Name: Modelos de camundongos com engenharia genômica somática usando microinjeção e eletroporação in vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a criar modelos de camundongos com edição genômica CRISPR no oviduto usando microinjeção e eletroporação in vivo. Este método flexível permite estudar a iniciação do câncer em ambiente imunocompetente.

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Os autores agradecem a Katie Teng e ao Dr. Matthew J. Ford pelo fornecimento de plasmídeos usados para gerar resultados representativos e otimização de protocolos. K.H. foi apoiado pelo Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS) bolsa de doutorado, Donnor Foundation, Delta Kappa Gamma World Fellowship, Centre for Research in Reproduction and Development (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande e Marcel Gosselin e Alexander McFee.

Os animais foram alojados em gaiolas estáticas de microisolamento com tampas filtrantes, localizadas em uma sala dedicada contendo uma cabine de biossegurança tipo II. Todo o trabalho com animais foi realizado de acordo com as diretrizes institucionais e foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Faculdade de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade McGill (AUP #7843).
1. Preparação da agulha de microinjeção
<ol><li>Puxe um tubo capilar de vidro em um ponto afiado usando um extrator de micropipeta com o seguinte programa: P = 500, Calor = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70.</li>
	<li>Usando um par de pinças de ponta cônica ultrafina, corte a extremidade pontiaguda do tubo capilar tracionado sob um microscópio dissecante para criar uma abertura, como mostrado na Figura 1A,B. Certifique-se de que a abertura não é muito grande, pois isso danificará o oviduto e impedirá a injeção lenta.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig01.jpg"> Figura 1: Preparo da agulha de microinjeção. (A,B) Tubo capilar tracionado com extremidade pontiaguda (A) que foi cortado para criar uma abertura (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Preparo do anestésico para injeção intraperitoneal
<ol><li>Preparar avertin filtrado e diluído no dia da cirurgia. A solução-mãe de Avertin (2,2,2-tribromoetanol) é preparada a uma concentração de 1,6 g/ml em álcool terc-amílico por agitação vigorosa e armazenada no escuro.</li>
	<li>Diluir a solução-mãe de avertin com solução salina isotónica a 1,25% v/v até uma concentração final de 20 mg/ml no interior de um exaustor. Vórtice o avertin diluído e filtre através de um filtro estéril de 0,22 μm. Mantenha-se no escuro.</li>
</ol>3. Preparo da área cirúrgica
<ol><li>A área cirúrgica deve ser um ambiente estéril dedicado, preferencialmente uma bancada limpa ou gabinete de biossegurança. Providencie o equipamento de cirurgia estéril, microscópio, micromanipulador e eletroporator conforme necessário. Um exemplo disso é mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Aqueça a almofada/disco de aquecimento e coloque-a debaixo de uma gaiola limpa e totalmente equipada. Esta gaiola será usada para abrigar os camundongos após a cirurgia.</li>
	<li>Despeje 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril em uma placa de Petri estéril. Use uma tesoura limpa para cortar papel absorvente em quadrados, com dimensões aproximadas de 1 cm x 1 cm. Coloque esses pedaços de papel absorvente no PBS 1x para deixá-los de molho.</li>
</ol>4. Preparação da solução e da agulha para injeção
<ol><li>Preparar a solução de injeção no dia da cirurgia. Misturar o DNA/RNA/RNPs com azul de tripano filtrado até uma concentração final mínima de 200 ng/μL cada e 5%, respectivamente. Conservar à temperatura ambiente antes da injeção. NOTA: Use uma seringa de 1 mL para absorver 100% de azul de tripano e filtre através de um filtro estéril de 0,22 μm antes de usar.</li>
	<li>Fixar a agulha capilar tracionada, doravante denominada agulha de microinjeção, ao micromanipulador de fixação estabilizado por um suporte magnético (configuração mostrada na Figura 2B).</li>
	<li>Pipetar 2 μL da solução injetável para uma placa de Petri estéril. Ao observar ao microscópio, absorva lentamente 1-2 μL desta solução na agulha de microinjeção usando a seringa com pressão de ar conectada ao micromanipulador. Evite bolhas/absorção de bolhas na agulha de microinjeção.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig02.jpg"> Figura 2: Preparo da área cirúrgica. (A) Configuração da área cirúrgica dentro de uma bancada limpa. (B) Microscópio de dissecção e micromanipulador para um indivíduo destro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
