Name: Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a gerar esferoides tumorais 3D padronizados para avaliação de fármacos usando imagem de alta vazão e análise por deep learning. Este método aumenta a precisão dos testes com AMG510 em NCI-H23.

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Agradecemos a todos os membros de nossos laboratórios por suas contribuições críticas e sugestões. Esta pesquisa foi apoiada pelo Projeto Chave da Comissão de Saúde de Jiangsu (K2019030). A conceituação foi conduzida por C.W. e Z.C., a metodologia foi realizada por W.H. e M.L., a investigação foi realizada por W.H. e M.L., a curadoria dos dados foi realizada por W.H., Z.Z., S.X. e M.L., a elaboração do rascunho original foi realizada por Z.Z., J.Z., S.X., W.H., e X.L., a revisão e edição foi realizada por Z.C., a administração do projeto foi realizada por C.W. e Z.C., e a aquisição de financiamento foi conduzida por C.W. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

1. Construção esferoide
<ol><li>Tratamento antiaderente da placa de cultura<ol><li>Pipetar 100 μL de reagente antiaderência em cada poço de uma placa de 48 poços com fundo de poço em forma de U e manter por 10 min. Após 10 min, aspirar o reagente de revestimento e lavar duas vezes com PBS esterilizado.</li>
		<li>Colocar a placa de cultura em estufa (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2) até à sua utilização.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação, coleta e contagem de células<ol><li>Utilizar o meio de cultura específico das células para cultura das células em frascos de cultura celular (Tabela Suplementar 2). Por exemplo, células NCI-H23, CT-26 são cultivadas em RPMI 1640, e células HT-29 são cultivadas em meio McCoy's 5A. Esses dois meios são suplementados com 10% de SFB inativado pelo calor e 1% de P/S, respectivamente.</li>
		<li>Manter todas as células em condições de cultura padrão (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2) durante a proliferação. Aqui, a linha celular NCI-H23 é usada como exemplo nas etapas a seguir.</li>
		<li>Lavar as células cultivadas em frasco T25 duas vezes com 1x PBS para remover o meio de cultura (é melhor escolher células na fase logarítmica e passar as células em uma confluência de 80%-90%).</li>
		<li>Tratar as células expandidas com 1 mL de tripsina/EDTA a 0,25% por 1-2 min em incubadora a 37 °C, 5% CO2. Confirme a forma da célula (normalmente circular neste caso) ao microscópio e, em seguida, pare o tratamento com tripsina. Para isso, aspirar a suspensão de tripsina/EDTA utilizada no frasco T25 e lavar as células com 4 mL de meio fresco.</li>
		<li>Transfira toda a suspensão (5 mL) para um tubo de 15 mL. Use 1 mL de meio fresco para lavar as células residuais e adicioná-lo ao tubo. Centrifugar as células a 186,48 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Retirar o sobrenadante e adicionar 10 ml de meio fresco ao pellet celular, seguido de pipetagem suave até que as células estejam em suspensão homogénea.</li>
		<li>Aspirar 0,1 mL de suspensão celular em um novo tubo de centrífuga, adicionar 0,9 mL de meio fresco e, em seguida, pipetar bem a suspensão.</li>
		<li>Extrair 10 μL da suspensão celular para contagem celular. Realize esse processo duas ou três vezes e pegue um valor médio.</li>
		<li>Diluir a suspensão até atingir uma densidade final de semeadura de 50.000 células/mL, de acordo com a concentração obtida do processo de contagem celular na etapa 1.2.7.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura celular e formação de esferoides<ol><li>Adicionar 200 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de fundo em U de 48 poços.</li>
		<li>Enrole a película de vedação em torno da placa e centrifugue-a a 119,35 x g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire cuidadosamente a placa da centrífuga e retire a película protetora. Em seguida, adicione 5-8 mL de água esterilizada no canal de água ao redor dos poços (para evitar evaporação) e incube a 37 °C por 5 dias. Não troque/suplemente nenhuma água do canal de água durante o período.</li>
		<li>Observe a agregação celular durante os 5 dias seguintes. NOTA: Em geral, as células começam a se aglomerar como colônias dentro de 5 dias. No entanto, o processo de construção esferoide pode ser mais rápido ou mais lento com diferentes tipos celulares e densidades celulares. Devido a isso, as células devem ser observadas todos os dias usando um dos três métodos possíveis. Primeiro, as células podem ser observadas através do fundo da placa do poço. Quando as células ainda não formaram um esferoide, uma única camada de células pode ser vista na parte inferior. Quando as células formam um esferoide, uma construção 3D densa pode ser observada no fundo em U de cada poço. Outro método envolve a verificação das células sob um microscópio. Quando as células se tornam um esferoide tumoral, a construção envolve três camadas (uma camada proliferante, uma camada inativa e um núcleo necrótico, de fora para dentro do esferoide), que têm um gradiente de transparência. Finalmente, a cor do meio de cultura também pode ser usada para fins observacionais. Isso pode ser útil quando a estrutura de três camadas não pode ser claramente vista, mesmo usando um microscópio digital. Quando o meio passa de roxo-vermelho para amarelo, o processo de incorporação dos esferoides no gel pode começar. O meio não deve ser substituído durante o período de agregação celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporação de gel NOTA: Os géis precisam ser armazenados a uma temperatura inferior a -20 °C. Em particular, os géis devem ser colocados longe da porta do frigorífico para evitar flutuações de temperatura. Observe que os géis estão em um estado congelado nesta fase do processo.<ol><li>Retire o gel congelado da geladeira de -20 °C e coloque-o em uma caixa de gelo durante todo o tempo durante o experimento.</li>
		<li>Observe os esferoides celulares ao microscópio. Antes do início da incorporação do gel, o status dos esferoides deve ser novamente verificado com um microscópio digital.</li>
		<li>Retire cuidadosamente 150 μL do meio. A placa também deve ser colocada na caixa de gelo.</li>
