Name: Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda uma técnica de imagem bioortogonal para visualizar o metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos. Este método combina microscopia Raman e fluorescência para análise em alta resolução subcelular.

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Agradecemos ao Dr. Yajuan Li e Anthony Fung por seu suporte técnico e ao laboratório Fraley pela linha celular. Agradecemos os fundos iniciais da UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 e Hellman Fellow Award.

1. Preparação da mídia
<ol><li>Preparar 10 mL de AAAs controle e excesso em meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 50% D2O.<ol><li>Para o meio controle, medir e misturar 10 mg de pó de DMEM com 4,7 mL de água bidestilada (ddH2O) em um tubo cônico de 15 mL. O pó de DMEM contém todos os aminoácidos em concentrações padrão. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicionar 4,7 mL de D2O, 0,5 mL de soro fetal bovino (SFB a 5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%). Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada.</li>
		<li>Para o meio de tratamento 15x Phe, medir e misturar 10 mg de DMEM em pó com 4,7 mL de ddH2O, 0,5 mL de FBS (5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%) em um tubo cônico de 15 mL. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicionar o excesso de pó de Phe na concentração de 924 mg/L ao meio. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada.</li>
		<li>Para o meio de tratamento Tryp 15x, medir e misturar 10 mg de pó de DMEM com 4,7 mL de ddH2O, 0,5 mL de FBS (5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%) em um tubo cônico de 15 mL. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicione o excesso de Tryp pó a uma concentração de 224 mg/L ao meio. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada.</li>
		<li>Adicionar metionina e treonina a 30,0 mg/mL e 95,0 mg/mL, respectivamente, a todos os tubos cônicos das etapas anteriores. Vórtice completamente e inverta o tubo. Não é necessário adicionar piruvato de sódio aos meios de cultura.</li>
		<li>Filtrar o meio de controle e tratamento com um filtro de seringa de 25 mm com filtros de membrana de polietersulfona de 0,22 μm.</li>
		<li>Selar todos os tubos cônicos contendo mídia com parafilme e armazenar a 4 °C por até 3 semanas. Antes de tratar as células com meio, aqueça todos os meios a 37°C. NOTA: Os reagentes em pó e líquidos devem ser medidos e combinados com base no volume total dos meios de tratamento e controle.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação da amostra celular
<ol><li>Manter células de câncer cervical (HeLa) em um frasco de cultura (ou seja, T10, T25, etc.) usando DMEM padrão suplementado com FBS a 10% e penicilina/estreptomicina a 1% a 37 °C e dióxido de carbono (CO2) a 5%.</li>
	<li>Sub-cultivar as células HeLa na proporção de 1:10 até atingir 80% ou mais de viabilidade celular.</li>
	<li>Uma vez que as células atinjam 80% ou mais de confluência, proceda à semeadura de 2 x 105 células por poço em uma placa de 24 poços usando DMEM suplementado com SFB a 0,5% e penicilina/estreptomicina a 1%.<ol><li>Antes da semeadura celular, prepare uma placa de 24 poços com laminina, esterilizada, poli-d-lisina, laminina, laminina, lamínica, com 12 mm de diâmetro. Submergir as lamínulas em etanol 70% e secar suavemente usando lenços sem fiapos. Coloque as tampas limpas nos poços apropriados da placa.</li>
		<li>Quando as células atingirem 80% de confluência na etapa 2.2, lavá-las uma vez com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem íons magnésio e cálcio.</li>
		<li>Adicionar tripsina a 0,25% para dissociar as células aderentes do frasco e incubar a 37 °C e 5% CO2 por 3 min.</li>
		<li>Adicionar DMEM suplementado com FBS a 10% e penicilina/estreptomicina a 1%, pipetar suavemente para cima e para baixo e coletar as células por centrifugação a 300 x g à temperatura ambiente (TR) por 3 min.</li>
		<li>Ressuspender as células em DMEM suplementado com SFB a 0,5% e penicilina/estreptomicina a 1%.</li>
		<li>Conte as células usando um hemocitômetro, microscópio de luz e azul de tripano e semeie uma densidade de 2 x 105 células por poço de uma placa de 24 poços. Como alternativa, um contador de células automatizado pode ser usado para contar as células.</li>
		<li>Devolver as células à incubadora a 37 °C e 5% de CO2 e agitar suavemente a placa para distribuir as células uniformemente.</li>
	</ol></li>
	<li>Após 8 h, substituir o meio de cultura antigo por meios de Tryp 50% D 2 O/excesso de Phe ou50% D2O/excesso de Tryp. Retornar as células à incubadora a 37 °C e 5% CO2 por 36 h.</li>
	<li>Após 36 h, fixar as células em lâminas de microscópio.<ol><li>Antes da fixação, prepare as lâminas do microscópio com espaçadores de imagem de 9 mm de diâmetro e coloque 15 μL de PBS 1x suplementado com íons cálcio e magnésio.</li>
		<li>Enxaguar as células com 1x PBS suplementado com íons cálcio e magnésio.</li>
		<li>Adicionar 0,5 mL de solução de paraformaldeído (PFA) sem metanol a 4% e deixar a placa sob a capa de biossegurança por aproximadamente 15 min.</li>
		<li>Aspirar a solução de PFA e enxaguar com 1x PBS suplementado com íons cálcio e magnésio duas vezes.</li>
		<li>Adicionar 1,5 mL de 1x PBS suplementado com íons cálcio e magnésio em cada poço.</li>
		<li>Use pinças estéreis para agarrar suavemente as tampas de cada poço. Inverter e colocar o lado que contém células das tampas nos espaçadores de imagem para entrar em contato com o PBS preparado na etapa 2.5.1. Certifique-se de que o lado que não contém células está exposto ao ar.</li>
		<li>Usando esmalte transparente, sele a camada externa da lamínula com o espaçador de imagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservar as lâminas do microscópio a 4 °C quando não estiver a efectuar imagens por imagem.</li>