5. Exposição do aparelho reprodutor feminino
<ol><li>Anestesiar camundongos fêmeas com 6-8 semanas de idade administrando avertin (anestésico) filtrado e diluído por via intraperitoneal na dose de 0,25-0,5 mg/g. Em seguida, administrar carprofeno (analgésico preemptivo) por via subcutânea na dose de 5 mg/kg. OBS: Outras alternativas que podem ser utilizadas como anestésico são o isoflurano ou a cetamina/xilazina.</li>
	<li>Coloque papel absorvente em uma almofada/disco limpa e aquecida. Em seguida, coloque o mouse anestesiado sobre esse papel absorvente aquecido com o lado dorsal voltado para cima. Aplique lubrificante ocular em cada olho para evitar o ressecamento durante a cirurgia. NOTA: Confirme se a almofada/disco de aquecimento está ligeiramente quente ao toque, testando com a parte de trás da mão.</li>
	<li>Teste de parada anestésica profunda apertando o dedo do mouse anestesiado com um par de pinças. Remova a pele dorsal ao redor do local da incisão prospectiva (localização mostrada na Figura 3A) e limpe a pele nua com antisséptico.</li>
	<li>Use um par de pinças retas rombas para beliscar a pele nua e criar uma incisão de 1 cm de comprimento ao longo da linha média do corpo usando um par de tesouras estéreis e afiadas. Limpe a área ao redor da incisão com antisséptico.</li>
	<li>Aperte e segure um lado do local de corte usando um par de pinças Adson estéreis. Em seguida, com um par de pinças serrilhadas curvas estéreis, separe suavemente a pele da parede corporal, iniciando na incisão mediana e movendo-se lateralmente.</li>
	<li>Localize o coxim gorduroso abaixo do rim. Usando um par de pinças retas estéreis rombas, aperte a parede do corpo diretamente acima da almofada de gordura. Crie uma pequena incisão na parede do corpo usando um par de tesouras dissecantes estéreis de ponta afiada, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos.</li>
	<li>Enquanto ainda belisca a parede do corpo com pinças retas rombas, insira um par de pinças curvas rombas estéreis na incisão e amplie a incisão criada na parede do corpo.</li>
	<li>Pegue o coxim de gordura visível com a pinça curva romba e puxe-o para fora do orifício para expor o ovário, o oviduto e o útero.</li>
	<li>Para manter o aparelho reprodutivo exposto, pinçar o coxim gorduroso com uma braçadeira estéril de buldogue, como mostra a Figura 3B.</li>
</ol>6. Injeção in vivo de oviduto e eletroporação
<ol><li>Coloque cuidadosamente o papel absorvente aquecido e o camundongo anestesiado com o trato reprodutivo exposto no palco de um microscópio dissecante, de modo que o trato possa ser observado. Um exemplo da visão observada ao microscópio é mostrado na Figura 3B.</li>
	<li>Ajuste o micromanipulador para que a agulha de injeção com solução também possa ser observada ao microscópio.</li>
	<li>Usando um par de pinças estéreis de ponta cônica ultrafina, mantenha estável a região do oviduto a ser injetada. A região a ser injetada deve estar de acordo com a direção da agulha de microinjeção. NOTA: Use a braçadeira bulldog ancorando a almofada de gordura e o trato reprodutivo para girar/mover suavemente o trato para uma posição ideal, se necessário.</li>
	<li>Ajustar o micromanipulador para puncionar o oviduto com a agulha de microinjeção, enquanto simultaneamente alimenta o oviduto na agulha usando a pinça de ponta cônica ultrafina. Mova suavemente a agulha de microinjeção para confirmar que foi inserida no oviduto. NOTA: Insira a agulha de microinjeção em um segmento reto em vez de em um ponto de giro do oviduto enrolado para evitar múltiplas punções e vazamento da solução de injeção.</li>
	<li>Injetar lentamente até 1 μL de solução no oviduto, enquanto observa o movimento da solução azul e a expansão da luz do oviduto sob o microscópio. Tome cuidado para não introduzir bolhas no lúmen. Imagens representativas dos ovidutos injetados com azul de tripano a 100% são mostradas na Figura 3C,D.</li>
	<li>Retire a agulha do oviduto. Cubra a área a ser atingida com um pedaço de papel absorvente pré-embebido em 1x PBS estéril (a partir da etapa 3.3).</li>
