Name: Uso de Nicotina em Modelo de Camundongo Exposto à Sílica para Promover a Transição Epitélio-Mesenquimal Pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a criar um modelo de camundongo com exposição dupla a nicotina e sílica para estudar fibrose pulmonar e transição epitélio-mesenquimal. Este método reprodutível simula patologia pulmonar humana.

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Este estudo foi apoiado pelo Programa de Inovação de Sinergia Universitária da Província de Anhui (GXXT-2021-077) e pelo Fundo de Inovação de Pós-Graduação da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui (2021CX2120).

Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes emitidas pelo National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (a 8ª edição do NRC) e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui.
1. Preparo dos animais
<ol><li>Casa 32 camundongos C57/BL6 machos com 8 semanas de idade em laboratório com ciclo claro/escuro de 12 h. Certifique-se de que os ratos tenham livre acesso a comida e água.</li>
	<li>Após 2 semanas de aclimatação ao ambiente, quando os camundongos de 10 semanas pesam 23-26 g, utilizar números aleatórios gerados por computador para agrupar aleatoriamente os animais sem partição, resultando em quatro grupos de camundongos: grupo controle (Con), grupo nicotina (Nic), grupo sílica (SiO 2) e grupo nicotina combinada com sílica (Nic+ SiO2).</li>
</ol>2. Preparação da nicotina
NOTA: A densidade de nicotina é de 1,01 g/mL.
<ol><li>Dissolver a nicotina em etanol anidro e diluir 20x para preparar uma solução-estoque de nicotina de 50 mg/mL.</li>
	<li>Diluir a solução-mãe de nicotina 1.000x com soro fisiológico normal estéril para fazer uma solução de trabalho na concentração de 0,05 mg/mL. NOTA: Guarde a nicotina longe da luz. A solução-mãe pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.</li>
</ol>3. Preparação de sílica
<ol><li>Suspender a sílica cristalina estéril em solução salina para preparar uma suspensão de sílica de 20 mg/mL e oscilá-la em banho-maria de agitação ultrassônica por 25 min.</li>
	<li>Agitar a suspensão de sílica com um oscilador de vórtice por 3 minutos antes que os camundongos recebam o gotejamento nasal. Misture a suspensão de sílica pipetando para cima e para baixo 2x-3x com uma pipeta de 200 μL e, em seguida, tome 50 μL para o gotejamento nasal. NOTA: A suspensão de dióxido de silício deve ser misturada e administrada por gotejamento nasal o mais rápido possível.</li>
</ol>4. Captura de camundongos e exposição à nicotina
<ol><li>Pese os ratos e registre os pesos diariamente antes da exposição.</li>
	<li>Nos dias 1-40, injetar nicotina por via subcutânea duas vezes ao dia (intervalo de 12 h) nos camundongos dos grupos Nic e Nic+ SiO2 . Utilizar dose de nicotina de 0,25 mg/kg; Por exemplo, certifique-se de que um rato com 25 g de nicotina receba 6,25 μg de nicotina. Para este camundongo, o volume de injeção seria o seguinte: 6,25/0,05 = 125 μL. Simultaneamente, injetar os camundongos do grupo Con com um volume igual de solução salina.</li>
	<li>Prepare as seringas de 1 mL necessárias para cada grupo e use-as para aspirar o volume de injeção de nicotina ou soro fisiológico. Antes de tomar a nicotina, primeiro retire 0,1-0,2 mL de ar para dentro da seringa e, em seguida, retire 125 μL de nicotina. Bata cuidadosamente na seringa para encher a agulha e a extremidade frontal da seringa com a nicotina. Coloque a seringa contendo nicotina numa bandeja protegida da luz. NOTA: No momento da injeção, 0,1-0,2 mL de ar está situado atrás da nicotina, garantindo que todo o líquido seja administrado com sucesso ao camundongo.</li>
	<li>Segure a cauda do rato com a mão direita e, quando o animal relaxar, use o polegar e o indicador esquerdos para pressionar a pele na parte de trás do pescoço da cauda até a cabeça até a borda da orelha, aplicando pressão moderada. Depois disso, solte a mão direita e use o polegar pequeno esquerdo e o dedo anelar para beliscar a cauda e os membros posteriores, momento em que o mouse será completamente imobilizado pela mão esquerda. NOTA: Segure o mouse com a força apropriada. A força insuficiente facilita a mordida dos ratos, enquanto a força excessiva pode resultar na asfixia dos ratos.</li>
