O arranjo de anestesia seriado para a investigação de alto rendimento de agentes voláteis usando Drosophila melanogaster
February 24th, 2023
A mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) é amplamente utilizada para pesquisas biológicas e toxicológicas. Para expandir a utilidade das moscas, desenvolvemos um instrumento, o serial anesthesia array, que expõe simultaneamente múltiplas amostras de moscas a anestésicos gerais voláteis (AGV), tornando possível investigar os efeitos colaterais (tóxicos e protetores) dos AGVs.
O SAA permite o processamento de alto rendimento para investigar a farmacologia de agentes voláteis em organismos-modelo invertebrados que são dotados de um cérebro sofisticado e um vasto repertório de comportamentos. Em combinação com a caixa de ferramentas genéticas disponível em Drosophila melanogaster, esta técnica permite que a farmacogenética de agentes voláteis seja estudada de forma rápida e acessível. Muitas pessoas estão expostas a agentes voláteis como poluentes ou agentes terapêuticos.
Além da anestesia, os anestésicos voláteis têm inúmeros efeitos colaterais tóxicos e benéficos. O grau de efeito é parcialmente determinado pela genética, que permaneceu em grande parte inexplorada. Depois de fazer a estrutura de madeira, modifique as tampas de tubo de 50 mililitros fazendo dois furos em cada tampa com uma broca de 9/32 polegadas.
Lixe os buracos para limpar o plástico esfarrapado. Lixe também a parte superior da tampa para rugar a superfície. Em seguida, corte pipetas sorológicas de cinco mililitros para dimensionar, marcando o plástico e quebrando-o limpo na linha marcada.
Lixe as extremidades das pipetas cortadas ou quebradas. Depois, cole a rede nos tubos e corte a rede para o tamanho do tubo assim que o adesivo secar. Insira os tubos nos orifícios das tampas cônicas com ambos os tubos estendendo-se acima da tampa.
Certifique-se de que o tubo de entrada se estenda por mais tempo no tubo do que o fluxo de saída. Aplique cola na parte superior das tampas ao redor dos tubos para prender as peças e deixá-las secar. Conecte amarrações de cabos adesivos ao quadro.
Afixe as tampas no quadro usando gravatas de zíper e corte as extremidades da etiqueta de gravata zip. Corte e conecte o comprimento da tubulação tygon aos tubos de entrada e saída em cada tampa modificada. Começando na extremidade a montante, conecte a tubulação primeiro à entrada e, em seguida, da saída à entrada da posição subsequente.
Em seguida, adicione um indicador de fluxo à entrada mais downstream. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros na primeira posição e marque a marca de enchimento de água. Retire o tubo.
Encha-o com água abaixo do tubo de entrada e coloque-o novamente na posição. Prepare a interface para o vaporizador. Remova os êmbolos, corte entalhes de duas seringas dosadoras de 10 mililitros e insira-os na entrada e saída do vaporizador com os entalhes voltados diretamente para a frente do vaporizador para alinhar com os orifícios.
Conecte todo o sistema. Use tubulação tygon para conectar o tanque de gás transportador com o regulador, medidor de vazão específico de gás, vaporizador e SAA. Preencha posições vazias na matriz com tubos de crônica vazios de 50 mililitros.
Agora ligue o tanque de gasolina. Abra o medidor de vazão para dois litros por minuto e ligue o vaporizador para 0%Confirme o fluxo de gás através do sistema verificando o medidor de vazão a montante do vaporizador e o indicador de vazão a jusante da última câmara do SAA para vazão. Alternativamente, insira a extremidade da tubulação a jusante na água e procure bolhas.
24 horas ou mais antes da exposição anestésica, classificar as coortes de moscas conforme necessário para o experimento usando o método preferido. Transfira moscas de frascos de alimentos para tubos cônicos vazios de 50 mililitros. Conte e registre todas as moscas mortas antes da exposição.
Uncap e rosqueie tubos cônicos de 50 mililitros com moscas no SAA. Ligue o gás transportador e configure-o para a vazão desejada. Ajuste o vaporizador anestésico para a concentração desejada e exponha as moscas pela duração desejada.
Ao final da exposição, lave o sistema com o fluxo de gás fresco a 1,5 litros por minuto durante cinco minutos, correspondendo a aproximadamente 10x volumes do volume total de SAA. Abra completamente o regulador de alta pressão e feche-o meia volta para garantir o fluxo de gás do transportador. Siga a tubulação de cada linha até os medidores de vazão e vaporizador, e verifique o nível anestésico nos vaporizadores.
Confirme que, quando o gás flui, ele indica o fluxo no medidor de vazão e no indicador de fluxo a jusante. Ao final do experimento, aguarde de quatro a cinco minutos de fluxo aéreo para lavar o anestésico. Sete linhagens isoladas de uma única população através de reuniões de par único mostraram variação na mortalidade induzida pela toxicidade por iso flúor devido à pressão evolutiva em moscas ND23 60114.