	<li>Segure o papel pré-embebido e a área/região a ser atingida com uma pinça de eletrodos (1 mm, 3 mm ou 5 mm, dependendo do tamanho da região a ser atingida) e afaste-se do corpo, antes de eletroporar usando estas configurações no gerador/eletroporador de pulsos: 30 V, três pulsos, intervalo de 1 s, Comprimento de pulso de 50 ms, unipolar. NOTA: A distância entre os eletrodos deve ser ajustada de tal forma que os eletrodos possam se prender à região alvo sem deformar o oviduto. A distância recomendada é de cerca de 1 mm.</li>
	<li>Após a eletroporação, remova o papel absorvente e coloque o mouse (com o papel absorvente aquecido embaixo) de volta em uma almofada térmica. Desaperte a braçadeira do buldogue e empurre cuidadosamente o trato reprodutivo exposto de volta sob a parede do corpo. Repita a secção 5 para expor o aparelho reprodutor do outro lado. NOTA: A eletroporação é bem-sucedida independentemente do estágio estral do camundongo, desde que o lúmen seja preenchido com a solução.</li>
	<li>Cubra o trato exposto com papel absorvente pré-embebido em PBS estéril 1x para evitar que seque e, em seguida, prepare a agulha de microinjeção para a segunda injeção repetindo os passos 4.2 e 4.3. NOTA: Substitua a agulha de microinjeção conforme necessário. Evite o ressecamento do tecido exposto aplicando 1x PBS estéril quando necessário.</li>
	<li>Repita os passos acima para injetar e eletroporar o oviduto do lado oposto. NOTA: Reaplique o lubrificante ocular conforme necessário durante e após a cirurgia.</li>
	<li>Após ambos os ovidutos terem sido eletroporados e colocados de volta sob a parede do corpo, sutura ou grampo do local da incisão dorsal. Para a sutura, use um hemostático para segurar a agulha das suturas trançadas de seda (círculo 3/8; calibre: 5-0; tamanho da agulha: 18 mm; comprimento da rosca: 75 cm). Aperte e segure um lado do local do corte usando um par de pinças serrilhadas curvas estéreis e, em seguida, use o hemostático para manipular a sutura para fechar a ferida.</li>
	<li>Mova o mouse para uma gaiola limpa que é colocada em cima de uma almofada/disco aquecido (a partir da etapa 3.2) e monitore até que o mouse esteja ativo.</li>
	<li>Administrar 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea a cada 24 h nos próximos 3 dias e monitorar nos próximos 10 dias.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig03.jpg"> Figura 3: Exposição do aparelho reprodutor feminino e microinjeção . (A) Localização da incisão mediana (mostrada como uma linha amarela) no lado dorsal de um camundongo Rosa-LSLtdTomate. (B) Exposição do aparelho reprodutor feminino. O coxim gorduroso foi pinçado com pinça estéril de buldogue para ancorar o trato e mantê-lo exposto. (C,D) Imagens representativas da injeção in vivo do oviduto. Uma agulha de microinjeção foi inserida na ampola distal (AMP marcada) e filtrado 100% de azul de tripano foi injetado na luz do oviduto enquanto o trato era exposto (C). Imagem representativa de um oviduto dissecado, demonstrando que a solução injetada de azul de tripano se distribui por toda a luz distal e proximal do oviduto (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Etapas cruciais neste protocolo detalhado são a microinjeção de solução de DNA/RNA/RNP na luz do oviduto e o controle da força e área de eletroporação. O vazamento da solução de DNA/RNA/RNP durante a microinjeção pode causar transfecção de áreas/células indesejadas. Para uma eletroporação consistente e eficiente, é preferível preencher a luz do oviduto com a solução (Figura 3C,D). Isso ocorre porque a área de eletroporação é controlada principalmente pelo tamanho e colocação do eletrodo. A eletroporação fraca reduz o número de células eletroporadas, e a eletroporação severa pode causar a eletroporação de células indesejadas ou perturbar a estrutura do tecido. O número de células eletroporadas pode ser variado ajustando-se a concentração da solução DNA/RNA/RNP ou os parâmetros de eletroporação. No entanto, como altas tensões/produção de calor durante a eletroporação podem danificar o tecido, esses parâmetros devem ser testados antes do uso em camundongos vivos/anestesiados. Finalmente, devido à natureza exigente deste procedimento, recomenda-se praticar exposição do trato e microinjeção em camundongos mortos antes de realizar esta cirurgia em camundongos vivos/anestesiados.