</ol>3. Medida por espectroscopia Raman espontânea (Figura 2)
<ol><li>Utilizar microscópio Raman confocal para obtenção de espectros Raman espontâneos (Figura 2A).</li>
	<li>Ligue o laser girando a chave para a posição ON .</li>
	<li>Clique duas vezes no ícone do software LabSpec6 para abrir o software de aquisição.</li>
	<li>Coloque a amostra biológica no porta-amostras diretamente abaixo da lente objetiva.</li>
	<li>No software, clique no ícone Câmera para ligar a câmera de vídeo.</li>
	<li>Ajuste o plano de foco para identificar uma região de interesse com a lente objetiva de 50x. Mova o joystick para controlar a conversão da plaina do estágio XY e gire o joystick para alterar a profundidade de foco.</li>
	<li>Depois de escolher a posição para medição, mude para a lente objetiva de 100x com 40 mW de potência de excitação. Clique no ícone vermelho Parar para desligar a câmera de vídeo.</li>
	<li>Selecione uma grade de 1800 linhas/mm e defina a faixa de aquisição de 400 cm-1 a 3.150 cm-1.</li>
	<li>Defina o Tempo de Aquisição para 90 s, o Acúmulo para 3 e o Binning para 4 para o menor ruído e espectro mais preciso. NOTA: Esses parâmetros de imagem podem ser otimizados para se ajustar ao experimento.</li>
	<li>Clique no ícone de seta para ativar a exibição em tempo real.</li>
	<li>Ajuste o deslocamento Raman (cm-1) para um valor de escolha para ajustar o plano de foco. OBS: Neste experimento, o laser Raman foi focalizado nas gotículas lipídicas, que continham uma alta concentração de ligações CH2 . Portanto, um desvio Raman de 2.850 cm-1 que correspondesse aos modos de alongamento da ligação CH2 foi selecionado para o propósito.</li>
	<li>Ajuste o plano de foco com o joystick para otimizar a melhor relação sinal-ruído.</li>
	<li>Depois de escolher o plano de foco, clique no ícone vermelho Parar para uma exibição em tempo real.</li>
	<li>Selecione o ícone Círculo para iniciar a aquisição de espectro.</li>
	<li>Uma vez que a região celular é tomada, use o mesmo plano de foco para medir o fundo com PBS. Subtraia o espectro de fundo de cada espectro alvo subcelular usando um aplicativo de software de computador separado, como o Origin (Figura 1B).</li>
</ol>4. Experimentos de imagem com 2PEF e SRS
NOTA: Descrições detalhadas do alinhamento do laser SRS podem ser encontradas em um relatório anterior28. Este protocolo concentra-se na operação de um sistema multimodal de imagens SRS e 2PEF (Figura 2C, D).
<ol><li>Clique em Iniciar para aquecer o laser.</li>
	<li>Siga a ordem para definir os interruptores principais da unidade de controle e o monitor ligado: 1) pressione o interruptor principal da caixa de controle IX3-CBH para On, 2) pressione o interruptor principal do controlador do painel de toque para On, 3) pressione o interruptor principal do adaptador AC da fonte de alimentação para LD OBIS 6 Laser Remote conectado ao combinador laser principal FV31-SCOMB para One 4) pressione o interruptor principal do adaptador AC da fonte de alimentação para LD OBIS 6 Laser Remote conectado ao combinador sublaser FV31-SCOMB para On.</li>
	<li>Pressione os interruptores principais do detector de fotodiodo Si e do amplificador de bloqueio On.</li>
	<li>Defina o feixe de Stokes em 1.031 nm, a largura de pulso em 6 ps e a taxa de repetição em 80 MHz.</li>
	<li>Acoplado ao microscópio, ajuste o sistema picoEmerald fornecido com o feixe de bomba sincronizado com um comprimento de onda ajustável de 720-990 nm, uma largura de pulso de 5-6 ps, e uma taxa de repetição de 80 MHz. O poder de excitação médio da bomba e do Stokes é de 450 mW. Otimize o poder de excitação para minimizar os fotodanos para a amostra.</li>
	<li>Use um condensador de óleo de alta abertura numérica (NA) (ou seja, 1,4 NA) para coletar os Stokes e feixes de bomba onde a amostra é montada emitindo algumas gotas no condensador.</li>
	<li>Monte a amostra sobre o óleo e coloque uma gota de água grande em cima da lâmina do microscópio onde a amostra é fixada. Isso é para a lente objetiva de imersão em água.</li>
	<li>Ajuste o amplificador de bloqueio para 20 MHz. Processe a imagem agora usando o módulo de software de super-resolução.</li>
	<li>Selecione 512 pixels x 512 pixels e 80 μs/pixel para o tempo de permanência.</li>
	<li>Uma vez que a região celular desejada esteja focada corretamente, adquira a imagem. Usando o software de aquisição do microscópio, salve as imagens como um arquivo gráfico .oir da Olympus.</li>
	<li>Adquira uma imagem de fundo a 1.900 cm-1 e subtraia-a de todas as imagens celulares.</li>
	<li>Para realizar imagens com PFE2, use o mesmo laser de picossegundo ajustável e ajuste a autofluorescência livre de Flavina e NADH para 800 nm e 780 nm, respectivamente.</li>
	<li>Use um cubo de filtro de 460 nm/515 nm para coletar a emissão retroespalhada de autofluorescência de Flavin e NADH.</li>
	<li>Ajuste o tempo de permanência para 8 μs/pixel e o tamanho do pixel para 512 pixels x 512 pixels. Defina o parâmetro de potência do obturador a laser para 150 mW.</li>
	<li>Para reconstrução de imagens 3D, ajuste a perda Raman estimulada para 2.850 cm-1 (797 nm).</li>
	<li>Uma vez que as células individuais desejadas tenham sido identificadas, registre o laser para escanear a partir do plano de foco superior para detectar as camadas superior e inferior dessas células. Observação : modelos 3D são gerados e salvos como arquivos .oir.</li>
</ol>5. Análise de espectros e imagens
<ol><li>Análise de espectros<ol><li>Use o software Origin ou outros aplicativos relevantes para subtrair o espectro de fundo de todos os espectros de destino subcelulares.</li>
		<li>Use as operações de modelagem matemática do MATLAB para processar os espectros Raman com as funções integradas do software. Python também pode ser usado para processamento de espectros.<ol><li>O pré-processamento espectral começa com a conversão dos arquivos em uma matriz. Os espectros são interpolados a cada centímetro recíproco.</li>