	<li>Usando a mão direita para injetar, puncione a pele na parte de trás do pescoço perto da borda da orelha dos ratos em uma direção cabeça-cauda com a seringa e injete com nicotina em uma taxa uniforme. Procure uma protuberância de pele semicircular que indique uma injeção bem-sucedida. NOTA: Quando a agulha perfurou a pele, haverá uma sensação de resistência; A resistência desaparece após a inserção da agulha. Neste ponto, a agulha precisa ser ligeiramente retirada para injetar lenta e uniformemente.</li>
</ol>5. Exposição à sílica in vivo
<ol><li>Nos dias 5-19, instilar a suspensão de dióxido de silício na cavidade nasal dos camundongos dos grupos SiO 2 e Nic+ SiO2. Anestesiar rapidamente cada camundongo com isoflurano a 2% em aparelho de anestesia na dose de 3,6 mL/h. Após a anestesia, coloque o mouse na palma de uma das mãos e exponha a cavidade nasal do camundongo. Instilar 50 μL de suspensão de sílica na cavidade nasal dentro de 4-8 s.</li>
	<li>Para permitir que a suspensão de sílica entre nos pulmões o mais rápido possível, após a instilação, pressione o coração do mouse suavemente com o dedo indicador por 3-5 s, 3x-5x por segundo, para promover sua frequência respiratória.</li>
	<li>Depois que a respiração do camundongo gradualmente se tornar uniforme, coloque o camundongo em uma gaiola para observar por 3 min.</li>
	<li>Para todos os ratos que recebem a suspensão de sílica, repita os passos 1-3. No grupo controle, instilar 50 μL de solução salina estéril na cavidade nasal nos dias 5-19.</li>
</ol>6. Aquisição de tecidos pulmonares frescos e fixos
<ol><li>No dia 41, usar 50 mg/kg de pentobarbital sódico para anestesiar os camundongos por via intraperitoneal na dose de 0,1 mL/20 g de acordo com o peso corporal. Fixe os membros em uma placa de teste de espuma e borrife o pelo com álcool 75%.</li>
	<li>Realizar perfusão cardíaca para obter tecido pulmonar fresco, cortar a linha média do abdome para expor a cavidade torácica e fazer uma pequena abertura no ápice do coração direito. Em seguida, injete 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-resfriada lenta e uniformemente a partir do ápice do coração esquerdo, fazendo com que o sangue flua para fora da abertura criada no ápice do coração direito. Retire todo o lóbulo pulmonar, coloque-o em um tubo de centrífuga de 1,5 mL pré-resfriado e transfira para -80 °C para armazenamento enquanto aguarda a extração da proteína.</li>
	<li>Perfundir outros camundongos com 20 mL de PBS pré-resfriado seguido de 10 mL de paraformaldeído a 4% no mesmo local para fixar pulmões inteiros; preservar cada pulmão em 30 mL de AGP a 4%.</li>
	<li>Após 72 h, embutir os tecidos pulmonares fixados em parafina.<ol><li>Imergir o tecido pulmonar no fixador preparado em banho-maria ultrassônico a 40 °C por 30 min, seguido de um processo de desidratação em etanol 75%, etanol 95% e etanol anidro por 50 min cada.</li>
		<li>Lave 2x com xileno por 50 min cada.</li>
		<li>Colocar o tecido em cera de parafina derretida a 55-60 °C durante 2-3 h para que o xileno no tecido pulmonar seja gradualmente substituído por cera de parafina.</li>
		<li>Fixe o tecido pulmonar na estrutura de incorporação com parafina e aguarde o endurecimento do bloco de cera. Depois que o bloco de cera endurecer, use a máquina de secção em parafina para cortar o pulmão a 4-5 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar os cortes pulmonares em água ultrapura a 45 °C. Uma vez derretida a parafina, carregue a seção pulmonar em uma lâmina de microscópio aderente.</li>
</ol>7. Coloração pela hematoxilina e eosina (HE)
<ol><li>Asse as lâminas a 60 °C por 2 h e coloque as lâminas em xileno para desencenar por 2 x 30 min. Em seguida, colocar as lâminas em etanol anidro, etanol 95%, etanol 85% e etanol 75% por 5 min cada. Finalmente, lave-os por 3 x 5 min com água ultrapura.</li>