Reconhece-se que múltiplos genes estão envolvidos na iniciação do câncer, portanto, a recapitulação desse evento requer modificação multialélica de vários genes. Além disso, sabe-se também que nem todas as células são igualmente suscetíveis a mutações oncogênicas9. A modelagem do câncer, portanto, requer linhas específicas de camundongos Cre para alcançar um controle rigoroso dos insultos oncogênicos. No entanto, sua disponibilidade e especificidade causam vários desafios, incluindo efeitos em tecidos não visados e letalidade19. Além disso, os G-GEMMs tradicionais incorrem em altos custos de manutenção e requerem tempo para a geração da linha de mouses. O desenvolvimento da tecnologia de edição do genoma CRISPR/Cas9 e a melhoria da entrega de genes em células somáticas específicas nos permitiu superar essas questões. Neste protocolo, apresentamos um método de liberação de DNA/RNA/RNP para manipulação do genoma somático que pode ser usado para modelagem de câncer, sem a necessidade absoluta de linhagens específicas decamundongos12. Ao injetar soluções de DNA/RNA/RNP no lúmen e usar diferentes tamanhos de eletrodos do tipo tweezer para liberação baseada em eletroporação, áreas restritas do epitélio da mucosa do oviduto de camundongos são visadas (Figura 4A-F). Isso é especialmente útil na modelagem do início das HGSCs que se originam da extremidade distal da tuba uterina.
O método de microinjeção e eletroporação in vivo apresentado é altamente versátil para atingir tecidos/órgãos com lúmen. O parênquima orgânico também é alvo dessemétodo14. Abordagens de entrega viral, como sistemas lentiviral e adenoviral, também podem ser usadas para fins semelhantes. No entanto, as vantagens da eletroporação sobre as abordagens de liberação viral são: 1) entrega múltipla de plasmídios em células únicas, 2) nenhuma restrição no tamanho da inserção15 e 3) fácil controle da área e do momento do parto. Além disso, a especificidade da segmentação pode ser melhorada com o uso de promotores específicos de linhagem. Isso às vezes é difícil em sistemas virais devido ao limite de embalagens virais.
Como é da natureza da eletroporação, as células epiteliais eletroporosas são aleatoriamente intercaladas com células saudáveis e não editadas (Figura 4G). No entanto, esse mosaicismo em células geneticamente modificadas e não modificadas poderia ser vantajoso para estudar a iniciação do câncer, pois recapitula a natureza esporádica da iniciação precoce do câncer dentro de um microambiente imunocompetente. A frequência de células eletroporadas pode ser ajustada variando-se as concentrações da solução de DNA/RNA/RNP e/ou os parâmetros de eletroporação. Usando a edição gênica mediada por CRISPR-Cas em combinação com o protocolo apresentado, é fácil rastrear múltiplos genes e gerar padrões heterogêneos de mutações/combinações alélicas em genes-alvo; isso é particularmente útil na modelagem de cânceres que apresentam um número considerável de alterações genômicas como HGSCs20,21. Além disso, por meio do sequenciamento de genes-alvo durante a progressão do câncer, é possível acompanhar a evolução clonal in vivo de tumores e metástases em camundongosimunocompetentes12.

A tuba uterina, chamada de oviduto em camundongos, é uma estrutura tubular que conecta o útero ao ovário. Desempenha papel essencial na reprodução de mamíferos, proporcionando ambiente para fertilização interna e desenvolvimento pré-implantação 1,2. Apesar de sua importância, pouco se sabe sobre sua função e homeostase, em parte devido ao desenvolvimento de técnicas de fertilização in vitro, driblando qualquer problema de infertilidade relacionado a esse órgão3. Entretanto, tem sido reconhecido que as lesões pré-cancerosas do carcinoma seroso de ovário de alto grau (ICHP), um histotipo agressivo de câncer de ovário que representa cerca de 75% dos carcinomas ovarianos e 85% das mortesrelacionadas4, são restritas ao epitélio distal das tubas uterinas5,6,7,8. Isso indica que nem todas as células do nosso corpo são igualmente suscetíveis a insultos oncogênicos, mas apenas células únicas/suscetíveis em cada tecido/órgão se tornam a célula de origem do câncer – denominada pliancy celular9. Nessa linha, tem sido demonstrado que as células epiteliais da tuba uterina distal, localizadas adjacentes ao ovário, são distintas do restante da tuba10,11. Assim, os modelos tradicionais de camundongos de HGSC, que têm como alvo todas as células do oviduto, não recapitulam a condição humana. Em um estudo recente, usamos uma combinação de edição do genoma mediada por CRISPR, eletroporação in vivo do oviduto e rastreamento de linhagem baseado em Cre para induzir com sucesso HGSC através da mutação de quatro genes supressores de tumor no oviduto distal de camundongos12,13. Este manuscrito apresenta um protocolo passo-a-passo descrevendo este procedimento de microinjeção e eletroporação in vivo para atingir o epitélio mucoso do oviduto de camundongos.