			<li>Para validação, represente graficamente os dados brutos. Execute a correção de linha de base nos espectros brutos usando a função interna msbackadj no MATLAB. Em resumo, a função interna estima os pontos da linha de base em valores de unidade de separação identificados pelos usuários e retorna a distância entre as janelas adjacentes. A partir dos pontos basais, estime e desenhe uma linha de regressão. Aplique Suavização para suavizar a linha de regressão para subtrair a linha de base de cada espectro bruto individual.</li>
			<li>Realizar a normalização min-max dividindo a intensidade Raman da proteína a 2.930 cm-1 pela intensidade de cada deslocamento Raman. O sinal de 2.930 cm-1 é tipicamente a maior intensidade no espectro Raman. Com essa normalização, o valor máximo é transformado em 1, enquanto o valor mínimo é transformado em 0. Todos os outros valores são transformados em um decimal entre 0 e 1.</li>
			<li>Faça a média dos espectros individuais da mesma condição em um único espectro para reduzir o ruído.</li>
		</ol></li>
		<li>Uma vez processado, use aplicativos, como o Origin, para exibir todos os espectros simultaneamente. Os picos exibidos nos espectros representam uma ligação química específica ou grupo funcional.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de imagens 3D de gotículas lipídicas<ol><li>Use o software FIJI-ImageJ para processar todas as imagens 3D</li>
		<li>Execute as funções Filtros de passagem de banda e Suavização para as pilhas de imagens 3D.</li>
		<li>Para análise de imagens 3D, atribua cada gota lipídica a um escore esférico calculado medindo-se a distância entre seu centro de massa e a superfície. Compare cada escore esférico com um escore esférico de uma esfera perfeita no mesmo plano euclidiano. Descarte gotículas lipídicas com baixos escores esféricos e avalie as gotículas lipídicas remanescentes quanto ao seu volume e contagens.</li>
		<li>Analisar o volume e a contagem de gotículas lipídicas entre diferentes tratamentos para obter significância estatística em um software estatístico apropriado. Aqui, o GraphPad Prism foi usado.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de imagens hiperespectrais 2D<ol><li>Use o software FIJI-ImageJ para processar todas as imagens hiperespectrais 2D.</li>
		<li>Selecione o canal de 2.930 cm-1 para criar uma imagem de máscara que contenha valores 0 e 1. Atribua o plano de fundo a 0 e a região celular a 1.</li>
		<li>Subtrair o canal de proteína marcada com deutério (2.175 cm-1) para o canal de fundo (1.900 cm-1) para remover os efeitos fluorescentes.</li>
		<li>Divida o canal de proteína marcada com deutério resultante pelo canal de proteína (2.930 cm-1) para obter imagens ratiométricas da taxa de turnover proteico.</li>
		<li>Em seguida, multiplique a imagem da máscara feita na etapa 5.3.2 pelas imagens ratiometric para remover quaisquer ruídos de fundo restantes. Como resultado, um fundo escuro é gerado em cada imagem ratiométrica.</li>
		<li>Use a ferramenta Freehand Selection no FIJI-ImageJ para segmentar e calcular manualmente as intensidades de pixel exibidas em células individuais. As intensidades de pixel correspondem às concentrações da ligação química que está sendo visualizada.</li>
		<li>Analise as intensidades de pixel para obter significância estatística em um aplicativo de software estatístico apropriado. Aqui, o GraphPad Prism foi usado. Repita essa análise com o restante da análise ratiométrica.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+metabolic+dynamics+in+aging+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila.</a> Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).</li>
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<li>Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-SRS+imaging+of+diet+regulated+metabolic+activities+in+Drosophila+during+aging+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes.</a> Aging Cell. 21 (4), e13586(2022).</li>
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<li>Rysman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+lipogenesis+protects+cancer+cells+from+free+radicals+and+chemotherapeutics+by+promoting+membrane+lipid+saturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation.</a> Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).</li>
<li>Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lipid+class+homeostasis+is+altered+under+nutrient-deprivation+but+stable+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia.</a> BMC Cancer. 19 (1), 501(2019).</li>
<li>Thiam, A. R., Dugail, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-membrane+contact+sites+-+from+protein+binding+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function.</a> Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).</li>
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<li>Hoang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+resolution+DO-SRS+and+2PEF+imaging+of+metabolic+dynamics+regulated+by+L-methionine+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Biopsy+XXI%3A+Toward+Real-Time+Spectroscopic+Imaging+and+Diagnosis.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+A-PoD%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+metabolic+imaging+uncovers+sex-+and+diet-dependent+lipid+changes+in+aging+drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-molecular+hyperspectral+PRM-SRS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
<li>Chang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+cell+metabolism+and+lipid+production+in+3D+engineered+human+adipose+tissues+using+label-free+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy.</a> Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).</li>
<li>Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/</a> (2023).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