	<li>Lançar 50 μL de solução corante de hematoxilina no tecido pulmonar com um pistolador de pipeta e corar por 5 min; Em seguida, lave as fatias com água corrente por 5 min.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de ácido clorídrico a 2% em etanol sobre a secção e enxaguar com água destilada durante 30 s. Em seguida, adicione 50 μL de solução corante de eosina no tecido pulmonar para corar por 1 minuto.</li>
	<li>Desidrate, transparenteize e sele as seções de parafina.<ol><li>Adicionar 100-150 mL de etanol 75%, etanol 85%, etanol 95%, etanol anidro e xileno em um tanque de tingimento plástico combinado. Coloque as lâminas em etanol anidro 75%, 85%, 95% e anidro por 5 min cada para desidratar.</li>
		<li>Em seguida, coloque as lâminas em xileno por 5 min para transparente.</li>
		<li>Finalmente, solte 20 μL de goma neutra na seção pulmonar e coloque uma lamínula sobre a lâmina para selá-la. NOTA: As etapas acima são realizadas à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Coloração de Masson
<ol><li>Desparafinar, hidratar e lavar as secções de parafina, conforme descrito no passo 7.1.</li>
	<li>Manchar os cortes com 50 μL de solução de coloração de hematoxilina de Weigert configurada por 7 min, seguido de 50 μL de solução de fracionamento de etanol ácido por 10 s, e lavar com água corrente para tornar os núcleos azuis.</li>
	<li>Manchar os cortes com 50 μL de solução tricrômico de Masson por 4 min e lavar com água.</li>
	<li>Lave as seções com água destilada por 1 min e, em seguida, core com ácido vermelho de Lichun magenta por 7 min.</li>
	<li>Lave as seções com uma solução de trabalho de ácido fraco (ácido clorídrico a 30%) por 1-2 min, solução de ácido fosfomolíbdico por 1-2 min e solução de trabalho de ácido fraco por 1-2 min.</li>
	<li>Manchar as secções em solução corante de azul de anilina durante 2 minutos e, em seguida, lavar com uma solução de trabalho de ácido fraco durante 1 minuto.</li>
	<li>Desidratar as seções com etanol 95% seguido de etanol anidro por 1 s, transparenteizar com xileno por 1 s e, finalmente, selar com resina neutra conforme descrito na etapa 7.4.</li>
</ol>9. Imuno-histoquímica
<ol><li>Asse as fatias a 60 °C por 6 h. Desparafinar, hidratar e lavar as secções de parafina, conforme descrito no passo 7.1.</li>
	<li>Recuperação de antígeno: coloque as fatias em uma caixa de corte de plástico resistente ao calor contendo solução de recuperação de antígeno citrato suficiente para submergir as fatias e ferva por 20-30 min.</li>
	<li>Resfriar até a temperatura ambiente, remover as seções e enxaguar com água deionizada. Em seguida, mergulhe por 2 x 5 min em PBS contendo 0,5% de Tween-20 (PBST).</li>
	<li>Desenhe um laço perto da seção pulmonar na lâmina com uma caneta hidrofóbica para formar um círculo hidrofóbico.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de solução de peróxido de hidrogênio a 3% (3%H 2 O2) gota a gota aos cortes, e incubar por 15 min à temperatura ambiente protegida da luz para a inativação da peroxidase endógena.</li>
	<li>Deixe as fatias de molho em PBST por 3 x 5 min.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de proteína de soro bovino (BSA)-PBST a 5% às fatias e bloquear por 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Eliminar a solução de bloqueio, adicionar 50 μL dos anticorpos primários diluídos CD206 (diluição: 1:1.500), TGF-β1 (diluição: 1:200) e vimentina (diluição: 1:2.000) gota a gota às fatias e incubar durante a noite a 4 °C. NOTA: Neste trabalho, todos os anticorpos foram diluídos em BSA a 5%.</li>
	<li>No dia seguinte, retornar as fatias à temperatura ambiente (40 min). Lavar as fatias conforme descrito no passo 9.6.</li>
	<li>Diluir o anticorpo secundário em BSA a 5%. Adicionar 50 μL de anticorpo secundário marcado com peroxidase de raiz forte (diluição: 1:500) gota a gota e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Lavar as fatias conforme descrito no passo 9.6.</li>