Este método tem várias vantagens. Pode ser adaptado para atingir outros tecidos/órgãos, incluindo o parênquima orgânico14. Embora outras abordagens de entrega gênica in vivo, como sistemas lentiviral e adenoviral, possam ser usadas para alcançar um direcionamento específico de tecido/órgão semelhante, a área de alvo é mais facilmente ajustada usando diferentes tamanhos de eletrodos do tipo tweezer para entrega baseada em eletroporação. Dependendo da concentração de DNA/RNA/ribonucleoproteínas (RNPs), dos parâmetros de eletroporação e do tamanho dos eletrodos, o número de células eletroporosas pode ser alterado. Além disso, tipos celulares específicos podem ser visados quando usados em combinação com promotores para a expressão de Cas9, sem a necessidade absoluta de modelos de camundongos geneticamente modificados Germline (G-GEMMs). Além disso, ao contrário dos sistemas de liberação viral, a eletroporação permite a entrega de múltiplos plasmídeos em células únicas e menos restrição no tamanho do DNA de inserção15. O rastreamento in vivo de mutações gênicas também pode ser realizado com relativa facilidade devido a essa alta flexibilidade. Além disso, células eletroporadas podem ser rastreadas ou rastreadas quando esse método é usado em combinação com linhas de repórteres Cre, como Tdtomato ou Confete16,17.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m unidade de filtro estéril&nbsp;</td><td>Seringa LifeGene</td><td>SF0.22PES</td><td></td></tr> 1 <tr><td>mL</td><td>Terumo Medical Corportation</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos tipo pinça de 1 mm</td><td>BEX CO., LTD</td><td></td><td></td></tr> LF650P1 <tr><td>Eletrodos tipo pinça de 3 mm</td><td>BEX CO., LTD</td><td></td><td></td></tr> LF650P3 <tr><td>30G x 1/2 Agulha</td><td>BD</td><td>305106</td><td>A agulha é conectada à seringa de 1 mL ao usar anestésico ou analgésico injetável.</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Adson Fisher Scientific</td><td>10-000-451</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de pressão de ar</td><td>BD</td><td>B302995</td><td>Acoplada ao micromanipulador; conforme mostrado na Figura 2B</td></tr><tr><td>Analgésico</td> <td>-</td><td></td> <td>Carprofeno, dose: 5mg / kg.</td></tr><tr><td>Anti-séptico</td><td>Cardinal Health</td><td>OMEL0000017</td><td>Baxedin: clorexidina a 2% em álcool isopropílico a 70%</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoetanol) - Anestésico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador de montagem em grampo</td><td>AD Instruments</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinça serrilhada curva</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0696845</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td> <td>de dissecaçãoZeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Apocromático S, 0.63X, FWD 107mm. LED KL 200 anexado para luz superior, rotulado como fonte de luz na Figura 2B.</td></tr><tr><td>Lubrificante ocular</td> <td>Pomada Alcon-Systane (pomada lubrificante ocular)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulhas capilares de vidro</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100&ndash; 50-10</td><td>Diâmetro externo: 1 mm, diâmetro interno: 0,5 mm, comprimento: 10 cm</td></tr><tr><td>Hemostatos Hartman</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-711</td><td></td></tr><tr><td>Almofada/disco de aquecimento&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Almofada de aquecimento de micro-ondas SnuggleSafe Pet Bed foi usada neste protocolo. Microondas por 2-5min e teste com as costas da mão enluvada.</td></tr><tr><td>Suporte magnético para micromanipulador</td><td>AD Instruments</td><td>MB-B</td><td>Usado para manter o micromanipulador de montagem de grampo estável e vertical durante a injeção.</td></tr><tr><td>Braçadeira micro bulldog</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-230</td><td>3 cm</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>P-97 Extrator de micropipeta tipo flamejante/marrom. Programa utilizado: P = 500, Calor = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>263991</td><td>Placas de vidro autoclavadas/estéreis também podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PD8117</td><td>10X PBS foi diluído para 1X com água DI. Autoclave antes do uso.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gerador de pulsos/Eletroporador</td><td>BEX CO., LTD</td><td>CUY21 EDIT II</td><td>Configurações de eletroporação: 30 V, 3 pulsos, intervalo de 1 s, comprimento P. = 50 ms, camundongos</td></tr><tr><td>Rosa-LSLtdTomato</td> unipolares <td>The Jackson Laboratory</td><td>7914</td><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecção cortante Fisher</td><td>Scientific</td><td>28251</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação pontiaguda</td><td>Fisher Scientific</td><td>Máquina de barbear SDI130</td><td></td></tr>-<tr><td></td><td></td><td>-</td><td>O creme da remoção do cabelo pode igualmente ser usado.</td></tr><tr><td>Suturas trançadas de seda</td><td>Ethicon</td><td>682G</td><td>3/8 círculo, calibre: 5-0, tamanho da agulha: 18 mm, comprimento da linha: 75 cm. Grampos também podem ser usados.</td></tr><tr><td>Pinça de ponta ultrafina cônica&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Papel absorvente fino</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7050</td><td>Filtrado usando 0.22 &micro; m esterilizado antes do uso para microinjeção.</td></tr></tbody></table>

modelos de camundongos com engenharia genômica somática usando microinjeção e eletroporação in vivo

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Modelos de camundongos geneticamente modificados germinativos (G-GEMMs) forneceram informações valiosas sobre a função gênica in vivo no desenvolvimento, homeostase e doenças. No entanto, o tempo e o custo associados à criação e manutenção da colônia são elevados. Avanços recentes na edição do genoma mediada por CRISPR têm permitido a geração de GEMMs somáticos (S-GEMMs) visando diretamente a célula/tecido/órgão de interesse.