DO-SRS e 2PEF têm sido aplicados para investigar a dinâmica metabólica em vários modelos ex vivo, incluindo Drosophila e tecidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. A modalidade de imagem usada neste estudo integra a microscopia DO-SRS e 2PEF, que pode superar outros métodos de imagem esp...

Sendo aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs), fenilalanina (Phe) e triptofano (Tryp) podem ser absorvidos pelo organismo humano para sintetizar novas moléculas para sustentar funções biológicas normais1. Phe é necessário para a síntese de proteínas, melanina e tirosina, enquanto Tryp é necessário para a síntese de melatonina, serotonina, e niacina 2,3. No entanto, o consumo excessivo desses AAAs pode regular o alvo mamífero da via da rapamicina (mTOR), inibir a proteína quinase ativada por AMP e interferir no metabolismo mitocondrial, alterando coletivamente a biossíntese de macromoléculas e levando à produção de precursores malignos, como espécies reativas de oxigênio (EROs) em células saudáveis 4,5,6. A visualização direta da dinâmica metabólica alterada sob regulação excessiva do AAA é essencial para entender o papel dos AAA na promoção do desenvolvimento do câncer e do crescimento de células saudáveis 7,8,9.
Os estudos tradicionais de AAA baseiam-se na cromatografia gasosa (GC)10. Outros métodos, como a ressonância magnética (RM), têm resoluções espaciais limitadas, dificultando a análise celular e subcelular de amostrasbiológicas11. Recentemente, a dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) foi desenvolvida para elucidar o papel dos AAAs na síntese lipídica e proteica na proliferação do câncer com biomarcadores não invasivos12,13,14. No entanto, essa técnica ainda sofre com profundidades de imagem rasas, baixa resolução espacial e preparação extensa da amostra. Em nível celular, isótopos estáveis não tóxicos, como nitrogênio-15 e carbono-13, podem ser rastreados com imagens multiisótopos e espectrometria de massa de íons secundários em nanoescala para entender sua incorporação em macromoléculas. No entanto, esses métodos são destrutivos para amostras biológicas vivas15,16. A microscopia de força atômica (MFA) é outra técnica poderosa que pode visualizar a dinâmicametabólica17. A lentidão da varredura durante a aquisição de AFM, por outro lado, pode causar distorção da imagem do resultado da deriva térmica.
Desenvolvemos uma modalidade de imagem biortogonal não invasiva acoplando microscopia de espalhamento Raman estimulado sondado com óxido de deutério (D2O) e microscopia de fluorescência de excitação de dois fótons label-free (2PEF). Esta modalidade alcança alta resolução espacial e especificidade química na obtenção de imagens de amostras biológicas 18,19,20,21,22,23,24. Este protocolo introduz as aplicações de DO-SRS e 2PEF para examinar a dinâmica metabólica de lipídios, proteínas e alterações da razão redox durante a progressão do câncer. Sendo a D2O uma forma isotópica estável da água, as biomoléculas celulares podem ser marcadas com deutério (D) devido à sua rápida compensação com a água corporal total nas células, formando ligações carbono-deutério (C-D) através da troca enzimática21. As ligações C-D em macromoléculas recém-sintetizadas, incluindo lipídios, proteínas, DNA/RNA e carboidratos, podem ser detectadas na região silenciosa celular do espectro Raman 20,21,22,25,26,27. Com dois pulsos de laser sincronizados, ligações C-D de lipídios e proteínas recém-sintetizados podem ser exibidas em células individuais via imagem hiperespectral (HSI) sem extraí-las ou marcá-las com agentes citotóxicos. Além disso, a microscopia SRS tem a capacidade de construir modelos tridimensionais (3D) de regiões selecionadas de interesse em amostras biológicas, capturando e combinando um conjunto de imagens transversais22,26. Com imagens volumétricas hiperespectrais e 3D, DO-SRS pode obter distribuições espaciais de macromoléculas recém-sintetizadas em células únicas, juntamente com o tipo de organelas que facilitam o processo de promoção do crescimento do câncer sob regulação doAAA22. Além disso, usando 2PEF, podemos obter sinais de autofluorescência de Flavina e nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) com alta resolução, profundidade de penetração profunda e danos de baixo nível em amostras biológicas21,23,24. Sinais de autofluorescência de flavina e NADH têm sido utilizados para caracterizar a homeostase redox e a peroxidação lipídica em célulascancerosas22,26. Como tal, não só o acoplamento de DO-SRS e 2PEF fornece análise subcelular da dinâmica metabólica regulada por AAA em células cancerosas com alta distribuição espacial, informações de especificidade química e preparação mínima de amostras, mas o método também reduz a necessidade de extrair ou rotular moléculas endógenas com reagentes tóxicos. Neste protocolo, apresentamos primeiramente os procedimentos de preparação de D2O e aminoácidos, bem como cultura de células cancerígenas. Em seguida, mostramos os protocolos de imagem DO-SRS e imagem por 2PEF. Finalmente, apresentamos os resultados representativos da imagem SRS e 2PEF, que demonstram alterações metabólicas de lipídios e proteínas reguladas por AAA e alterações na razão redox em células cancerosas. Uma ilustração detalhada do processo é destacada na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Pipetas sorológicas de 10 mL&nbsp;</td><td>Avantor (by VWR)</td><td>75816-100</td><td>https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónico de 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664</td></tr><tr><td>16% de formaldeído, sem metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906</td></tr><tr><td>placa</td> <td>de 24 poçosFiltro</td> de Seringa <td>Fisherbrand FB0112929</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929</td></tr><tr><td>25 mm, 2 &mu; m PES Foxx</td><td>Life Sciences</td><td>381-2216-OEM</td><td>https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003</td></tr><tr><td>460 nm Cubo de Filtro</td><td>Olympus</td><td></td><td>OCT-ET460/50M32</td></tr><tr><td>Adaptadores CA da Fonte de Alimentação para LD OBIS 6 Laser Remoto</td><td>Olympus</td><td></td><td>Forneça energia para o laser</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>Terminador BNC 50 Ohm&nbsp;</td><td>Mini Circuitos</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>Cabo BNC</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>Cabo Coaxial, BNC Macho/Macho</td></tr><tr><td>Espelho Dielétrico de Banda Larga</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>Condensador Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura</td><td>Corning</td><td>2850-25</td><td>Fonte de</td></tr><tr><td>alimentação DC</td> https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 <td>TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent</td><td>mpbio&nbsp;</td><td>196055</td><td>https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf</td></tr><tr><td>Águia Modificada de Dulbecco' s Meio sem Metionina, Treonina e Piruvato de Sódio</td><td>MilliporeSigma</td><td>38210000</td><td>https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder Com Bicarbonato de Sódio e sem Metionina, Treonina e Piruvato de Sódio&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium</td><td>Corning</td><td>MT10027CV</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>Versão 1.53t 24 de agosto de 2022</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Água Pesada (Óxido de Deutério)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>7732-18-5</td><td>https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L</td></tr><tr><td>Hela Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>https://www.atcc.org/products/ccl-2</td></tr><tr><td>Hemocímetro</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z359629-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB& gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda de alto diâmetro externo</td><td>Chroma Technology</td><td>ET890/220m</td><td>Filtre o feixe de Stokes e transmita o feixe da bomba</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH300880340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340</td></tr><tr><td>HyClone Tripsina 0,25% (1x) Solução</td><td>Cytiva</td><td>SH30042,02</td><td>https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445</td></tr><tr><td>Sistema de Laser SRS Integrado</td><td>Física Aplicada & Eletrônica, Inc.</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD fornece um pulso de saída a 1031 nm com largura de pulso de 6 ps e taxa de repetição de 80 MHz, que serve como feixe de Stokes. O feixe de frequência dobrada a 532 nm é usado para semear de forma síncrona um oscilador paramétrico óptico de picossegundo (OPO) para produzir um trem de pulso bloqueado por modo com largura de pulso de cinco ~ 6 ps (o feixe intermediário do OPO é bloqueado com um filtro interferométrico). O comprimento de onda de saída do OPO é ajustável a partir de 720&ndash; 950 nm, que serve como feixe da bomba. A intensidade do feixe de Stokes de 1031 nm é modulada senoidalmente por um EOM embutido a 8 MHz com uma profundidade de modulação de mais de 90%. O feixe da bomba é espacialmente sobreposto ao feixe de Stokes usando um espelho dicróico dentro do picoEMERALD. A sobreposição temporal entre a bomba e os pulsos de Stokes é alcançada com um estágio de atraso embutido e otimizada pelo sinal SRS de D2O puro no microscópio.</td></tr><tr><td>Microscópio de varredura a laser invertido</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>IX3-CBH Caixa de controle</td><td>Olympus</td><td></td><td>Controle o microscópio de varredura a laser</td></tr><tr><td>Montagem de espelho cinemático</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 Ajustadores hexagonais de baixo perfil</td></tr><tr><td>L-fenalinina</td><td>Sigma</td><td>P5482-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482</td></tr><tr><td>L-Triptofano</td><td>Sigma</td><td>T8941-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941</td></tr><tr><td>LabSpec 6</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/</td></tr> <tr><td>Amplificador Lock-In</td><td>Zurich Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier</td></tr><tr><td>Divisor de feixe dicróico de longa duração</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 nm laser BrightLine dicroico de borda única a laser-divisor de feixe dicroico plano</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Versão: R2022b</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html</td></tr><tr><td>lâminas de microscópio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-003</td><td>Software de</td></tr><tr><td>Microscopia de Imagem</td> https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 <td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>MPLN 100x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[foco]=cmsContent11364</td></tr><tr><td>MPLN 50x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON&nbsp;</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[foco]=cmsContent11363</td></tr><tr><td>Condensador de Óleo NA</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>6-U130</td><td>https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser</td></tr><tr><td>Esmalte</td><td>Wet n Wild</td><td>B01EO2G5O4</td><td>https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0</td></tr><tr><td>Origem</td><td>OriginLab</td><td>Origem 2022b (9.95)</td><td>https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782</td></tr><tr><td>PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)</td><td>Thermofischer - Gibco</td><td>14040117</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117</td></tr><tr><td>Termofischer de Penicilina/Estreptomicina</td><td>- Gibco</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Montagem de Periscópio</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>Inclui as unidades superior e inferior, &Oslash; Poste de 1" e garfo de fixação.</td></tr><tr><td>Sistema picoEmerald</td><td>A.P.E</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ <tr><td>Caixa blindada com conectores BNC</td> Caixa de alumínio <td>Pomona Electronics</td><td>2902</td> com tampa, detector de fotodiodo <td>BNC fêmea/fêmea Si Espaçadores</td></tr> de <tr><td>wafer</td><td></td><td></td><td></td>de silício</tr><tr><td></td> da série <td>N/A</td><td>DYI</td><td>construídos em casa</td></tr><tr><td>Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>654008</td><td>https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/</td></tr> <tr><td>Espectroscopia Raman espontânea</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/</td></tr> <tr><td>Microscopia de Espalhamento Raman Estimulada</td><td>Home Built</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Touch&nbsp; Controlador de Painel</td><td>Olympus</td><td></td><td>Controle a direção X-Y do microscópio de varredura a laser</td></tr><tr><td>Azul de Tripano 0,4% (0,85% NaCl)&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Kaverme - Amazon</td><td>B07RNVXXV1</td><td>https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"</td></tr><tr><td>Microscopia de Fluorescência de Excitação de Dois Fótons</td> Papel de Pesagem <td>N/A</td><td></td><td>Construído em Casa</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td></td></tr><tr><td>https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper Zurich LabOneQ Software</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>Controla o amplificador de bloqueio Zurich</td></tr></tbody></table>