	<li>Lançar 50 μL da solução de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) correspondente ao anticorpo secundário marcado com enzima no tecido pulmonar e incubar por 5-10 min em uma caixa úmida imunoistoquímica preta. Observe ao microscópio até que a cor evolua para um marrom forte. Enxágue as fatias com água destilada para finalizar a reação. NOTA: A coloração marrom é considerada positiva.</li>
	<li>Corar com 50 μL de coloração de hematoxilina por 30 s, e lavar com água corrente. Em seguida, mergulhe as fatias em etanol anidro 75%, 85%, 95% e anidro por 3 min cada e depois em xileno por 2 x 10 min. Selar as lâminas conforme descrito na etapa 7.4.</li>
</ol>10. Análise de Western blot
<ol><li>Retire o tecido pulmonar do congelador e pese-o. Em seguida, adicionar 150 μL de tampão de lise RIPA contendo PMSF por 20 mg de tecido pulmonar. Lisar os pulmões de camundongos em gelo por 3-5 min usando um homogeneizador portátil, agitar suavemente por 2 h a 4 °C para permitir lise adequada do tecido pulmonar, centrifugar a 4 °C e 14.800 × g por 15 min e coletar o sobrenadante. NOTA: Adicione 100 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilfluoreto (PMSF) alguns minutos antes de usar o tampão de lise RIPA. A concentração final de PMSF é de 1 mM (por exemplo, 10 μL de PMSF + 990 μL de RIPA).</li>
	<li>Use um kit de concentração de proteína BCA para determinar a concentração de proteína da amostra seguindo as instruções do fabricante. Após a determinação, utilizando a menor concentração de lisado proteico como base, diluir o mesmo lote de lisado proteico com RIPA até à menor concentração para atingir a mesma massa e volume. NOTA: A quantidade total de carga de tecido pulmonar é de 30 μg.</li>
	<li>Adicionar 40 μL de tampão de carga 5x a 160 μL de lisado proteico e aquecer a 100 °C durante 10 min.</li>
	<li>Montar o gel preparado para eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE) no sistema de eletroforese por western blotting, adicionar o tampão de eletroforese SDS-PAGE, retirar suavemente o pente de eletroforese e adicionar 20 μL de amostra de proteína por poço lenta e uniformemente. Ligue a alimentação e inicie a eletroforese a 80 V por 30 min. Depois que as proteínas atingirem a camada inferior de gel, mude para 100 V e continue a eletroforese por 60-70 min. NOTA: A eletroforese necessita de novo tampão de eletroforese.</li>
	<li>Transferir as proteínas para uma membrana de PVDF por transferência úmida. Ativar a membrana de PVDF com metanol antecipadamente (5-30 s). Retire a placa de gel de eletroforese, abra-a cuidadosamente, coloque o gel separador no tampão de transferência úmido, faça o sanduíche de transferência elétrica e monte o sistema de transferência úmida. Encha o tanque de eletroforese com tampão de transferência e transfira a 400 mA por 90 min. NOTA: O buffer de transferência é resfriado com antecedência para evitar os efeitos de altas temperaturas durante a transferência úmida.</li>
	<li>Lavar a membrana de PVDF com solução salina tamponada com Tris com Tween-20 a 0,5% (TBST) por 3 x 5 min. Bloquear a membrana de PVDF com 5% de leite desnatado diluído em TBST e incubar em um agitador à temperatura ambiente por 60 min; em seguida, lave com TBST por 2 min. Após a lavagem, incubar a membrana durante a noite a 4 °C com o anticorpo primário vimentina (1:5.000) e GAPDH (1:10.000) diluídos em BSA a 5%.</li>
	<li>Coloque a membrana à temperatura ambiente por 30 min e lave com TBST por 5 x 5 min. Após a lavagem, incubar a membrana com o anticorpo secundário (1:10.000) diluído em leite desnatado a 5% por 60 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque a membrana, do lado da proteína para cima, solte a solução de trabalho preparada da ECL, incube por 1-2 minutos e observe os resultados com um imageador de gel. Use os valores de escala de cinza medidos pelo software no imageador de gel para avaliar os níveis de expressão de proteínas. NOTA: Aqui, o GAPDH serviu como referência interna.</li>
</ol>