		<li>Incorpore cada esferoide no gel adicionando o gel líquido lentamente do lado da parede do poço enquanto move a ponta da pipeta pré-resfriada ao redor e dentro do poço. Aguarde 5 min e, se o gel não se espalhar uniformemente, pipetar suavemente o gel com uma ponta de pipeta de 10 μL. Cada poço contém um esferoide tumoral, 25 μL de 3,5 mg/mL de gel e 50 μL de meio de cultura completo. Adicione 75 μL de meio aos controles também. NOTA: Cada poço contém um esferoide.</li>
		<li>Incubar a placa a 37 °C durante 30 minutos até que a hidrogelificação esteja totalmente concluída. Confirme o estado de gelificação ao microscópio.</li>
		<li>Sobrepor 125 μL do meio fresco em cada amostra.</li>
		<li>Cultivar os esferoides por mais 7-10 dias. Prepare grupos de esferoides com quatro a seis poços cada e escolha pelo menos três deles para análise. NOTA: Se estiver realizando um teste de drogas, prepare dois grupos para uma amostra. Um grupo é usado para testes de viabilidade, enquanto o outro é usado para captura e análise de imagens.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tratamento medicamentoso
<ol><li>Dissolva a droga de acordo com as instruções do fabricante. Prepare soluções de trabalho 100x com DMSO. Prepare pelo menos cinco doses do medicamento em diluição seriada. Aqui, o medicamento terapêutico para câncer de pulmão, AMG 510, é usado como exemplo. A composição é mostrada na Tabela Suplementar 1.</li>
	<li>Utilizar DMSO 0,1% como controle positivo.</li>
	<li>Adicionar 125 μL de meio tratado com droga a cada poço e colocar a placa de volta na incubadora (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2). Nesta fase, cada poço contém um esferoide tumoral, 25 μL de 3,5 mg/mL de gel e 175 μL do meio. Os controles contêm 200 μL do meio.</li>
</ol>3. Viabilidade esferoide
<ol><li>Meça a viabilidade do esferoide usando um kit de ensaio Alamar Blue de acordo com as diretrizes do fabricante. Medir a viabilidade utilizando um fotômetro de microplacas (absorbância a 570 nm e 600 nm) após o tratamento com Alamar Blue.</li>
	<li>Medir a viabilidade no dia 1, dia 4, dia 7 e dia 10 após a incorporação dos esferoides no gel, respectivamente, ou conforme indicado. NOTA: Ao usar um ensaio Alamar Blue, pelo menos 16 h de tempo de reação é necessário. Portanto, adicione 20 μL de Alamar Blue nas tardes do dia 0, dia 3, dia 6 e dia 9.</li>
	<li>Aspirar 100 μL do meio sobrenadante de cada poço para uma nova placa de ensaio e adicionar 80 μL de meio fresco a cada poço da placa de cultura. Em seguida, substitua mais 100 μL do meio tratado com a droga. Certifique-se de que não há restos de Alamar Blue no poço. NOTA: A substituição do meio é realizada em cada ocasião em que a viabilidade é testada, e o meio tratado com medicamentos dos grupos de análise de imagem precisa ser substituído no mesmo dia.</li>
</ol>4. Observação esferoide e análise de aprendizagem profunda através de imagens no teste de drogas
<ol><li>Imagiologia<ol><li>Aspirar 100 μL do meio para fora antes da aquisição de imagens.</li>
		<li>Coloque o prato no palco. Obter imagens digitais dos esferoides usando um microscópio automatizado com objetiva de 10x (objetiva de 2x primeiro). O microscópio pode focar e centralizar esses esferoides automaticamente. NOTA: A função de foco automático e o algoritmo utilizado foram previamente relatados por Yazdanfar et al.17.</li>
		<li>Aguarde a imagem automática. São adquiridas quatro imagens para cada esferoide. Uma imagem integrada é formada e processada com o software conectado ao sistema de imagem de alto conteúdo.</li>
		<li>Clique no botão "Processo de correção de imagem" e escolha as imagens integradas no software.</li>
		<li>Escolha "U-NET model" e digite a taxa de conversão (10x imagens objetivas têm uma taxa de conversão de 3,966). Clique na parte inferior da tela abaixo, para iniciar o processamento da imagem. Em seguida, salve os dados de diâmetro, perímetro e rugosidade no software de planilha.</li>
		<li>Calcule o índice de perímetro excedente (EPI). O EPI é a razão entre o perímetro esferoide (P 0) e o perímetro equivalente (Pe), calculado pela Eq. 1. Medir a área do esferoide no plano focal (S) usando a Imagem J. Em seguida, calcule o perímetro equivalente do esferoide usando a Eq. 2. EPI = (P o− P e)/Pe (Eq. 1) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65125/65125eq01.jpg" style="margin: auto;">(Eq. 2) NOTA: O perímetro esferoide é gerado pelo software com algoritmos de aprendizagem profunda baseados no modelo U-NET desenvolvido.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de meio fresco com o fármaco e colocar a placa de volta na incubadora (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>Inibição esferoide<ol><li>Calcular a inibição do crescimento tumoral (TGI) usando a Eq. 3. O volume esferoide relativo (RTV) é o volume terminal sobre o volume original (Eq. 4). O volume esferoide (V) é calculado automaticamente pelo software usando a Eq. 5 de acordo com a saída do diâmetro esferoide. TGI = (controle RTV −tratamento RTV)/controle RTV × 100% (Eq. 3) RTV =V terminal/Voriginal (Eq. 4) V = 4/3π(d/2)3 (Eq. 5) NOTA: O TGI é obtido com referência à inibição do crescimento in vivo , e os pesos do tumor são substituídos por RTV. O controle do RTV é o volume esferoide relativo do grupo controle, otratamento do RTV é o volume esferoide relativo do grupo do fármaco testado, o Vterminal é o volume do esferoide no último dia, o Voriginal é o volume do esferoide no primeiro dia de cultura e o d representa o diâmetro do esferoide.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li>
<li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li>
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<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
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<li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+The+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns%2C+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606(2018).</li>
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<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770(2021).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O microambiente desempenha um papel importante no crescimento tumoral. Pode afetar o fornecimento de matrizes extracelulares, gradientes de oxigênio, nutrição e interação mecânica e, assim, afetar a expressão gênica, as vias de sinal e várias funções das células tumorais19,20,21. Em muitos casos, as células 2D não produzem tais efeitos ou mesmo produzem efeitos opostos, afetando a avaliação dos tratamentos medicamentosos. No ent...