imagem química bioortogonal do metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs) são blocos de construção para sintetizar novas biomassas em células e sustentar funções biológicas normais. Por exemplo, um suprimento abundante de AAAs é importante para que as células cancerosas mantenham seu rápido crescimento e divisão. Com isso, há uma demanda crescente por uma abordagem de imagem altamente específica, não invasiva, com preparação mínima da amostra para visualizar diretamente como as células aproveitam os AAAs para seu metabolismo in situ. Aqui, desenvolvemos uma plataforma de imagem óptica que combina sondagem de óxido de deutério (D2O) com espalhamento Raman estimulado (DO-SRS) e integra DO-SRS com fluorescência de excitação de dois fótons (2PEF) em um único microscópio para visualizar diretamente as atividades metabólicas das células HeLa sob regulação AAA. Coletivamente, a plataforma DO-SRS fornece alta resolução espacial e especificidade de proteínas e lipídios recém-sintetizados em unidades únicas de células HeLa. Além disso, a modalidade 2PEF pode detectar sinais de autofluorescência de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e Flavina de forma livre de marcação. O sistema de imagem aqui descrito é compatível com modelos in vitro e in vivo , o que é flexível para vários experimentos. O fluxo de trabalho geral deste protocolo inclui cultura celular, preparação de meios de cultura, sincronização celular, fixação celular e imagem de amostra com as modalidades DO-SRS e 2PEF.