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</ol>

Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Um modelo animal de dupla exposição é necessário para investigar o papel e os mecanismos potenciais da exposição simultânea à nicotina e ao dióxido de silício cristalino. Este modelo foi alcançado neste trabalho através da injeção subcutânea de nicotina e do gotejamento nasal de sílica. Para garantir uma injeção de nicotina bem-sucedida, o operador tem que se familiarizar com agarrar os ratos, pois agarrar a pele na parte de trás do pescoço pode ser doloroso para eles. Portanto, permitir que os ratos se adaptem gradualme...

A exposição à sílica em trabalhadores é inevitável em alguns ambientes ocupacionais e, uma vez expostos à sílica, a deterioração progride mesmo após a remoção do ambiente. Além disso, a maioria desses trabalhadores fuma, e os cigarros tradicionais contêm milhares de produtos químicos, sendo o principal componente viciante a nicotina1. Os cigarros eletrônicos estão se tornando cada vez mais populares nas faixas etárias mais jovens2; Esses cigarros eletrônicos atuam como um sistema de liberação de nicotina e aumentam o acesso à nicotina, aumentando a suscetibilidade pulmonar e a pneumonia3. A fumaça do cigarro também acelera a fibrose pulmonar em camundongos expostos à bleomicina4 e aumenta a toxicidade pulmonar e a fibrose em camundongos expostos à sílica 5,6. No entanto, ainda precisa ser investigado se a nicotina pode afetar o processo inflamatório e de fibrose pulmonar causado pela sílica.
O modelo de silicose em camundongos estabelecido pela inalação única de uma alta dose de sílica na traqueia é traumático para camundongos. Embora esse método forneça rapidamente um modelo de silicose, ele não corresponde à realidade de um ambiente onde os trabalhadores são repetidamente expostos à sílica. Portanto, estabelecemos um modelo de camundongo exposto à sílica dando repetidamente uma baixa dose de suspensões de sílica por gotejamento nasal; Esta dose pode causar inflamação e fibrose em ratinhos.
Para contornar os efeitos de outros componentes do cigarro, este modelo de camundongo foi injetado com nicotina por via subcutânea na pele frouxa do pescoço para determinar o efeito do componente aditivo, a nicotina, sobre a silicose. Através da administração de injeções subcutâneas, é possível obter uma dosagem precisa, tornando possível criar modelos de exposição à nicotina e observar as respostas dose-toxicidade, bem como a dependência. Um modelo de dependência de nicotina foi desenvolvido em camundongos machos, com uma dose de injeção de nicotina de 0,2-0,4 mg/kg 7,8. Nesse modelo, para atender às necessidades de busca de drogas dos camundongos viciados, duas injeções subcutâneas foram administradas em intervalos de 12 horas. Este modelo de dependência de nicotina em camundongos é útil para simular hábitos humanos de tabagismo e exposição à sílica.
Modelos animais de fator único têm limitações em estudos de doenças, enquanto o método descrito aqui envolve um modelo de camundongo de dois fatores de co-exposição à nicotina e à sílica. Antes da exposição à sílica, os camundongos foram pré-expostos à nicotina para replicar a exposição à nicotina em pessoas que fumam. Posteriormente, a exposição à sílica ocorreu do dia 5 ao dia 19 para imitar a exposição à sílica em um ambiente de trabalho para indivíduos com história de tabagismo.
Macrófagos alveolares são conhecidos por desempenhar um papel significativo na regulação da inflamação pulmonar e fibrose. Os macrófagos não conseguem quebrar a sílica após a inalação de sílica, levando à polarização ou apoptose dos macrófagos9 e à liberação de citocinas como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e o fator transformador de crescimento beta (TGF-β). Os macrófagos M1, identificados pela presença do marcador de superfície CD86, são os principais instigadores da resposta inflamatória na silicose, enquanto os macrófagos M2, marcados pelo CD206, são responsáveis pela fase fibrótica doquadro10. Em camundongos duplamente expostos, a nicotina induziu a polarização de macrófagos em direção ao fenótipo M2 em pulmões lesados por sílica, promovendo fibrose pulmonar. Além disso, o TGF-β1 é fundamental para a indução de fibrose e EMT11; o aumento da expressão de TGF-β1 acelerou a progressão da fibrose pulmonar através da EMT. Esse modelo analisou com sucesso os efeitos da nicotina sobre a silicose e destacou ainda mais a importância da cessação da nicotina.

