do pipetter para dispersá-lo uniformemente.Após 30 segundos de estimulação com DNFB, coloque o rato numa gaiola vazia sem roupa de cama para evitar que o rato esfregue a solução de DNFB. Quando a solução estiver completamente seca, devolva o rato à sua gaiola original com livre acesso a comida e água. Para a estimulação da sensibilização da orelha, orientar o corpo do camundongo e fazer a borda externa da aurícula voltada para baixo para evitar que a solução entre no canal auditivo durante a estimulação com DNFB.Nos dias 4 e 10, usando um pipetador, aplicar 20 microlitros do veículo, ou solução de DNFB 0,2% lenta e uniformemente na superfície interna da aurícula esquerda, e distribuir suavemente a solução usando o lado liso do pipetador. Deixe a orelha direita sem tratamento. Aguarde até que a solução de DNFB esteja seca e coloque o rato de volta na gaiola.Após estimulação abdominal e de sensibilização do ouvido, pesar os ratos a cada dois dias a partir do primeiro dia. Comparar o peso de cada rato com o dia zero e avaliar o efeito da DCA no peso corporal dos ratinhos à medida que o peso muda. Capture fotos de alta resolução das orelhas de camundongos para registrar os sintomas clínicos da DCA a cada dois dias, começando no primeiro dia.Usando paquímetro de Vernier, meça a espessura da aurícula no mesmo horário todos os dias para obter resultados precisos. Pare os paquímetros vernier de continuar o pinçamento para dentro quando houver um ligeiro bloqueio para evitar danos teciduais à orelha do rato. Mantenha a posição fixa e registre os dados para ambas as orelhas.Registre a média dos três dados e avalie o inchaço da orelha em micrômetros. Para avaliar o grau de inchaço inflamatório no dia 11, prepare a solução corante azul de Evans a 0,5% e dilua-a com PBS. Para imobilizar o mouse com um fixador, abra a tampa, segure a cauda do mouse, faça a cabeça do mouse encarar o fixador e permita que o mouse instintivamente suba no fixador.Tampe a tampa. Faça a cauda do mouse sair do orifício na tampa e ajuste o comprimento do fixador para expor toda a cauda do mouse. Limpe a cauda repetidamente com uma bola de algodão de álcool, ou mergulhe-a em água morna por 30 segundos, e aperte suavemente a raiz da cauda para encher e expanda as veias de ambos os lados.Injete lentamente a solução Evans Blue Dye na veia da cauda do rato utilizando uma agulha de insulina de 1 mm sob a irradiação de uma fonte de luz fria. Aguarde 15 minutos para tirar fotos das orelhas do mouse. As orelhas de camundongos do grupo DNFB apresentaram sintomas clínicos evidentes comparáveis aos da DCA, com áreas sensíveis apresentando os sintomas típicos de vermelhidão, ressecamento, erosão e exsudação.No entanto, a administração auricular de água pura ou controle com solvente não produziu sintomas semelhantes ao grupo DNFB. No grupo DNFB, comparado à orelha direita não tratada, a espessura da orelha esquerda aumentou significativamente após a estimulação com DNFB. Não houve diferença significativa nos grupos controle e veículo.A orelha esquerda dos camundongos do grupo DNFB tornou-se azul escuro após a injeção do corante Azul de Evans, que era visualmente diferente da orelha direita. As orelhas esquerda e direita dos camundongos dos grupos controle e veículo eram aproximadamente da mesma cor. O ganho de peso dos camundongos foi ligeiramente retardado pela DNFB, ou estimulação veicular simples, mas não resultou em perda de peso significativa.A estimulação repetida do DNFB na orelha de camundongos resultou em aumento do baço e aumento do índice esplênico. Em contraste, o índice de baço dos camundongos do grupo veículo não se alterou significativamente. Certifique-se de que a solução DINFB está totalmente misturada e aplicada uniformemente na orelha do rato sem fluir para o canal auditivo.Essa é a chave para o sucesso da modelagem.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Modelos de ratos experimentais de asma alérgica oferecer novas possibilidades para o estudo da patogênese da doença eo desenvolvimento de novas terapêuticas. Estes modelos são bem adequados para factores de medição que regulam a resposta imune alérgica, inflamação das vias aéreas, e fisiopatologia pulmonar.

Modelo murino de asma induzida alergénio

Este vídeo descreve um método para medir a sensibilidade aos raios UV em um modelo de camundongo humanizado - um modelo de camundongo que imita a pele humana. Determinamos a dose eritematosa mínima (MED) de radiação UV que pode causar eritema ou edema na pele. O método pode ajudar a descobrir a eficácia dos medicamentos usados para reduzir a sensibilidade aos raios UV.

Ensaio de dose eritematosa mínima: um método para medir a sensibilidade UV em modelos de camundongos

Este vídeo demonstra uma técnica in vivo para avaliar um antígeno de teste induzindo inflamação da pele em um modelo murino. O antígeno de teste - um hapteno em uma solução de óleo / acetona - é aplicado topicamente na pele da orelha do camundongo e a inflamação da pele é avaliada após um período adequado.

Uma técnica para avaliar a resposta imune contra um antígeno induzindo inflamação da pele

Este vídeo demonstra a infecção cutânea induzida por Malassezia em camundongos. A suspensão do óleo de Malassezia é aplicada sobre a orelha ferida, provocando inflamação e inchaço do tecido da orelha. Posteriormente, as espigas são dissecadas, homogeneizadas e espalhadas em uma placa de ágar para crescimento. O número de colônias indica a carga fúngica resultante da inflamação da pele.

Análise da inflamação da pele induzida por Malassezia e carga fúngica em modelo murino

As reações alérgicas, caracterizada pela ativação de mastócitos e basófilos, são movidos pela ligação cruzada de IgE e liberação de mediadores pró-inflamatórios. A avaliação quantitativa da resposta alérgica pode ser conseguido através de corante azul de Evans para monitorar alterações na permeabilidade vascular após o desafio alérgeno.

Medindo Anafilaxia locais em Ratos

Aqui, descrevemos um método de imagem de toda a montagem de alta resolução da pele de orelha inteira rato adulto, que nos permite visualizar ramificação morfogênese e padronização de nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição de células imunes.

Toda a montagem em microscopia Confocal para pele da orelha do adulto: um sistema de modelo para estudar a morfogênese Neuro-vasculares de ramificação e distribuição de células imunes

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de murina de dermatite de contato alérgico (ACD). O CHS baseia-se na sensibilização com hapten reativo pintando a pele raspada do peito e abdômen, com um subsequente desafio da pele do ouvido com um hapten diluído, causando uma reação de inchaço que é avaliada de várias maneiras.

Entrar em contato com a Hipersensibilidade como modelo murino de dermatite de contato alérgico

Este protocolo descreve o procedimento para induzir a inflamação da acne na pele de ratos com ácido oleico e Cutibacterium acnes.

Um modelo de rato de acne composta

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

Aprenda a induzir dermatite alérgica de contato em orelhas de camundongo usando DNFB. Este protocolo detalhado permite avaliar a severidade da DAC e explorar novos tratamentos pré-clínicos com alta reprodutibilidade.

Um modelo de orelha de camundongo para avaliação de dermatite alérgica de contato

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