A adição do excesso de AAAs em concentrações de 15x aos meios de cultura celular contendo 50% D2O produziu bandas Raman C-D distintas de lipídios e proteínas recém-sintetizados em células HeLa (Figura 2B). Experimentos anteriores foram realizados com diferentes níveis de concentração, como 2x e 5x, e embora os dados não sejam apresentados, a concentração de 15x produziu as mais distintas bandas Raman C-D de lipídios e proteínas recém-sintetizados. Especificamente, investigando got...

Apresentamos um protocolo para visualizar diretamente as atividades metabólicas em células reguladas por aminoácidos usando microscopia Raman estimulada de espalhamento Raman estimulado com óxido de deutério (água pesada D2O) (DO-SRS), que é integrada à microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (2PEF).

Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Apresentamos uma nova técnica de imagem com capacidade livre de marcação, alta especificidade química e resolução subcelular. Nossa metodologia pode responder a uma pergunta sobre disfunção metabólica no envelhecimento e doenças como câncer A imagem Raman, juntamente com fluorescência de dois fótons e segunda geração harmônica, oferece uma tecnologia de imagem não destrutiva e livre de rótulos que requer preparação mínima da amostra e alcança alta resolução subcelular sem danificar a amostra celular. Várias modalidades de imagem são operadas como parte de nossa plataforma.Os indivíduos devem seguir nosso protocolo da melhor forma possível, observando que nosso sistema é construído em casa. Ao longo do caminho, eles devem desenvolver sua própria prática para garantir o sucesso. Em dois tubos separados, comece medindo e misturando 10 miligramas de pó DMEM com 4,7 mililitros de água bidestilada em um tubo cônico de 15 mL.Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Para ambos os tubos, adicionar 4,7 mL de óxido de deutério, 0,5 mL de SFB e 0,1 mL de penicilina e estreptomicina antes de vórtex e inversão do tubo. Em seguida, adicione o excesso de fenilalanina a um tubo e o excesso de triptofano em pó ao segundo tubo e misture novamente.Adicionar metionina e treonina a 30 e 95 mg por mL, respectivamente, a ambos os tubos, seguido de vórtice e inversão do tubo. Em seguida, filtrar o meio preparado com um filtro de seringa de 25 milímetros com filtros de 0,22 micrômetros. Selar todos os meios contidos em tubos cônicos com Parafilm.Armazenar mídia preparada a quatro graus Celsius. Manter as células cicatrizantes em um frasco de cultura usando DMEM padrão suplementado com 10% FBS, 1% penicilina e estreptomicina. Subcultivar as células cicatrizantes em uma proporção dividida de um para 10 até atingir 80% ou mais de viabilidade celular.Antes da semeadura das células, submergiu-se a tampa esterilizada de Poli-D-lisina, revestida de laminina, redonda de 12 mm de diâmetro em etanol 70%. Seque as lamínulas da tampa usando lenços sem fiapos e coloque as lamínulas limpas nos poços apropriados da placa. Lave as células uma vez com PBS sem íons magnésio e cálcio.Adicionar 0,25% de tripsina para dissociar as células de aderência do frasco e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante três minutos. Em seguida, adicione DMEM suplementado com 10% FBS, 1% penicilina e estreptomicina às células. Pipetar suavemente para cima e para baixo.Recolher as células por centrifugação a 300 G durante três minutos à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspender as células em DMEM suplementado com SFB a 0,5% e penicilina e estreptomicina a 1%. Conte as células coradas com azul de tripano usando um hemocitômetro sob um microscópio de luz e semente a uma densidade de duas vezes 10 a quinta células por poço de uma placa de 24 poços.Distribua as células uniformemente, agitando a placa suavemente. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após oito horas, substituir o meio de cultura antigo por óxido de deutério a 50% e fenilalanina em excesso ou óxido de deutério a 50% e excesso de triptofano.Devolver as células à incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante 36 horas. Agora prepare lâminas de microscópio com espaços de imagem de nove mm de diâmetro. Coloque 15 microlitros de PBS, suplementado com íons cálcio e magnésio e lave as células com a mesma solução.Adicionar 0,5 mL de solução de paraformaldeído sem metanol a 4% e deixar a placa sob a capa de biossegurança por 15 minutos. Aspirar a solução de paraformaldeído e enxaguar com PBS, suplementado com cálcio e magnésio ferro duas vezes. Adicione um mL de PBS, suplementado com íons cálcio e magnésio a cada poço.Utilize pinças estéreis para remover as lamínulas de cada poço com cuidado. Inverta-os e coloque a célula que contém o lado sobre os espaços de imagem em contato com o PBS. Sele a camada externa da tampa com o espaçador de imagem usando esmalte transparente.Coloque a amostra biológica no porta-amostras diretamente abaixo da lente objetiva. Em seguida, clique no ícone da câmera no software para ligar a câmera de vídeo e ajustar o plano de foco para identificar uma região de interesse com a lente objetiva de 50X. Mude para a lente objetiva de 100X.Clique no ícone de parada para desligar a câmera de vídeo. Em seguida, selecione uma grade de 1.800 linhas por mm e defina a faixa de aquisição de 400 a 3.150 centímetros inversa. Por fim, defina o tempo de aquisição para 90 segundos, o acúmulo para três e o binning para quatro para o espectro menos ruído e mais preciso.Clique em iniciar para aquecer o laser. Comece pressionando o interruptor principal da caixa de controle IX3CBH para On, seguido pelo interruptor principal do controlador do painel de toque. Em seguida, ligue o interruptor principal do adaptador CA da fonte de alimentação para LDOBIS6 controle remoto a laser conectado ao pente principal do combinador a laser FV31S.Ligue também o adaptador CA da fonte de alimentação remota a laser LDOBIS6 conectada ao pente do combinador sublaser FV31S. Depois disso, pressione os interruptores principais do detector de fotodiodo SI e ligue o amplificador de bloqueio. Ajuste o laser IR em 1031 nanômetros Ajuste o sistema pico esmeralda para um comprimento de onda ajustável entre 720 e 990 nm.Monte a amostra sobre o óleo e coloque uma gota de água grande na lâmina do microscópio onde a amostra é fixada. Selecione o tamanho da digitalização como 512 por 512 pixels. Adquira e salve as imagens como um Olimpo.Arquivo gráfico OIR. Depois de definir o sinal para 862.0, adquira uma imagem de fundo e salve-a. Ajuste o tempo de permanência para oito microssegundos por pixel e o tamanho do pixel para 512 por 512 pixels.Defina o parâmetro de potência do obturador a laser para 150 miliwatts Para reconstrução de imagem 3D, ajuste a perda Raman estimulada para 2.850 cm inversamente. Uma vez que as células individuais desejadas tenham sido identificadas, registre o laser para escanear a partir do plano de foco superior para detectar as camadas superior e inferior dessas células. O espalhamento Raman estimulado por óxido de deutério, sondado e estimulado, foi usado para visualizar a distribuição espacial dos sinais de CD em células isoladas.As células controle apresentaram moderadas bandas de CD, lipídios e proteínas. No entanto, a viagem 15 x v e 15 x exibiu proibições mais fortes de lipídios e proteínas da DC. A análise quantitativa indicou que o excesso de aminoácidos aromáticos pode aumentar a síntese lipídica em 10 a 17%, mas diminuir a síntese proteica em 10%A análise métrica das células tratadas com aminoácidos aromáticos mostrou um aumento de 50% na flavina dividida por flavina mais NADH e um aumento de 10% no lipídio insaturado dividido pelo lipídio saturado.A projeção do volume de gotículas lipídicas Raman 3D estimulada em células cicatrizantes sob controle e condições de excesso de aminoácidos aromáticos são mostradas. Análises quantitativas de gotículas lipídicas 3D mostraram um aumento na contagem, mas uma redução no tamanho nas células tratadas com aminoácidos aromáticos em comparação com o controle. Os parâmetros de imagem para imagens Raman e fluorescentes de dois fótons devem ser otimizados de uma amostra para outra para garantir a melhor qualidade de imagem.Os indivíduos podem acoplar nosso sistema com a segunda geração harmônica para estudar a estrutura do colágeno, que elucida as alterações metabólicas precoces no envelhecimento e nas doenças, e entender a progressão da neurodegeneração ou do câncer. Nossa tecnologia é a primeira desse tipo a visualizar a síntese de lipídios e proteínas em sistemas biológicos com alta resolução subcelular. A tecnologia também pode ser traduzida para a clínica para detecção de doenças não invasivas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