<table><tbody><tr><td>Fixador neutro de formalina a 10%</td><td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>desinfetante de álcool</td><td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA, anticorpo</td><td></td> monoclonal da biotecnologia <td>ST023-200g</td><td></td></tr><tr><td>CD206</td><td></td><td></td> de Beyotime da fração V Solução da recuperação do antígeno do citrato da solução biosharp da recuperação do antígeno do dimetilbenzeno BL619A da ciência da vida BL619A da Ásia Ocidental (Shandong) Co melhorou o jogo do ensaio da proteína do BCA <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0009</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Anticorpo policlonal</td><td>Proteintech</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina e Eosina (H & E)</td> <td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0105S</td><td></td></tr><tr><td>substrato HRP</td><td>Millipore Corporation</td><td>P90720</td><td></td></tr><tr><td>Affinipure Goat conjugado com HRP Anti-Mouse IgG (H + L)</td> <td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>Affinipure Goat conjugado com HRP Anti-Rabbit IgG (H + L)</td> <td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT [R] DAB EqV Peroxidase (HRP)</td><td>Substrato Vector Laboratories</td><td>SK-4103-100</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Mancha Tricrômica da</td><td>Masson Solarbio</td><td>G1340</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Macklin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotina</td><td>Sigma</td><td>N-3876</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)&nbsp;</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina fisiológica</td><td>O Primeiro Hospital Popular da Cidade</td><td></td><td></td>de Huainan</tr><tr><td>PMSF</td><td>Beyotime</td><td>Biotechnological ST505</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência positiva</td><td>OlympusCorporation</td><td>BX53+DP74</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de Cor Prestada Peso Molecular&nbsp; Marcador, ou Escada de Proteína de Cor Prestained</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0071</td><td></td></tr><tr><td>Membranas PVDF</td><td>Millipore</td><td>3010040001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis Buffer</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit de preparação de gel</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>Dióxido de silício</td><td>Sigma</td><td>#BCBV6865</td><td></td></tr><tr><td>TGF- &beta;</td><td>Bioss</td><td>bs-0086R</td><td></td></tr><tr><td>Vimentina Anticorpo policlonal</td><td>Proteintech</td><td>10366-1-AP</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nome do Material/EquipamentoNúmero de</td> <td>catálogo</td><td></td> <td>da empresa</td></tr><tr><td>0,5 mL Tubo</td><td>Biosharp</td><td>BS-05-M</td><td></td></tr><tr><td>Banho de metal termostático oscilatório</td> Máquina <td></td> de inclusão de parafina de abson <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Precisão (Changzhou) Equipamentos Médicos Co.</td><td>Fatiador de parafina PBM-A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jinhua Kratai Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz polarizada</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Balança de Precisão</td><td>Acculab</td><td>ALC-110.4</td><td></td></tr><tr><td>RODI IOT sistema de purificação de água multifuncional inteligente</td><td>RSJ</td><td>RODI-220BN</td><td></td></tr><tr><td>Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker</td><td>Scilogex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pequeno aparelho de anestesia para animais</td><td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td><td>ZL-04A</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta Universais</td><td>KIRGEN</td><td>KG1011</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta Universais</td><td>KIRGEN</td><td>KG1212</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta Universais</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice&nbsp; Misturadores&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nome do Material/Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uso de nicotina em modelo de camundongo exposto à sílica para promover a transição epitélio-mesenquimal pulmonar

Using Nicotine in a Silica-Exposed Mouse Model to Promote Lung Epithelial-Mesenchymal Transition

O tabagismo e a exposição à sílica são comuns entre os trabalhadores ocupacionais, e a sílica tem maior probabilidade de lesar os pulmões de fumantes do que de não fumantes. O papel da nicotina, o principal ingrediente aditivo do cigarro, no desenvolvimento da silicose não está claro. O modelo de camundongo empregado neste estudo foi simples e de fácil controle, simulando efetivamente os efeitos da ingestão crônica de nicotina e da exposição repetida à sílica sobre a fibrose pulmonar através da transição epitélio-mesenquimal em seres humanos. Além disso, esse modelo pode auxiliar no estudo direto dos efeitos da nicotina sobre a silicose, evitando os efeitos de outros componentes na fumaça do cigarro.
Após adaptação ambiental, camundongos foram injetados por via subcutânea com 0,25 mg/kg de solução de nicotina na pele frouxa do pescoço todas as manhãs e noites, em intervalos de 12 h durante 40 dias. Além disso, o pó de sílica cristalina (1-5 μm) foi suspenso em solução salina normal, diluído em uma suspensão de 20 mg/mL e dispersado uniformemente em banho-maria ultrassônico. Os camundongos anestesiados com isoflurano inalaram 50 μL dessa suspensão de poeira de sílica pelo nariz e foram acordados via massagem torácica. A exposição à sílica foi administrada diariamente nos dias 5-19.
O modelo de camundongo duplamente exposto foi exposto à nicotina e, em seguida, à sílica, o que coincide com o histórico de exposição dos trabalhadores expostos a ambos os fatores prejudiciais. Além disso, a nicotina promoveu fibrose pulmonar através da transformação epitélio-mesenquimal (EMT) em camundongos. Este modelo animal pode ser utilizado para estudar os efeitos de múltiplos fatores no desenvolvimento da silicose.

Um modelo de camundongo para estudar nicotina combinada com exposição à sílica foi estabelecido para investigar o papel potencial da nicotina na progressão da silicose em camundongos. A Figura 1 mostra o procedimento experimental para o uso de um modelo de camundongo de dupla exposição, que emparelhou uma injeção de nicotina com a instilação nasal de uma suspensão de sílica. As alterações patológicas dos camundongos em cada grupo foram observadas pela coloração HE. Os camundongos expostos à ...