O oviduto, ou tuba uterina em humanos, é considerado o tecido de origem do câncer de ovário mais comum, os carcinomas serosos de ovário de alto grau (HGSCs). As HGSCs iniciam-se na região da tuba uterina distal ao útero, localizada adjacente ao ovário, mas não na tuba uterina proximal. No entanto, os modelos tradicionais de camundongos de HGSC têm como alvo todo o oviduto e, portanto, não recapitulam a condição humana. Apresentamos um método de microinjeção de solução de DNA, RNA ou ribonucleoproteína (RNP) na luz do oviduto e eletroporação in vivo para atingir células epiteliais da mucosa em regiões restritas ao longo do oviduto. Existem várias vantagens deste método para a modelagem do câncer, tais como: 1) alta adaptabilidade em atingir a área/tecido/órgão e região de eletroporação, 2) alta flexibilidade em tipos de células-alvo (pliancy celular) quando usado em combinação com promotores específicos para expressão de Cas9, 3) alta flexibilidade no número de células eletroporadas (frequência relativamente baixa), 4) nenhuma linhagem específica de camundongo é necessária (modelagem imunocompetente da doença), 5) alta flexibilidade na combinação de mutações gênicas e 6) possibilidade de rastrear células eletroporosas quando usadas em combinação com uma linha repórter Cre. Assim, este método custo-efetivo recapitula a iniciação do câncer humano.

As Figuras 1 e 2 ilustram o preparo da agulha de microinjeção e a configuração da área cirúrgica, respectivamente, para microinjeção in vivo e eletroporação do oviduto de camundongos. Durante a cirurgia, o aparelho reprodutor feminino foi exposto através de incisões feitas na pele dorsal (Figura 3A) e na parede corpórea de um camundongo Rosa-LSLtdTomato (Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)17 anestesiado. Uma pinça de buldogue foi fixada no coxim gorduroso acima do trato para mantê-lo exposto e ancorado (Figura 3B). Solução injetável contendo plasmídeos PCS2 CreNLS18 na concentração de 400 ng/μL foi injetada na ampola (AMP marcado) do oviduto espiralado e deixada dispersar por toda a luz do oviduto (Figura 3C,D). Embora plasmídeos PCS2 CreNLS tenham sido usados para gerar resultados representativos neste manuscrito, o método descrito pode ser usado com DNA/RNA/RNPs facilmente intercambiáveis na solução de injeção para edição gênica mediada por CRISPR/Cas no oviduto de camundongos. Em seguida, foram posicionados eletrodos tipo pinça de 1 mm ou 3 mm, de forma que o oviduto distal ficasse entre os eletrodos para liberação baseada em eletroporação.