13 C-isótopo rotulagem é uma técnica útil para determinar o metabolismo da célula central para vários tipos de microorganismos. Depois que as células foram cultivadas com um substrato específico rotulados, GC-MS medição pode revelar vias metabólicas funcionais com base em padrões de rotulagem única no proteinogénicos aminoácidos.

Confirmação via metabólica e descoberta através 13 C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Este protocolo apresenta um ensaio de captação de aminoácidos radiomarcado, que é útil para avaliar o consumo de aminoácidos em células primárias ou em ossos isolados.

Avaliação do Consumo de Aminoácidos em Células Ósseas Cultivadas e Eixos Ósseos Isolados

O ensaio de fluxo metabólico celular em tempo real mede a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular, que corresponde à produção de triptosfato de adenosina mitocondrial e glicolítico, usando sensores de pH e oxigênio. O manuscrito explica um método para compreender o estado energético dos osteoblastos e a caracterização e interpretação do estado bioenergéstico celular.

Usando o analisador de fluxo metabólico de células em tempo real para monitorar bioenergetics osteoblast

Este protocolo descreve imagens de fluorescência e análise das aconzyomas metabólicas endógenas, dinucleotídeos de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeos (NAD(P)H) e dinucleotídeo de adenina de flavina oxidada (FAD). A imagem de autofluorescência de NAD(P)H e FAD fornece um método sem rótulos e não destrutivo para avaliar o metabolismo celular.

Imagem de autofluorescência para avaliar o metabolismo celular

Aqui, apresentamos um protocolo usando hibridização in situ de fluorescência infravermelha óptica (OPTIR-FISH), também conhecida como FISH fototérmica de infravermelho médio (MIP-FISH), para identificar células individuais e entender seu metabolismo. Essa metodologia pode ser amplamente aplicada para diversas aplicações, incluindo o mapeamento do metabolismo celular com resolução de célula única.

Hibridização In Situ de Fluorescência Infravermelha Óptica Fototérmica (OPTIR-FISH)

Utilizando uma plataforma multimodal que combina modalidades de imagem óptica sem rótulo, desenvolvemos um protocolo para visualizar e quantificar a dinâmica e o metabolismo celular. Por meio de imagens via fluorescência multifotônica, geração de segundo harmônico e microscopia de espalhamento Raman estimulada, podemos gerar uma visão holística do ambiente celular e molecular.

Plataforma de imagem óptica multimodal para estudar o metabolismo celular

Este protocolo integra um sistema de biorreator personalizado com espectroscopia de RMN ¹³C hiperpolarizada para medir o metabolismo do piruvato em tempo real em células vivas, melhorando a reprodutibilidade e a precisão cinética para estudos metabólicos e aplicações de triagem de medicamentos.

Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C

Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia micro computadorizada (TC).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Aprenda uma técnica de imagem bioortogonal para visualizar o metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos. Este método combina microscopia Raman e fluorescência para análise em alta resolução subcelular.

Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos

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