O câncer é uma das doenças mais temidas pelo ser humano, principalmente por sua alta taxa demortalidade1. Nos últimos anos, a possibilidade de tratamento do câncer tem aumentado à medida que novas terapias têm sido introduzidas2,3,4,5. Modelos in vitro bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) são usados para estudar o câncer em laboratório. No entanto, os modelos 2D não podem avaliar imediata e precisamente todos os parâmetros importantes que indicam sensibilidade antitumoral; portanto, não conseguem representar completamente as interações in vivo nos testes de terapia medicamentosa6.
Desde 2020, o mercado global de cultura tridimensional (3D) foi muito impulsionado. De acordo com um relatório da NASDAQ OMX, o valor global do mercado de cultura de células 3D excederá US$ 2,7 bilhões até o final de 2025. Comparada aos métodos de cultivo 2D, a cultura de células 3D apresenta propriedades vantajosas, que podem ser otimizadas não só para proliferação e diferenciação, mas também para sobrevivência a longo prazo 7,8. Por esse meio, microambientes celulares in vivo podem ser simulados para obter uma caracterização tumoral mais precisa, bem como o perfil metabólico, para que as alterações genômicas e proteicas possam ser melhor compreendidas. Devido a isso, os sistemas de teste 3D devem agora ser incluídos nas principais operações de desenvolvimento de medicamentos, especialmente aqueles com foco na triagem e avaliação de novas drogas antitumorais. Crescimentos tridimensionais de linhagens celulares estabelecidas imortalizadas ou culturas de células primárias em estruturas esferoides possuem características in vivo de tumores, como hipóxia e penetração de drogas, bem como interação, resposta e resistência celular, e podem ser considerados um modelo rigoroso e representativo para a triagem in vitro de fármacos9,10,11.
No entanto, esses modelos de cultura 3D também sofrem de vários problemas que podem levar algum tempo para serem resolvidos. Os esferoides celulares podem ser formados usando esses protocolos, mas diferem em certos detalhes, como tempo de cultura ou gel de incorporação12, de modo que esses esferoides celulares construídos não podem ser bem controlados sob uma faixa de tamanho restrita. O tamanho dos esferoides pode influenciar a consistência do teste de viabilidade e da análise de imagem. Os microambientes de crescimento e os fatores de crescimento também variam, o que pode levar a diferentes morfologias devido a diferenças na diferenciação entre as células13. Existe agora uma necessidade óbvia de um método padrão, simples e custo-efetivo para a construção de todos os tipos de tumores com tamanhos controlados.
Em outra perspectiva, embora ensaios homogêneos e abordagens de imagem de alto conteúdo tenham sido desenvolvidos para avaliar morfologia, viabilidade e taxa de crescimento, a triagem em larga escala de modelos 3D permanece um desafio por várias razões relatadas na literatura, como a falta de uniformidade na posição, tamanho e morfologia dos esferoides tumorais14,15,16.
No protocolo aqui apresentado, listamos cada etapa da construção de esferoides tumorais 3D e descrevemos um método de observação e análise esferoide usando um sistema de imagem de alto rendimento e alto conteúdo que envolve foco automático, autoimagem e análise, entre outras características vantajosas. Mostramos como este método pode produzir esferoides tumorais 3D de tamanho uniforme que são adequados para imagens de alto rendimento. Esses esferoides também demonstram uma alta sensibilidade ao tratamento medicamentoso do câncer, e alterações morfológicas nos esferoides podem ser monitoradas usando imagens de alto conteúdo. Em resumo, demonstramos a robustez desta metodologia como meio de gerar construtos tumorais 3D para fins de avaliação de fármacos.

