O arranjo de anestesia seriado para a investigação de alto rendimento de agentes voláteis usando Drosophila melanogaster

O SAA permite o processamento de alto rendimento para investigar a farmacologia de agentes voláteis em organismos-modelo invertebrados que são dotados de um cérebro sofisticado e um vasto repertório de comportamentos. Em combinação com a caixa de ferramentas genéticas disponível em Drosophila melanogaster, esta técnica permite que a farmacogenética de agentes voláteis seja estudada de forma rápida e acessível. Muitas pessoas estão expostas a agentes voláteis como poluentes ou agentes terapêuticos.

Além da anestesia, os anestésicos voláteis têm inúmeros efeitos colaterais tóxicos e benéficos. O grau de efeito é parcialmente determinado pela genética, que permaneceu em grande parte inexplorada. Depois de fazer a estrutura de madeira, modifique as tampas de tubo de 50 mililitros fazendo dois furos em cada tampa com uma broca de 9/32 polegadas.

Lixe os buracos para limpar o plástico esfarrapado. Lixe também a parte superior da tampa para rugar a superfície. Em seguida, corte pipetas sorológicas de cinco mililitros para dimensionar, marcando o plástico e quebrando-o limpo na linha marcada.

Lixe as extremidades das pipetas cortadas ou quebradas. Depois, cole a rede nos tubos e corte a rede para o tamanho do tubo assim que o adesivo secar. Insira os tubos nos orifícios das tampas cônicas com ambos os tubos estendendo-se acima da tampa.

Certifique-se de que o tubo de entrada se estenda por mais tempo no tubo do que o fluxo de saída. Aplique cola na parte superior das tampas ao redor dos tubos para prender as peças e deixá-las secar. Conecte amarrações de cabos adesivos ao quadro.

Afixe as tampas no quadro usando gravatas de zíper e corte as extremidades da etiqueta de gravata zip. Corte e conecte o comprimento da tubulação tygon aos tubos de entrada e saída em cada tampa modificada. Começando na extremidade a montante, conecte a tubulação primeiro à entrada e, em seguida, da saída à entrada da posição subsequente.

Em seguida, adicione um indicador de fluxo à entrada mais downstream. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros na primeira posição e marque a marca de enchimento de água. Retire o tubo.

Encha-o com água abaixo do tubo de entrada e coloque-o novamente na posição. Prepare a interface para o vaporizador. Remova os êmbolos, corte entalhes de duas seringas dosadoras de 10 mililitros e insira-os na entrada e saída do vaporizador com os entalhes voltados diretamente para a frente do vaporizador para alinhar com os orifícios.

Conecte todo o sistema. Use tubulação tygon para conectar o tanque de gás transportador com o regulador, medidor de vazão específico de gás, vaporizador e SAA. Preencha posições vazias na matriz com tubos de crônica vazios de 50 mililitros.

Agora ligue o tanque de gasolina. Abra o medidor de vazão para dois litros por minuto e ligue o vaporizador para 0%Confirme o fluxo de gás através do sistema verificando o medidor de vazão a montante do vaporizador e o indicador de vazão a jusante da última câmara do SAA para vazão. Alternativamente, insira a extremidade da tubulação a jusante na água e procure bolhas.

24 horas ou mais antes da exposição anestésica, classificar as coortes de moscas conforme necessário para o experimento usando o método preferido. Transfira moscas de frascos de alimentos para tubos cônicos vazios de 50 mililitros. Conte e registre todas as moscas mortas antes da exposição.

Uncap e rosqueie tubos cônicos de 50 mililitros com moscas no SAA. Ligue o gás transportador e configure-o para a vazão desejada. Ajuste o vaporizador anestésico para a concentração desejada e exponha as moscas pela duração desejada.

Ao final da exposição, lave o sistema com o fluxo de gás fresco a 1,5 litros por minuto durante cinco minutos, correspondendo a aproximadamente 10x volumes do volume total de SAA. Abra completamente o regulador de alta pressão e feche-o meia volta para garantir o fluxo de gás do transportador. Siga a tubulação de cada linha até os medidores de vazão e vaporizador, e verifique o nível anestésico nos vaporizadores.

Confirme que, quando o gás flui, ele indica o fluxo no medidor de vazão e no indicador de fluxo a jusante. Ao final do experimento, aguarde de quatro a cinco minutos de fluxo aéreo para lavar o anestésico. Sete linhagens isoladas de uma única população através de reuniões de par único mostraram variação na mortalidade induzida pela toxicidade por iso flúor devido à pressão evolutiva em moscas ND23 60114.

Moscas pré-condicionadas com 15 minutos de flúor iso a 2% antes do traumatismo cranioencefálico reduziram o índice de mortalidade em 24 horas nas cepas branca 1118 e amarela/branca. O índice de mortalidade em 24 horas não foi significativamente menor nas linhagens Oregon R e Canton S pré-condicionadas. Durante a montagem, os entalhes nas seringas modificadas devem estar alinhados com os orifícios das portas do vaporizador.

Durante a exposição, verifique periodicamente se há fluxo através do sistema. Esse procedimento pode ser seguido para uma ampla variedade de estudos comportamentais, de sobrevivência e moleculares que podem levar a insights sobre a farmacologia de agentes voláteis.