Moscas pré-condicionadas com 15 minutos de flúor iso a 2% antes do traumatismo cranioencefálico reduziram o índice de mortalidade em 24 horas nas cepas branca 1118 e amarela/branca. O índice de mortalidade em 24 horas não foi significativamente menor nas linhagens Oregon R e Canton S pré-condicionadas. Durante a montagem, os entalhes nas seringas modificadas devem estar alinhados com os orifícios das portas do vaporizador.
Durante a exposição, verifique periodicamente se há fluxo através do sistema. Esse procedimento pode ser seguido para uma ampla variedade de estudos comportamentais, de sobrevivência e moleculares que podem levar a insights sobre a farmacologia de agentes voláteis.
Visão Geral
O array de anestesia em série (SAA) é um instrumento inovador projetado para o processamento de alto rendimento de Drosophila melanogaster para estudar a farmacologia de anestésicos gerais voláteis (VGAs). Este método permite que os pesquisadores explorem os efeitos tóxicos e protetores dos VGAs em moscas-das-frutas, aproveitando sua diversidade genética.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Farmacologia
- Toxicologia
Fundamentos
- Drosophila melanogaster é um organismo modelo amplamente utilizado na pesquisa biológica.
- Os VGAs têm vários efeitos colaterais que são influenciados pela genética.
- O SAA facilita a exposição simultânea de múltiplas amostras a VGAs.
- Compreender os efeitos dos VGAs pode informar sobre suas implicações terapêuticas e toxicológicas.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método para investigação de alto rendimento de VGAs em moscas-das-frutas.
- Explorar a base genética das respostas aos VGAs.
- Avaliar os efeitos tóxicos e protetores dos VGAs em Drosophila.
Métodos Utilizados
- Construção do SAA usando tampas de tubos cronológicos de 50 mililitros modificados e pipetas serológicas.
- Configuração de um sistema de fluxo de gás para entregar VGAs às amostras de moscas.
- Exposição de Drosophila aos VGAs sob condições controladas.
- Monitoramento da mortalidade e respostas comportamentais das moscas pós-exposição.
Principais Resultados
- Observou-se variação na mortalidade induzida pela toxicidade do iso fluor em diferentes linhagens de moscas.
- O pré-condicionamento com iso fluor reduziu a mortalidade em certas linhagens.
- O método SAA permite testes eficientes e reproduzíveis de VGAs.
- As percepções obtidas podem levar a uma melhor compreensão da farmacologia dos agentes voláteis.
Conclusões
- O SAA é uma ferramenta eficaz para estudar os efeitos dos VGAs em Drosophila.
- Fatores genéticos desempenham um papel significativo na resposta aos VGAs.
- Esta pesquisa pode ter implicações para a compreensão dos efeitos dos VGAs em contextos biológicos mais amplos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
The Serial Anesthesia Array (SAA) enables high-throughput, quantitative investigation of volatile general anesthetics (VGAs) in Drosophila, supporting rapid pharmacogenetic and mechanistic de-risking in early discovery. By allowing simultaneous, controlled exposure of multiple genotypes or biological variables, the SAA advances predictive confidence in target validation and portfolio triage for neuropharmacology and toxicology pipelines. This platform addresses the need for scalable, reproducible systems to interrogate genetic and environmental determinants of drug response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of genetic determinants influencing VGA response in a controlled in vivo system.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying pharmacodynamic and pharmacogenetic interactions across diverse fly models.
- Facilitates functional target validation through reproducible, parallelized exposure and outcome measurement.
- Improves predictive confidence for advancing neuroactive compound programs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, scalable biological systems for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Standardizes exposure conditions and quantitative outputs across multiple cohorts and genotypes.
- Enables reproducible, high-throughput assessment of behavioral, survival, and molecular endpoints.
- Supports assay readiness for evaluating compound efficacy and toxicity in genetically tractable models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical model systems with disease-relevant genetic and environmental variables.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of neuropharmacological hypotheses.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, comparative data across genotypes and conditions.
- Supports translational biomarker exploration in neuroinflammation and injury models.
Pipeline & Workflow Integration
The SAA integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing and target validation through lead identification and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of VGA effects and genetic modifiers in a scalable in vivo system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for cross-cohort comparison and compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical analysis of mortality, behavioral, and molecular endpoints to inform decision-making.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by modeling disease-relevant genetic and injury variables.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, modular platform adaptable to diverse pharmacological and genetic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroactive compound development.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput for pharmacogenetic and toxicological studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, comparative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuropharmacology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, behavioral assays, and pharmacology.
- Needs access to vaporizer instrumentation, gas flow control, and analytical infrastructure for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of exposure protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various genotypes, biological variables, and experimental endpoints.
- Practical limitations include scalability to other model organisms and translation to mammalian systems.