<table><tbody><tr><td>0,5-10 &mu; L Ponteiras de pipeta</td><td>AXYGEN</td><td>T-300</td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; mL Microtubos à prova de fervura</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&mu; L Ponteiras de pipeta</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo de centrífuga</td><td>Nest</td><td>601052</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pontas de pipeta</td><td>AXYGEN</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>gel 3D</td><td>Avatarget</td><td>MA02</td><td></td></tr><tr><td>Placa inferior em U de 48 poços</td><td>Avatarget</td><td>P02-48UWP</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga de 50 mL</td><td>Ninho</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Thermo</td><td>&nbsp; </td><td></td>Solução</tr><tr><td>de enxágue antiaderente</td> DAL1100 <td>STEMCELL</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Certificado FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Aladim</td><td>de água deionizada</td><td>W433884-500ml</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Excel software&nbsp;</td><td>Microsoft Office</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prisma sofware&nbsp;</td><td>Software GraphPad&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imager de alto conteúdo e sistema SMART</td><td>Avatarget</td><td>1-I01</td><td></td></tr><tr><td>Image J software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium-A Suplemento (100X)</td> <td>Gibco</td><td>51300-044</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina Sol</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Scientific Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>T25 Frasco</td><td>JET Biofil</td><td>TCF012050</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,25% (1X)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30042,01</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de esferoides tumorais 3d para estudos de avaliação de fármacos

