Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

As técnicas aqui apresentadas são úteis para investigar a comunidade de fungos endofíticos associados a diferentes órgãos vegetais. O isolamento de fungos endofíticos permite sua identificação, sendo valioso em outras técnicas como a germinação simbiótica. Para começar, prepare pratos de Petri de meio de cultura PDA de oito a 10 centímetros suplementados com três mililitros por litro de antibiótico.

Verifique se há contaminação incubando as placas de Petri do meio de cultura a 36 graus Celsius por 24 horas antes do uso. No dia seguinte, desinfrenda superficialmente fragmentos de plantas micoheterotróficas saudáveis usando um procedimento padrão e coloque-os em uma placa de Petri estéril. Para avaliar a eficácia da desinfestação superficial das amostras, inocular algumas gotas de água destilada utilizadas durante a última lavagem das amostras em PCA.

Em seguida, com bisturi flamejado e pinças, seccione as amostras em pedaços de 0,2 centímetro de espessura. Separar as amostras para amplificar a área de superfície a ser colocada em contato com o meio. Coloque cinco fragmentos dos órgãos subterrâneos na placa de PDA suplementada com antibiótico o mais afastado possível sem tocar nas bordas da placa.

Sele as placas de Petri com película aderente e guarde-as no escuro a 25 a 27 graus Celsius por cinco dias. Um dia antes de subcultivar, prepare placas de Petri de cinco centímetros usando cinco a sete gramas por litro de meio AA e incube as placas a 36 graus Celsius por 24 horas. Para purificar isolados fúngicos, diferenciar as colônias de placas de PDA quanto à cor, padrão de crescimento, textura e formato da margem.

Em seguida, delimite as margens da colônia no lado inferior do prato. Identifique também as colônias com um código. Usando a ponta de um palito de madeira autoclavado, recupere uma pequena quantidade de micélio das margens da colônia fúngica identificada e estrie a placa AA, produzindo três estrias a um centímetro uma da outra e das bordas da placa.

Rotule a placa AA com o código apropriado usando papel adesivo e lápis. Sele as placas antes de incubá-las no escuro a 25 a 27 graus Celsius por três dias. Após a incubação, observe meticulosamente as placas para identificar hifas finas formando colônias individuais.

Delimitar a área das colônias individuais usando um marcador permanente. Cortar uma porção do meio contendo a colônia usando um palito autoclavado e transferir o volume de corte para o centro de uma nova placa de Petri PDA sem antibióticos. Depois de rotular as placas de Petri com os códigos dos isolados, lacre-as com película aderente e mantenha-as no escuro a 25 a 27 graus Celsius por sete a 14 dias.

Para iniciar a preservação dos isolados fúngicos pelo método de Castellani, adicione 0,5 mililitros de água destilada ao tubo de microcentrífuga autoclavado de dois mililitros. Usando um palito autoclavado, cortar 0,5 por 0,5 centímetro de meio cuboide das margens do micélio de isolados purificados já cultivados. Coloque de quatro a seis cuboides nos tubos de microcentrífuga com água destilada.

Guarde os tubos no escuro a 25 graus Celsius pelo tempo que for necessário. Quando necessário, recupere um cuboide e coloque-o no centro de uma nova placa de PDA para cultivar um isolado armazenado. Comece o método de montagem de provocação colocando uma gota de uma mancha azul de Toluidina em uma lâmina de vidro limpa.

Diferentes colorações podem ser utilizadas nesta técnica. Usando um palito autoclavado, remova cuidadosamente algumas hifas do isolado crescido e coloque-as na gota de mancha. Coloque uma tampa e analise-a sob um microscópio de luz.

Para o método de montagem da fita adesiva, coloque uma gota de uma mancha azul de algodão lactofenol em uma lâmina de vidro limpa. Corte uma tira de fita adesiva transparente em um tamanho que se encaixe bem na lâmina de vidro e a mancha central caia bem. Direcione a superfície pegajosa da tira adesiva para a superfície do micélio e tente coletar algumas hifas sem pressionar ou coletar muitas delas.

Em seguida, cole a fita na lâmina de vidro, garantindo que a mancha esteja em contato com as hifas coletadas. Coloque uma gota de água acima da fita e coloque uma tampa antes de analisar a lâmina sob um microscópio de luz. O crescimento de pequenos grupos de micélios de fungos filamentosos emergindo do interior dos fragmentos foi observado após cinco dias da inoculação do fragmento de órgão micoheterotrófico da planta em meio BDA.

Durante sete a 14 dias da inoculação do isolado purificado, observou-se crescimento centrífugo de colônia de isolados fúngicos puros em PCA, formando um único micélio circular. Possíveis contaminações foram facilmente identificadas, comprometendo a homogeneidade da colônia quanto ao aspecto da forma de crescimento, cor e produção de pigmentos no meio. Uma colônia isolada das raízes fusiformes da orquídea micoheterotrófica, Wullschlaegelia aphylla, mostrou-se opaca, sem pigmentos difusíveis ou exsudatos no meio.

A colônia era esbranquiçada a cinza no lado superior e acastanhada no lado inferior. Os micélios eram aéreos e abundantes, e as margens eram irregulares e aéreas. A colônia tinha textura aveludada e topografia enrugada, sem estruturas macroscópicas.

As estruturas que não eram facilmente visíveis no micélio não corado foram exibidas após a coloração do micélio fúngico com lactofenol azul de algodão e azul de Toluidina-O, facilitando sua identificação. Os métodos de isolamento fúngico aqui apresentados também podem ser aplicados em plantas verdes para identificação dos fungos endófitos. Os fungos isolados podem ser utilizados em ensaios de germinação simbiótica.