Os ovidutos foram colhidos 4 dias após a cirurgia e esticados com a remoção da mesossalpinge para visualização da especificidade da eletroporação. Utilizando-se eletrodos do tipo tweezer de 1 mm ou 3 mm, a área alvo, marcada com TdTomato, foi restrita ao epitélio distal do oviduto (Figura 4A,D). O tamanho dessa área alvo foi controlado com o uso de eletrodos de diferentes tamanhos. Usando eletrodos do tipo tweezer de 3 mm, visamos uma área muito maior do AMP (Figura 4B,C), em comparação com o alvo apenas da ponta mais distal, o INF (Figura 4E,F), usando eletrodos do tipo tweezer de 1 mm. Esses ovidutos colhidos foram fixados, tratados com gradiente de sacarose e seccionados com criostato para análises detalhadas. Os cortes foram contracorados com Hoescht 33342 e Faloidina para corar os núcleos e citoesqueleto, respectivamente, e então foram fotografados usando um microscópio confocal de varredura pontual. Na região alvo, as células eletroporadas, marcadas por TdTomato, foram distribuídas aleatoriamente entre as células não eletroporadas (TdTomato-ve) (Figura 4G). Além disso, as células eletroporadas estavam restritas ao epitélio mucoso e não se encontravam no estroma ou na camada muscular subjacente (Figura 4G,H). Finalmente, para confirmar a edição gênica mediada por CRISPR-Cas, células TdTomato+ve podem ser isoladas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolamento de DNA e sequenciamento deMiSeq12.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig04.jpg"> Figura 4: Validação do sucesso da injeção in vivo e eletroporação das células epiteliais do oviduto, 4 dias pós-operatório. (A-C) Eletroporação utilizando eletrodos do tipo tweezer de 3 mm. O oviduto foi desenrolado pela remoção da mesossalpinge para melhor visualização da especificidade da eletroporação (A). A área de eletroporação, identificada pela expressão de TdTomato, foi restrita ao oviduto distal, marcado como AMP (B,C). (D-F) Eletroporação utilizando eletrodos do tipo tweezer de 1 mm. O oviduto foi desenrolado com a remoção da mesossalpinge para melhor visualização da especificidade da eletroporação (D). A área de eletroporação foi restrita ao infundíbulo (INF), a ponta mais distal do oviduto (E,F). (G,H) Secção transversal do oviduto distal 4 dias após a eletroporação com plasmídeos PCS2 CreNLS. As células eletroporadas marcadas com TdTomato (G) foram restritas à monocamada epitelial (H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve microinjeção e eletroporação in vivo para edição do genoma mediada por CRISPR regionalmente restrita no oviduto de camundongos.

Modelos de camundongos com engenharia genômica somática usando microinjeção e eletroporação in vivo

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

O protocolo apresentado é um método altamente flexível para manipulação do genoma no oviduto de camundongos. Permite a formação de células esporadicamente mutadas cercadas por células inéditas em ambiente imunocompetente. Isso é vantajoso para estudar a iniciação do câncer.A principal vantagem desta técnica é a sua alta adaptabilidade em visar um órgão, área, região ou tipo de célula de interesse com conjuntos facilmente intercambiáveis de combinações de mutação, tudo sem a necessidade absoluta de uma linhagem de camundongo. Este método pode ser facilmente adaptado para uso em órgãos com o lúmen, bem como parênquima orgânico. Para começar, puxe um tubo capilar de vidro em um ponto afiado usando um puxador de micropipeta.Usando um par de pinças cônicas de ponta ultrafina, corte a extremidade pontiaguda do tubo capilar puxado sob um microscópio dissecante para criar uma abertura. Certifique-se de que a abertura não é muito grande, pois danificará o oviduto e evitará a injeção lenta. Em seguida, disponha o equipamento de cirurgia estéril, microscópio, micromanipulador e eletroporator em uma bancada limpa e estéril ou dentro do gabinete de biossegurança.Aqueça a almofada de aquecimento num disco e coloque-a debaixo de uma gaiola limpa e totalmente equipada. Despeje 1X PBS estéril em uma placa de Petri. Usando uma tesoura limpa, corte o papel absorvente em quadrados de um por um centímetro.Solte-os no PBS para deixá-los de molho. Em seguida, prenda a agulha capilar puxada ao micromanipulador montado em grampo, estabilizado por um suporte magnético. Pipetar dois microlitros da solução injetável para uma placa de Petri estéril.Ao observar ao microscópio, leve lentamente um a dois microlitros da solução de injeção para a agulha de microinjeção usando a seringa com pressão de ar conectada ao micromanipulador. Evite pegar bolhas na agulha. Depois de anestesiar uma rata de seis a oito semanas de idade e administrar carprofeno por via subcutânea, coloque o rato sobre o papel absorvente aquecido com o lado dorsal virado para cima.Aplique lubrificante