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Nas últimas décadas, além das células cultivadas em monocamadas, esferoides tumorais tridimensionais têm sido desenvolvidos como uma ferramenta potencialmente poderosa para a avaliação de drogas antineoplásicas. No entanto, os métodos convencionais de cultura não têm a capacidade de manipular os esferoides tumorais de forma homogênea em nível tridimensional. Para abordar essa limitação, neste artigo, apresentamos um método conveniente e eficaz de construção de esferoides tumorais de tamanho médio. Adicionalmente, descrevemos um método de análise baseado em imagens usando software de análise baseado em inteligência artificial que pode escanear toda a placa e obter dados sobre esferoides tridimensionais. Vários parâmetros foram estudados. Usando um método padrão de construção esferoide tumoral e um sistema de imagem e análise de alto rendimento, a eficácia e a precisão dos testes de drogas realizados em esferoides tridimensionais podem ser dramaticamente aumentadas.

A Figura 1A,B mostra o processo de construção dos esferoides tumorais neste estudo. Primeiro semeamos as células em uma placa de fundo em U de 48 poços. Esta etapa é quase a mesma usada em cultura de células 2D. Mantivemos a placa em uma incubadora comum com água ao redor dos poços para que as células depositadas começassem a formar esferoides em um processo de auto-montagem. Em condições operacionais normais, a maioria dos tipos de esferoides tumorais foi completamente for...

Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Este protocolo demonstrou um método padronizado de construção de tumores tridimensionais de esferoides. E esta metodologia proporcionou uma análise de alto circuito e alto conteúdo de construções tumorais 3D. Usando um método padrão de construção esferoide tumoral e um sistema de imagem e análise de alto rendimento, a eficácia e a precisão dos testes de drogas formados em esferoides tridimensionais podem ser dramaticamente aumentadas.Neste protocolo, usamos AMG510 para tratar o esferoide NCI-H23 como exemplo. A partir do experimento, pudemos observar um efeito significativo da droga alvo cancerígena sobre os esferoides tumorais. Para começar, pipete 100 microlitros de reagente antiaderência em cada poço de uma placa de 48 poços com fundo de poço em forma de U e guarde por 10 minutos.Após 10 minutos, aspirar o reagente de revestimento e lavar duas vezes com PBS esterilizado. Coloque a placa de cultura em uma incubadora a 37 graus Celsius em ar umidificado com 5% de dióxido de carbono até o uso. Observe as células ao microscópio.Em seguida, lavar as células cultivadas em frasco T25 duas vezes com PBS para remover o meio de cultura e tratar as células expandidas com um mililitro de EDTA de tripsina a 0,25% por um a dois minutos em estufa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Confirme a forma da célula ao microscópio. E então interromper o tratamento com tripsina aspirando a suspensão de EDTA de tripsina usada no frasco T25 e lavando as células com quatro mililitros de meio fresco.Transfira toda a suspensão para um tubo de 15 mililitros e use um mililitro de meio fresco para lavar as células residuais e adicioná-lo ao tubo. Centrifugar as células a 186,48 G durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de meio fresco ao pellet de células e pipete suavemente até que as células estejam em uma suspensão homogênea.Aspirar 0,1 mililitros de suspensão celular em um novo tubo de centrífuga. Adicione 0,9 mililitros de meio fresco e, em seguida, pipetar bem a suspensão. Extrair 10 microlitros da suspensão celular para contagem celular.Repita esse processo uma ou duas vezes e obtenha um valor médio. Diluir a suspensão para atingir uma densidade de semeadura final de 50.000 células por mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de fundo em U de 48 poços.Embrulhe a película de vedação em torno da placa e centrifuja-a a 119,35 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, retire a película protetora e adicione de cinco a oito mililitros de água esterilizada no canal de água ao redor dos poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por cinco dias.Não troque ou suplemente nenhuma água para o canal de água durante este período e observe a agregação celular durante os cinco dias seguintes. Para a incorporação do gel, depois de retirar o gel congelado da geladeira de 20 graus Celsius negativos, coloque-o em uma caixa de gelo durante todo o tempo durante o experimento. Observe os esferoides celulares ao microscópio.Antes do início da incorporação do gel, o status dos esferoides deve ser verificado novamente. Remova cuidadosamente 150 microlitros do meio e incorpore cada esferoide no gel, adicionando lentamente o gel líquido do lado da parede do poço enquanto move a ponta da pipeta pré-resfriada ao redor e dentro do poço. Aguarde cinco minutos e, se o gel não se espalhar uniformemente, pipetar suavemente o gel com uma ponteira de pipeta de 10 microlitros.Cada poço contém um esferoide tumoral, 25 microlitros de 3,5 miligramas por mililitro de gel e 50 microlitros de meio de cultura completo. Adicione 75 microlitros de meio aos controles também. Incubar a placa a 37 graus Celsius durante 30 minutos até que a hidrogelificação esteja totalmente concluída.Confirme o estado de gelificação ao microscópio. Sobreponha 125 microlitros de meio fresco em cada amostra e cultive os esferoides por mais 7 a 10 dias. Prepare grupos de esferoides com quatro a seis poços cada e escolha pelo menos três deles para análise.Dissolva o medicamento de acordo com as instruções do fabricante e prepare soluções de trabalho 100 vezes com DMSO. Use DMSO 0,1% como controle positivo e adicione 125 microlitros de meio tratado com drogas a cada poço. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 graus Celsius em ar umidificado com 5% de dióxido de carbono.Nesta fase, cada poço contém um esferoide tumoral, 25 microlitros de 3,5 miligramas por mililitro de gel e 175 microlitros do meio. Os controles contêm 200 microlitros do meio. Meça a viabilidade do esferoide usando um kit de ensaio alamarBlue de acordo com as diretrizes do fabricante.Aspirar 100 microlitros do meio sobrenadante de cada poço para uma nova placa de teste. Em seguida, medir a viabilidade usando um fotômetro de microplacas. Meça-o no primeiro dia, no quarto dia, no sétimo dia e no 10º dia após a incorporação dos esferoides no gel.Adicione 80 microlitros de meio fresco a cada poço da placa de cultura. Em seguida, substitua mais 100 microlitros do meio tratado com o medicamento. Certifique-se de que não há restos de alamarBlue no poço.Aspirar 100 microlitros do meio antes da aquisição de imagens e colocar a placa no palco. Obter imagens digitais dos esferoides usando um microscópio automatizado com uma objetiva dez vezes. O microscópio pode focar e centralizar esses esferoides automaticamente.Aguarde a imagem automática. São adquiridas quatro imagens para cada esferoide. Uma imagem integrada é formada e processada com o software conectado ao sistema de imagem de alto conteúdo.Clique no botão de processo de correção de imagem e escolha as imagens integradas no software. Escolha o modelo U net e digite a taxa de conversão. Clique na parte inferior da tela para iniciar o processamento da imagem.Salve os dados de diâmetro, perímetro e rugosidade no software de planilha. Finalmente, adicione 100 microlitros de meio fresco com a droga e coloque a placa de volta na incubadora a 37 graus Celsius em ar umidificado com dióxido de carbono a 5%. As imagens de campo claro de esferoides celulares NCI-H23 tratados com diferentes concentrações de AMG510 e capturados automaticamente por um microscópio de alto conteúdo são mostradas nesta figura.As colunas representam dias diferentes e as linhas representam diferentes concentrações de drogas. Os resultados incluem três esferoides para cada condição. A viabilidade esferoide tumoral dos grupos de amostra tratados com AMG510 foi medida no primeiro dia, no quarto dia, no sétimo dia e no 10º dia.A viabilidade celular terminal das amostras com gradientes de concentração é mostrada nesta figura. Os diâmetros esferoides tumorais foram medidos no primeiro dia, no quarto dia, no sétimo dia e no 10º dia. A razão de crescimento esferoide foi definida como o volume terminal em relação ao volume original e calculada usando os diâmetros esferoides.A razão de inibição do crescimento esferoide foi definida em relação ao volume e calculada usando os diâmetros esferoides. A rugosidade tumoral foi medida pelo software no primeiro dia, no quarto dia, no sétimo dia e no 10º dia, indicando a invasividade dos esferoides tumorais. O perímetro do esferoide foi localizado e desenhado pelo software utilizando algoritmos de aprendizagem profunda.As áreas esferoides no plano focal foram então medidas pela imagem J e um índice de excesso de perímetro foi calculado com base nesses dados. Embora essa mensagem seja fácil de seguir, as amostras ainda precisam ser manuseadas com cuidado.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado.

Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Um protocolo para impressão robótica de esferoides de células cancerígenas em um formato de placa de 96 poços de alto rendimento usando um sistema aquoso de duas fases é apresentado.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Xenoenxertos derivados de pacientes de glioblastoma multiforme podem ser miniaturizados em microtumores vivos usando o sistema de cultura de biogel humano 3D. Este ensaio tumoral 3D semelhante ao in vivo é adequado para testes de resposta a medicamentos e perfis moleculares, incluindo análise cinômica.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.

Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Tomografia de coerência óptica (OCT), uma tecnologia de imagem tridimensional, foi usada para monitorar e caracterizar a cinética de crescimento de esferoides tumor multicelulares. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido livre de rótulo morto nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica, foram demonstradas.

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Modelos in vitro abrangentes que recapitulem fielmente a doença humana relevante estão em falta. O presente estudo apresenta a criação e cultura de spheróides tumorais tridimensionais (3D), uma ferramenta in vitro confiável para estudar a interação tumor-estrommal no carcinoma hepatocelular humano.

Um modelo esferoide tridimensional para investigar a interação tumoral-estroma em carcinoma hepatocelular

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Aprenda a gerar esferoides tumorais 3D padronizados para avaliação de fármacos usando imagem de alta vazão e análise por deep learning. Este método aumenta a precisão dos testes com AMG510 em NCI-H23.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

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