Este estudo descreve um modelo murino para estudar o efeito sinérgico da nicotina na progressão da fibrose pulmonar em camundongos silicose experimentais. O modelo de camundongo de dupla exposição simula a progressão patológica no pulmão após exposição simultânea à nicotina e à sílica. Os métodos descritos são simples e altamente reprodutíveis.

Uso de Nicotina em Modelo de Camundongo Exposto à Sílica para Promover a Transição Epitélio-Mesenquimal Pulmonar

Smoking and exposure to silica are common among occupational workers, and silica is more likely to injure the lungs of smokers than non-smokers. The role ...

O modelo de camundongo empregado neste estudo simula efetivamente o efeito da ingestão crônica de nicotina e da exposição repetida à sílica sobre as fibroses pulmonares através da transição mesenquimal epitelial em seres humanos. O modelo de porção do júri foi obtido pela injeção subcutânea de nicotina e gotejamento nasal de sílica de forma simples e confiável. Suspender a sílica cristalina estéril em soro fisiológico para preparar uma suspensão de 20 miligramas por litro.Oscile-o em um banho de água de agitação ultra-sônica por 25 minutos. Coloque a suspensão de sílica com um oscilador de vórtice por três minutos. Aspirar a suspensão para misturá-la e, em seguida, usar 50 microlitros para o gotejamento nasal.Para iniciar a exposição à sílica, primeiro, coloque o camundongo anestesiado na palma de uma das mãos e exponha a cavidade nasal do camundongo. Injetar 50 microlitros da suspensão de sílica de uma narina dentro de quatro a oito segundos. Para permitir uma rápida penetração pulmonar da suspensão, pressione suavemente o peito do mouse com o dedo indicador por três a cinco segundos, repetindo a pressão de três a cinco vezes a cada segundo para manter sua frequência respiratória.Uma vez que o mouse exibe respiração uniforme, coloque-o sob observação em uma gaiola por três minutos. Prepare seringas de nicotina retirando o ar até a marca de 0,2 mililitro em uma seringa de um mililitro. Em seguida, retire 125 microlitros de nicotina.Bata na seringa para encher a agulha e a extremidade frontal com nicotina e, em seguida, coloque-a em uma bandeja protegida da luz. Com a mão direita, segure a cauda do rato. Quando o mouse tiver relaxado, use o polegar esquerdo e o indicador para aplicar pressão moderada na pele da cauda até a borda da orelha.Agora, solte a mão direita e use os dedos esquerdo, pequeno e anelar para beliscar a cauda e os membros posteriores para imobilizar o mouse. Segure a seringa de injeção na mão direita e puncione a pele na parte de trás do pescoço na direção da cabeça à cauda. Injetar a nicotina em uma taxa uniforme.Fixe o rato anestesiado numa placa de teste de espuma e borrife o pelo com álcool a 75%. Faça uma incisão ao longo da linha média do abdome expondo a cavidade torácica. Faça um pequeno corte no ápice do lado direito do coração.Injete 20 mililitros de PBS pré-resfriado lenta e uniformemente a partir do ápice do coração esquerdo, fazendo com que o sangue flua para fora da abertura criada no ápice do coração direito. Retire todo o lobo pulmonar e leve à geladeira a 80 graus Celsius negativos. Perfundir os ratos restantes com 10 mililitros de para-formaldeído a 4%.Após a perfusão PBS, preservar os pulmões em 30 mililitros da solução de para-formaldeído. Após 72 horas, mergulhe os pulmões no fixador preparado e coloque-os em banho-maria ultrassônico. Temperado a 40 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, realizar a desidratação colocando o tecido em etanol 75%, depois em etanol 95% e, em seguida, em etanol anidro por 50 minutos cada. Mergulhe o tecido pulmonar em xileno por 50 minutos duas vezes para lavar o tecido. Coloque o tecido em cera de parafina derretida por duas a três horas a 55 a 60 graus Celsius.Uma vez endurecida a cera, use uma máquina de seccionamento para obter os cortes de pulmão de quatro a cinco micrômetros de espessura. Aqueça as seções a 45 graus Celsius em água ultrapura. Coloque os cortes pulmonares em uma lâmina de microscópio aderente assim que a cera derreter.Estudos de coloração de hematoxilina e eosina mostraram que camundongos expostos à nicotina combinada com sílica tiveram danos pulmonares significativamente mais graves do que aqueles expostos à nicotina ou à sílica isoladamente. A coloração de Masson revelou aumento da deposição de fibras colágenas nos pulmões expostos à combinação de sílica nicotina em relação aos outros grupos. Estruturas alveolares foram destruídas nos camundongos expostos à sílica.Estudos imuno-histoquímicos revelaram aumento de CD dois zero seis macrófagos positivos e do fator pró-fibrótico, TGF beta um positivo nos camundongos expostos à combinação de nicotina e sílica. A expressão de vimentina foi maior nos camundongos submetidos à dupla expressão em relação aos demais grupos. Estudos imuno-histoquímicos e quantificação de proteínas sugerem transformação mesenquimal epitelial grave.Para garantir uma injeção de nicotina bem-sucedida, o operador tem que se familiarizar com agarrar os ratos, pois agarrar a pele na parte de trás do pescoço pode ser doloroso para eles.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para o isolamento, cultura e expondo essas células à fumaça de cigarro mainstream, a fim de estudar as respostas moleculares para esta toxina ambiental.

Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

O objetivo deste protocolo é fornecer métodos automatizados para quantificar patologias pulmonares crônicas em um modelo murino de DPOC. O protocolo inclui a exposição de camundongos à fumaça de cigarro (CS), medição da função pulmonar, insuflação dos pulmões e uso de métodos de morfometria para medir o enfisema e a remodelação das pequenas vias aéreas em camundongos.

Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

A capacidade de migrar é uma função chave de muitos tipos diferentes de células, incluindo células estromais mesenquimais (MSCs). No entanto, quantificar as alterações na capacidade migratória após os danos é um desafio. Este protocolo descreve um ensaio de migração facilmente adaptável que usa estatísticas rigorosas para quantificar as mudanças na capacidade migratória do MSC após danos.

Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

Este protocolo demonstra o estudo dos efeitos fisiofisiológicos da fumaça do cigarro (SC) com um sistema de exposição de inalação total (WBI) construído internamente. Este sistema pode expor animais a CS sob condições repetíveis controladas para pesquisa de efeitos mediados pela CS em enfisema pulmonar e hematopoiese.

Exposição à fumaça de cigarro em camundongos usando um sistema de inalação de corpo inteiro

Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo de silicose em camundongos através da exposição repetida a suspensões de sílica via gotejamento nasal. Este modelo pode eficiente, convenientemente e flexivelmente mimetizar o processo patológico da silicose humana com alta repetibilidade e economia.

Modelo de silicose em camundongos estabelecido por inalação repetida de pó de sílica cristalina

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Este artigo descreve um método striaghforward e eficiente de entubar ratos para medições de função pulmonar ou instilação pulmonar, que permite que os ratos a se recuperar e ser estudado em momentos posteriores. O procedimento envolve uma fonte de luz de fibra óptica de baixo custo que ilumina diretamente a traquéia.

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A recapitulação do microambiente órgão-específico, que estimula a angiogênese local, é indispensável para a regeneração bem-sucedida dos tecidos danificados. Este relatório demonstra um novo método para implantar géis de fibrina na superfície pulmonar de camundongos vivos, a fim de explorar como o microambiente específico do pulmão modula a angiogênese e a regeneração alveolar em camundongos adultos.

Implantação de fibrina Gel no tapete do pulmão para o Estudo de angiogênese Lung-specific

A pneumonectomia de camundongos é um modelo comumente empregado de crescimento pulmonar compensatório. Este procedimento pode ser usado em conjunto com o rastreamento de linhagem ou modelos de camundongos transgênicos para elucidar os mecanismos subjacentes.

Rato Pneumonectomia modelo de crescimento compensatório pulmonar

Ex-Vivo perfusão pulmonar (PPEV) tem permitido o transplante de pulmão em seres humanos para se tornar mais facilmente disponível, permitindo que a capacidade de avaliar órgãos e expandir o grupo de dadores. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um programa PPEV rato e aperfeiçoamentos que permitem um modelo reprodutível para expansão futura.

Método de Isolado<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão pulmonar em um modelo de rato: Lições aprendidas com o desenvolvimento de um Programa PPEV Rat

Aprenda a criar um modelo de camundongo com exposição dupla a nicotina e sílica para estudar fibrose pulmonar e transição epitélio-mesenquimal. Este método reprodutível simula patologia pulmonar humana.

Uso de Nicotina em Modelo de Camundongo Exposto à Sílica para Promover a Transição Epitélio-Mesenquimal Pulmonar

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