ocular em cada olho para evitar o ressecamento durante a cirurgia. Depois de confirmar a parada anestésica apertando o dedo do pé com um par de pinças, remova a pele dorsal ao redor do local da incisão prospectiva e limpe a pele nua com antisséptico. Use um par de pinças retas e rombas para beliscar a pele nua e criar uma incisão de um centímetro de comprimento ao longo da linha média do corpo usando uma tesoura estéril.Aperte e segure um lado do local de corte usando um par de pinças Adson estéreis. Em seguida, com um par de pinças estéreis, curvas e serrilhadas, separe suavemente a pele da parede corporal, iniciando na incisão mediana e movendo-se lateralmente. Depois de localizar o coxim gorduroso abaixo do rim, use um par de pinças estéreis, retas e rombas para beliscar a parede do corpo diretamente acima do coxim de gordura.Crie uma pequena incisão na parede do corpo usando um par de tesouras dissecantes estéreis, afiadas e pontiagudas, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos. Enquanto ainda belisca a parede do corpo com pinças retas e contundentes, insira um par de pinças estéreis, rombas e curvas na incisão e amplie a incisão criada na parede do corpo. Pegue o coxim de gordura visível com a pinça curva e contundente e puxe-o para fora do orifício para expor o ovário, o oviduto e o útero.Mantenha a trilha reprodutiva exposta apertando a almofada de gordura com uma braçadeira de buldogue estéril. Coloque cuidadosamente o camundongo anestesiado com a via reprodutiva exposta no palco de um microscópio dissecante. Ajuste o micromanipulador de modo que a agulha de injeção com a solução seja observada ao microscópio.Em seguida, manipule o microscópio para observar facilmente o ovário, o oviduto e o útero. Usando um par de pinças estéreis, cônicas e de ponta ultrafina, segure a região do oviduto a ser injetado. A região deve estar alinhada com a direção da agulha de microinjeção.Ajuste o micromanipulador para puncionar o oviduto com a agulha de microinjeção, enquanto simultaneamente alimenta o oviduto na agulha usando a pinça cônica de ponta ultrafina. Mova suavemente a agulha de microinjeção para confirmar que foi inserida no oviduto. Injetar lentamente um microlitro da solução injetável e azul de tripano filtrado a 5% no oviduto, observando o movimento da solução azul e a expansão do lúmen do oviduto.Evite introduzir bolhas no lúmen. Após a injeção, remova a agulha do oviduto e cubra a área a ser atingida com um pedaço de papel absorvente pré-embebido em PBS. Segure o papel pré-embebido e a área a ser atingida com uma pinça de eletrodos e afaste-se do corpo.Eletroporar a região alvo usando três pulsos unipolares a 30 volts por 50 milissegundos com intervalos de um segundo. Após a eletroporação, remova o papel absorvente e coloque o mouse de volta na almofada de aquecimento. Desaperte a braçadeira do buldogue e empurre cuidadosamente a trilha reprodutiva exposta de volta sob a parede do corpo.Depois que ambos os ovidutos tiverem sido eletroporados e colocados de volta sob a parede do corpo, use um suporte de agulha para agarrar a agulha. Aperte e segure um lado do local do corte usando um par de pinças estéreis, curvas e serrilhadas. Em seguida, use o porta-agulhas para manipular a sutura e fechar a ferida.Mova o mouse para uma gaiola limpa colocada em cima de uma almofada de aquecimento e monitore até que o mouse esteja ativo. À eletroporação com eletrodos do tipo tweezer de três ou um milímetro, a área alvo marcada com TdTomato foi restrita ao epitélio distal do oviduto. Com eletrodos do tipo tweezer de três milímetros, uma área muito maior das ampolas foi direcionada em comparação com o alvo apenas da ponta mais distal, o infundíbulo, usando eletrodos do tipo tweezer de um milímetro.Na região alvo, células eletroporadas marcadas por TdTomato foram distribuídas aleatoriamente entre células não eletroporadas. Além disso, as células eletroporadas estavam restritas ao epitélio da mucosa e não foram observadas no estroma ou na camada muscular subjacente. Para confirmar a edição do genoma mediada por CRISPR, células fluorescentes podem ser isoladas por classificação FACS para isolamento e sequenciamento de DNA.Isso nos permite quantificar a frequência de alelos-alvo, rastrear as comunicações únicas entre as amostras para acompanhar a evolução coronal in vivo do tumor primário e da metástase em ambiente imunocompetente.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Aprenda a criar modelos de camundongos com edição genômica CRISPR no oviduto usando microinjeção e eletroporação in vivo. Este método flexível permite estudar a iniciação do câncer em ambiente imunocompetente.

Modelos de camundongos com engenharia genômica somática usando microinjeção e eletroporação in vivo

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